Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Этиология и патогенез атопического дерматита 11
1.2. Гены предрасположенности к атопическому дерматиту
1.2.1 Гены цитокинов 21
1.2.2 Гены, участвующие в формировании эпидермального барьера 27
1.2.3 Гены образ-распознающих рецепторов 32
1.3. Межгенные и ген-средовые взаимодействия 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1.Материалы исследования 41
2.2.Методы исследования 42
2.2.1. Выделение геномной ДНК 42
2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 43
2.2.3. Рестрикционный анализ 43
2.2.4. Метод электрофореза 44
2.2.5. SSCP-анализ 44
2.2.6. Генотипирование полиморфных локусов с использованием системы OpenArray SNP Genotyping System 46
2.2.7. Статистическая обработка полученных результатов 50
Глава 3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Анализ мутаций и полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании эпидермального барьера, у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 54
3.1.1. Анализ мутаций в гене филаггрина у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 54
3.1.2. Мета-анализ результатов исследования мутаций гена филаггрина 66
3.1.3. Анализ полиморфных вариантов гена SPINK5 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 67
3.2.Исследование полиморфных локусов генов образ-распознающих рецепторов и генов CI lor/30 и LRRC32 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 75
3.2.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов и генов CI lor/ЗО и LRRC32 с развитием атопического дерматита 75
3.2.2. Анализ ассоциации гаплотипов полиморфных локусов генов образ-распознающих рецепторов, локализованных в области 4р14, с атопическим дерматитом 87
3.2.3. Мета-анализ результатов исследования полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов и генов С1 lor/ЗО и LRRC32 89
3.3.Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов цитокинов с атопическим дерматитом в Республике Башкортостан 94
3.3.1. Анализ полиморфного локуса rs2243250 гена IL4 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 94
3.3.2. Анализ полиморфного локуса rsl800872 гена 1Ы0 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 98
3.3.3. Анализ полиморфного локуса rs20541 гена IL13 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 103
3.3.4. Анализ полиморфного локуса rsl805010 гена IL4R у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 106
3.3.5. Анализ полиморфного локуса rs 17809012 гена ССЫ1 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 110
3.3.6. Анализ полиморфного локуса rsl800629 гена TNFA у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 114
3.4.Анализ полиморфных локусов, выявленных при полногеномных исследованиях, у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе 118
3.5.Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к атопическому дерматиту 128
Заключение 135
Выводы 144
Список сокращений и условных обозначений 145
Список литературы
- Гены, участвующие в формировании эпидермального барьера
- Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
- Анализ полиморфных вариантов гена SPINK5 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе
- Анализ полиморфного локуса rs2243250 гена IL4 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Атопический дерматит (АД) - хроническое рецидивирующее воспалительное заболевание кожи аллергической природы, для которого характерна возрастная особенность локализации, интенсивный зуд и гиперчувствительность к аллергенам и неспецифическим раздражителям (Odhiambo et al., 2009). В течение последних десятилетий заболеваемость АД существенно выросла, и в настоящее время распространенность его составляет в среднем 10-20% (Odhiambo et al., 2009, Pawankar et al., 2011). Заболевание чаще встречается у детей и, как правило, проявляется в возрасте до 1 года. У большинства больных атопический дерматит является первым проявлением аллергии, на фоне которого в дальнейшей жизни могут развиться бронхиальная астма и аллергический ринит (Spergel, Paller, 2003). АД может продолжаться и в зрелом возрасте, существенно ухудшая качество жизни больных (Beattie et al., 2006).
АД имеет многофакторную природу и развивается при взаимодействии таких эндогенных факторов, как генетическая предрасположенность и атопия, с различными аллергенными и неаллергенными факторами внешней среды (Schultz Larsen, 1993; Bisgaard et al., 2008). Молекулярно-генетические исследования АД с использованием современных методов и подходов значительно расширили знания о генетических факторах, способствующих формированию наследственной предрасположенности к данному заболеванию. Проведено множество ассоциативных исследований полиморфных локусов генов-кандидатов АД, которые показали, что в этиопатогенезе заболевания активное участие принимают гены, вовлеченные в атопический иммунный ответ организма - гены интерлейкинов IL4, IL10, IL13, IL18, IL25, IL33, тимусного стромального лимфопоэтина TSLP; в регуляцию барьерной функции эпителия - гены филаггрина FLG и ингибитора сериновых протеаз SPINK5; в распознавание консервативных структур микроорганизмов - гены образ-распознающих рецепторов (TLR1, TLR2, TLR6, TLR9, TLR10, NODI, NOD2) и др. (Kawashima et al., 1998; Chavanas et al., 2000; Tsunemi et al., 2002; Ahmad-Nejad et al., 2004; Hosomi et al., 2004; Palmer et al., 2006; Sohn et al., 2007; Barnes K.C., 2010; Gao et al., 2010; Qian et al., 2010; Bussmann С et al., 2011; Behniafard et al., 2012). Показано, что важный вклад в развитие этого заболевания вносят различные взаимодействия генов между собой и с факторами окружающей среды (Cramer et al., 2010; Lesiak et al., 2011; Namkung et al., 2011; Deleuran et al., 2012). В результате полногеномных анализов сцепления выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АД (lq21, 3q21, Зр24-22, 17q25) (Lee et al., 2000; Cookson et al., 2001; Bradley et al., 2002), идентифицирован позиционно-клонированный ген АД, кодирующий эпидермальный коллаген COL29A1 (3q22.1) (Soderhall et al., 2007). Полногеномные
анализы ассоциации АД позволили определить полиморфные локусы, ассоциированные с данным заболеванием и локализованные в областях llql3.5 (гены CI lor/30, LRRC32) (Esparza-Gordillo et al., 2009); llql3.1 (ген OVOL1 - человеческий гомолог гена ovo дрозофилы), 19р13.2 (ген актин-подобного белка 9 - ACTL9) и 5q31.1 (ген белка ЗА семейства кинезинов - KIF3A) (Paternoster et al., 2011; Hirota et al., 2012).
В России генетические исследования атопического дерматита единичны (Саликова и др., 2010; Тюменцева и др., 2011; Фрейдин и др., 2011; Карунас А.С. и др., 2012), а комплексное изучение роли генов цитокинов, образ-распознающих рецепторов и белков, ответственных за формирование и поддержание барьерной функции эпидермиса, в развитии АД ранее не проводилось. В связи с этим актуальным является углубленное молекулярно-генетическое исследование этой многофакторной патологии, которое позволит подробно охарактеризовать генетическую основу предрасположенности к АД, достоверно оценить роль исследуемых генов в развитии этого заболевания, что может послужить основой для разработки способов его прогнозирования и подходов ДНК-диагностики.
В связи с вышеизложенным, были определены цели и задачи настоящего исследования.
Цель работы - анализ роли полиморфных вариантов и мутаций генов-кандидатов в развитии атопического дерматита в Республике Башкортостан.
Задачи исследования:
-
Провести анализ мутаций и полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании эпидермального барьера - филаггрина FLG и ингибитора сериновых протеаз SPINK5, у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.
-
Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.
-
Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов - интерлейкина 4 (IL4), а-цепи рецептора интерлейкина 4 (IL4R), интерлейкина 13 (IL13), интерлейкина 10 (IL10), фактора некроза опухоли (TNFA) и эотаксина (CCL11), у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.
-
Провести исследование полиморфных локусов, ассоциированных с атопическим дерматитом по данным полногеномных анализов и локализованных в областях 5q31.1 (renKIF3A), llql3.1 (OVOL1), llql3.5 (Cllorf30 nLRRC32), 19pl3.2 (ACTL9), у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.
-
Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов с развитием атопического дерматита у индивидов различной этнической принадлежности.
-
Провести исследование ген-генных взаимодействий, предрасполагающих к развитию атопического дерматита.
Научная новизна исследования. Впервые определены частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, TLR10, NODI, NOD2, CD14 у больных атоническим дерматитом и здоровых индивидов русской, татарской и смешанной этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан. Установлены частоты мутаций c.2282del4, p.Arg501X и p.Arg2447X в гене филаггрина у больных АД и индивидов контрольной группы. С целью репликации результатов полногеномных анализов ассоциации атопического дерматита проведено исследование полиморфных локусов генов, локализованных в областях 5q31.1 (KIF3A), llql3.1 (OVOL1), llql3.5 (Cllorf30 и LRRC32) и 19pl3.2 (ACTL9), у больных АД и в контрольной группе индивидов из РБ. Выявлены генетические маркеры риска развития заболевания с учетом этнической принадлежности индивидов. Установлены модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, филаггрина, ингибитора сериновых протеаз, генов образ-распознающих рецепторов и генов, ассоциированных с развитием АД по данным полногеномного анализа, предрасполагающие к развитию АД у русских и татар.
Научно-практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к атопическому дерматиту. Идентификация мутаций в генах белков, ответственных за формирование и поддержание эпидермального барьера организма, позволяет установить точную молекулярно-генетическую природу АД и подобрать эффективные методы его лечения. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Конгрессах Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии ЕААСІ Congress (Стамбул, 2011; Женева, 2012; Милан, 2013), Конференциях Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2011; Нюрнберг, 2012; Париж, 2013), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Курск, 2011), V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012), II и III Всероссийской
школы - конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 6 - статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 180 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 240 источников. Содержит 33 таблицы и 29 рисунков.
Гены, участвующие в формировании эпидермального барьера
В 2007 г. был выявлен первый позиционно-клонированный ген АД - ген COL29A1, локализованный на хромосоме 3q21 и кодирующий эпидермальный коллаген (Soderhall et al., 2007). Коллагены имеют ключевое значение в поддержании тканевой целостности. Предполагается, что коллаген COL29A1 играет важную роль в когезии кератиноцитов. Его недостаток, по-видимому, способствует облегченному проникновению антигена через кожу, что могло бы объяснить ассоциацию полиморфных вариантов гена COL29A1 с аллергической сенсибилизацией, распространенной у больных АД (Leung et al., 2004).
На сегодняшний день проведен ряд полногеномных анализов ассоциации АД. Первое исследование, проведенное в 2008 г. в немецкой популяции, выявило ассоциацию заболевания с полиморфным локусом rs7927894 (g.76301316C T), расположенным на хромосоме llql3.5 между генами CI lor/30 (chromosome 11 open reading frame 30) и LRRC32 (leucine-rich repeat-containing protein 32). Было обнаружено, что около 13% индивидов европейского происхождения являются носителями рискового аллеля по этому полиморфному варианту. Ген С11ог/30 кодирует ядерный белок EMSY, который участвует в регуляции противовирусного иммунитета, связываясь с промоторными областями стимулируемых интерфероном генов (ISGs) и действуя как репрессор транскрипции (Ezell et al., 2012). EMSY также вовлечен в развитие ряда воспалительных и опухолевых заболеваний (атопический дерматит, болезнь Крона, аденокарцинома), играет роль в эпителиальном иммунитете, росте и дифференциации клеток (Esparza-Gordillo et al., 2009). Ген LRRC32 кодирует белок, содержащий лейцин-богатые повторы LRRC32. Данный белок является поверхностным клеточным рецептором латентного трансформирующего фактора роста бета (TGF-J3) и участвует в развитии регуляторных Т-клеток и активации TGF-p, многофункционального цитокина с иммунорегуляторными свойствами (Wang et al., 2012; Zhou et al., 2013). Вышеописанное полногеномное исследование также выявило 2 однонуклеотидных полиморфизма (ОНП), значительно ассоциированных с АД: rs877776 (g.l52178018C G), локализованный в области lq21 ниже гена HRNR (hornerin), и rs7024096 (g.22399693T C), расположенный в хромосомной области 9р21 (Esparza-Gordillo et al., 2009).
Второй полногеномный анализ ассоциации, проведенный в китайской популяции, выявил 2 новых локуса АД: rs7701890 (с.1703+5468Т С), локализованный на хромосоме 5q22.1 в гене TMEM232-SLC25A46 (transmembrane protein 232), и rs6010620, расположенного в области 20ql3.33 между генами TNFRSF6B (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6B) и ZGPAT (zinc finger CCCHype with G patch domain-containing protein). В данной работе также была подтверждена ассоциация заболевания в изученной популяции с ОНП rs3126085 (g.l863C T), локализованным в промоторе гена FLG. Полиморфный локус rs6010620 был ассоциирован с АД и при репликативном исследовании на расширенной выборке больных европейского происхождения (Sun et al., 2011).
В 2012 г. был проведен полногеномный мета-анализ АД у индивидов европейского происхождения (Paternoster et al., 2011). Данное исследование подтвердило ассоциацию с развитием заболевания ОНП, обнаруженных в предыдущих полногеномных анализах: rs7927894 гена Cllorf30 и rs6010620 между генами TNFRSF6B и ZGPAT. Кроме того, в данной работе выявлены новые локусы, ассоциированные с развитием АД: rs2897442 (с. 1130-2278G А) гена KIF3A, rs479844 (g. 10857752A G) гена OVOL1 и rs2164983 (g.52183C A), локализованный выше области гена ACTL9 (Paternoster et al., 2011). Белок KIF3A (kinesin family member ЗА, белок ЗА семейства кинезинов) необходим для образования жгутиков клетки и отвечает за транспорт белков и органелл. У условно нокаутных по данному гену мышей наблюдается утончение и повреждение эпидермиса (Ezratty et al., 2011). Актин-подобный белок ACTL9 также играет роль в различных клеточных процессах, таких как транспорт органелл, ремоделирование хроматина и др., и вместе с продуктом гена OVOL1 (putative transcription factor Ovo-like 1) участвует в пролиферации и дифференциации клеток эпидермиса (Paternoster et al., 2011).
В результате полногеномного анализа, проведенного в японской популяции, было обнаружено 8 новых полиморфных вариантов, ассоциированных с АД: rsl3015714 гена IL18R1, rsl76095 (с.-627Г С) гена GPSM3 (G-protein signaling modulator 3), rs878860 гена OR10A3 (olfactory receptor 10A3), rs6780220 (C.1068+412T G) гена GLB1 (beta-galactosidase 1), rs 12634229, локализованный в области 3ql3.2, rs4722404 (7p22), rsl0995251 гена ZNF365 (zinc finger protein 652), rsl6999165 (20ql3) (Hirota et al., 2012). Кроме того, в исследованной популяции была подтверждена ассоциация с развитием заболевания ОНП генов FLG, CI lor/30, TMEM232-SLC25A46, TNFRSF6B-ZGPAT, OVOL1, ACTL9 и KIF3A-IL13, выявленная в предыдущих полногеномных анализах (Hirota et al., 2012).
В ходе полногеномного исследования, проведенного Weidinger с коллегами, были изучены выборки больных АД из Великобритании, Ирландии и Германии с учетом наличия и отсутствия у них сопутствующей БА (Weidinger et al., 2013). Ассоциация с АД (независимо от БА) была выявлена со следующими ОНП: rsll205006 в области lq21 в гене FLG, rsl469621 в области 2q22 в гене THSD7B (thrombospondin, type I, domain containing 7B), rs2158177 гена IL13 в области 5q31, rs6474 (p.Argl03Lys) на хромосоме 6p21 в гене CYP21A2 (cytochrome P450, family 21, subfamily a, polypeptide 2) и rs2155219 в гене LRRC32. Ассоциация с АД полиморфного локуса гена FLG лишний раз подтверждает значение данного гена в развитии заболевания. Надо отметить, что ассоциация заболевания с ОНП на первой и пятой хромосомах достигла наибольшего уровня статистической значимости в группе больных АД с сопутствующей БА, а с ОНП 6-й хромосомы - в группе больных АД без БА. При репликативном исследовании, выполненном на расширенной выборке больных европеоидного происхождения, ассоциация с развитием заболевания подтвердилась для ОНП rs2158177 в гене IL13 и rs2155219 в гене LRRC32 (Weidinger et al., 2013).
Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
Амплификацию полиморфных локусов генов IL4, 1ЫЗ, IL4R, 1Ы0, TNFA, CCL11, SPINK5 и мутаций в гене FLG проводили с помощью метода полимеразнои цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторах «Терцик» производства компании «ДНК-технология» (Россия), «Mastercycler» компании «Eppendorf» (Германия) и ТІ00 компании «Bio-Rad» (США).
Перечень исследованных локусов, последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в таблице 3. Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл 1 OxTaq-буфера (67 мМ трис-НС1 (рН 8,8), 16,6 мМ (NHtb S04, 2,5мМ MgCl2, 0,01% Tween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Thermus aquaticus (Силекс, Россия) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Режим амплификации был следующим: предварительная денатурация (94 С, 4 мин.), 27-30 циклов амплификации: денатурация - 94С, 45 сек.; отжиг - tC, 45 сек.; синтез - 72С, 45 сек., завершающий синтез (72С, 7-10 мин.). В табл. 2.1 представлен перечень исследуемых локусов, последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов.
Анализ полиморфных вариантов генов KIF3A, OVOL1 YLACTL9 проводился с использованием набора реагентов для амплификации ДНК методом полимеразнои цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией (FLASH/RTAS) (ООО «ТестГен», Москва) согласно протоколу фирмы-производителя с помощью системы детекции продуктов ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad).
Для определения нуклеотидных замен проводили гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей рестриктазой. Данные о рестрикционных локусах, названия рестриктаз и длины продуктов расщепления представлены в таблице 3. Рестрикцию полиморфных локусов IL4 (rs2243250), IL4R (rsl805010), TNFA (rsl800629), IL10 (rs 1800872), IL13 (rs20541), CCL11 (rs 17809012), FLG (c.2282del4), FLG (p.Arg501X), FLG (p.Arg2447X) проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции Avail, SmimI, Ncol, Rsal, BspLI, TaqI, Styl, PshBI, Hinfl, Adel, Nlalll (Fermentas, Латвия) при условиях и температуре, рекомендуемых фирмой - производителем.
Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ) (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида - 29:1). Электрофорез проводили в 1НТБЕ буфере (0,089 М трис-НС1; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0) при напряжении 300В. Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15% фиколла. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Документирование результатов электрофореза проводили с использованием видеосистемы (Geldokulant, Франция).
Исследование образцов ДНК на наличие мутаций в гене FLG проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP), основанным на различной электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК, различающихся вследствие нуклеотидных замен по конформации молекул, в неденатурирующем полиакриламидном геле (Orita М. et al., 1989).
Исследование 62 полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов и генов СI lor/30 и LRRC32 проводилось с использованием TaqMan технологии на OpenArray SNP Genotyping System (BioTrove, Woburn, Massachusetts). Список проанализированных полиморфных локусов приведен в таблице 4. Подбор ОНП для исследования осуществлялся с помощью программы SNPbrowser (Applied Biosystems, USA). Для наиболее оптимального покрытия генов (оптимальное число маркерных полиморфных локусов в гене, которое необходимо исследовать, чтобы охватить весь ген), отбирались таговые (маркерные) ОНП в регионах с высоким неравновесием по сцеплению из 5 -области, экзонов, интронов и З -области каждого гена.
Реакционная смесь (TaqMan OpenArray Genotyping MasterMix, Applied Biosystems, USA) объемом 2,5 мкл смешивалась с 2,5 мкл образцов ДНК с концентрацией 50 нг/мкл в 384-луночном планшете. Таблица 4 Исследованные однонуклеотидные полиморфные варианты генов образ распознающих рецепторов и генов С11ог/30 и LRRC №rs Полиморфный вариант Ген Хромосомная 1область локализации
Анализ полиморфных вариантов гена SPINK5 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе
Распределение частот аллелей полиморфных вариантов гена TLR2 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе индивидов татарской этнической принадлежности: А - rsl816702, Б - rs4696483. У татар, больных АД, аллель rsl816702 C встречался с частотой 91,8%, тогда как в соответствующей группе контроля частота его была ниже и составляла 83,33% (р=0,0406, OR=2,24 (95%С1 1,02-4,92)). Частота аллеля С полиморфного варианта rs4696483 того же гена была также выше в группе больных АД (91,67%), чем в контроле (82,14%) (р=0,0249, OR=2,39 (95%С1 1,1-5,21)). При введении поправки на множественность FDR, обнаруженные различия между группами сравнения татарской этнической принадлежности не достигли уровня статистической значимости.
Ассоциация полиморфных локусов гена TLR2 с развитием аллергических заболеваний, в частности АД и БА, была ранее обнаружена в других исследованиях. Так, было показало, что полиморфные варианты rs5743708 (p.Arg753Gln) и rs4696480 (с.-16934А Т) данного гена ассоциированы с тяжелым течением АД в Германии и Польше (Ahmad-Nejad et al., 2004; Oh et al., 2009; Potaczeket al., 2011). Полиморфный локус rs4696480, кроме того, ассоциирован с развитием астмы и атопии (Eder et al., 2004). Результаты других работ также свидетельствуют о значении изменений нуклеотидной последовательности гена TLR2 в развитии БА и АР в различных популяциях (Smit et al., 2009; Qian et al., 2010).
Проведенный нами анализ полиморфных вариантов генов Toll-подобных рецепторов TLR4, TLR5 и TLR9 не выявил статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов между исследованными выборками больных АД и контроля. По данным литературы, в некоторых популяциях выявлена ассоциация ОНП генов TLR4 и TLR9 с развитием аллергических заболеваний. Так, в Швеции и Египте обнаружена ассоциация ОНП rs4986790 (p.Asp299Gly) гена TLR4 с развитием БА (Fageras Bottcher et al., 2004; Hussein et al., 2012); у индивидов немецкого происхождения ОНП rsl87084 гена TLR9 ассоциирован с развитием БА (Kormann et al., 2008), a rs5743836 данного гена - с развитием АД и БА (Novak et al., 2007).
В ходе данной работы нами также был выполнен анализ ассоциации АД с полиморфными вариантами генов NOD-подобных рецепторов: NOD1, локализованного на хромосоме 7р15-р14, и NOD2, расположенного в области 16ql2. Данные рецепторы взаимодействуют с пептидогликанами бактериальных стенок и запускают воспалительную реакцию посредством активации транскрипционного фактора NF-кВ (Girardin et al., 2003). Анализ ОНП данных генов не выявил статистически значимых различий между больными АД и контрольной группой. В исследованиях, проведенных в Германии и Нидерландах, было показано, что полиморфные варианты гена NOD1 ассоциированы с АД, БА и повышенным уровнем общего IgE (Weidinger et al., 2005b; Eder et al., 2006; Reijmerink et al., 2010), ОНП гена NOD2 - с развитием БА и атопии (Kabesch et al., 2003; Tantisira et al., 2004; Reijmerink et al, 2010).
Нами было проведено исследование полиморфных вариантов гена CD14, локализованного в области 5q31.3. CD14 кодирует рецептор липополисахаридов и пептидогликанов. Взаимодействие CD 14 с лигандами приводит к активации экспрессии генов провоспалительных цитокинов. Анализ ОНП rsll574651 (g.8018C T), rs2228049 (c.610A G, p.Asn204Asp), rs2569190 (c.-159C T) и rs2569191 (c.-1247G A) гена CD14 ассоциации с развитием АД в исследуемых в нашей работе выборках не обнаружил. По данным литературы, в разных популяциях выявлена ассоциация полиморфных вариантов гена CD14 с различными аллергическими заболеваниями. Так, ОНП rs2569193 (g.2792C T) и rs2569190 ассоциированы с развитием АД в США (Litonjua et al., 2005). Кроме того, полиморфный локус rs2569190 ассоциирован с БА, атопией и пищевой аллергией в США (Woo et al., 2003; Wang et al., 2013), с БА во Франции (Smi et al., 2009), Индии (Sharma et al., 2004), а также с повышенным уровнем IgE и с БА в Нидерландах (Koppelman et al., 2001).
Проведенный нами анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов CI lor/ЗО и LRRC32, локализованных в области 1Ц13.5, не выявил статистически значимых различий между группами больных АД и контроля различной этнической принадлежности. По данным литературы, ассоциация ОНП данной области с развитием АД и других аллергических заболеваний обнаружена при полногеномных и репликативных исследованиях у немцев, ирландцев и японцев (Esparza-Gordillo et al., 2009; O Regan et al., 2010; Ramasamy et al., 2011; Li et al., 2012; Hirota et al., 2012).
Анализ полиморфного локуса rs2243250 гена IL4 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе
В ходе мета-анализа полногеномных исследований ассоциации АД, проведенного в 2011 г. у индивидов европеоидного происхождения, было выявлено три новых локуса, ассоциированных с данным заболеванием: rs2897442 (c.H30-2278G A) гена KIF3A, rs479844 (g.W857752A G) гена OVOLl и rs2164983 (g.52183C A), расположенный выше области гена ACTL9. Ген KIF3A (kinesin family member ЗА) локализован в кластере генов цитокинов на хромосоме 5q31.1, а гены OVOLl (putative transcription factor Ovo-like 1) и ACTL9 (actin-like 9) участвуют в пролиферации и дифференциации клеток эпидермиса (Paternoster et al., 2011). Ассоциация АД с данными ОНИ была подтверждена и в следующем полногеномном анализе, проведенном у японцев (Hirota et al., 2012). С целью репликации полученных при полногеномных исследованиях результатов нами был проведен анализ данных полиморфных локусов в группах больных АД и контрольных индивидов из РБ.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов данных полиморфных локусов между контрольными группами русских и татар выявил межэтнические различия по частотам аллелей и генотипов ОНП rs2897442 в гене KIF3A. Было обнаружено, что у русских достоверно чаще, чем у татар, встречался аллель rs2897442 T (р=0,0133). Кроме того, у русских с большей частотой определен генотип rs2897442 C/C (р=0,0281).
Анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов ОНП rs2897442 в гене KIF3A у больных АД и в контроле не выявил между ними существенных различий. Частота аллеля rs2897442 T у больных русской этнической принадлежности составила 68,15%, в контроле - 66,07%. Генотип rs2897442 T/T встречался у больных незначительно чаще, чем в контроле - в 44,64% и 41,96% случаев, соответственно. Частоты генотипа rs289 7442 С/С также практически не различались и составили 8,33% у больных АД и 9,82% в контроле (Таблица 27).
Статистически значимых различий не обнаружено также при сравнении групп больных АД и контроля татарской этнической принадлежности. Аллель rs2897442 Т встречался у больных с частотой 57,38% по сравнению с 53,33% в контроле. Генотип rs2897442 C/C определялся с более высокой частотой в группе контроля, чем у больных (21,33% и 13,93%, соответственно). Частота генотипа гв2897442 Т/Тв выборке больных составила 28,69%) и практически не отличалась от таковой в контроле — 28,0% (Таблица 28).
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs2897442 гена KIF3A у больных АД и здоровых индивидов русской этнической принадлежности Генотип, аллель Общая группа больных АД Больные АД с сопутствующими A3 Больные АД без сопутствующих A3 Больные со средне-тяжелой формой АД Больные тяжелой формой АД Контроль
В ходе исследования нами также был проведен анализ ассоциации полиморфного локуса rs2897442 с тяжестью течения АД, однако статистически значимых различий выявлено не было.
Анализ частот ОНП rs2897442 у больных АД с сопутствующими A3 и без них и в контрольных группах не выявил статистически значимых различий ни у русских, ни у татар.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs479844 (g.l0857752A G), локализованного в промоторе гена OVOL1, между контрольными группами русских и татар не выявил межэтнических различий.
У больных АД русской этнической принадлежности аллель rs479844 C встречался практически с той же частотой, что и в контрольной группе - 59,93% и 58,04%, соответственно. Частота генотипа rs479844 C/C была выше у больных (35,12%), чем в группе контроля - 30,36%. Генотип rs479844T/T также чаще определялся в выборке больных АД - в 17,26% случаев, по сравнению с 14,29% в контроле. Выявленные в данных группах различия не имели статистической значимости (Таблица 29).
Достоверных различий не обнаружено и при сравнении групп больных АД и контрольных индивидов татарской этнической принадлежности. Частота аллеля rs479844 T составила 50,0% у больных и 50,67% в контроле. Генотип rs479844 T/T в группе больных был определен у 27,87% человек, а в контроле -26,67%. У больных АД и в контроле практически не различались и частоты генотипа rs479844 C/C -27,87% и 25,33%, соответственно (Таблица 30).
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов данного ОНП между группами больных АД с различной степенью тяжести и больных с наличием и отсутствием сопутствующих A3 с соответствующими контрольными группами не выявил статистически значимых различий ни у русских, ни у татар.
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs479844 гена OVOL1 у больных АД и здоровых индивидов русской этнической принадлежности Генотип, аллель Общая группа больных АД Больные АД с сопутствующими A3 Больные АД без сопутствующих A3 Больные со средне-тяжелой формой АД Больные тяжелой формой АД Контроль
