Введение к работе
. Актуальность проблемы.
На протяжении последних лет во всем мире отмечается значительный рост устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам. Возникновение антимикробной резистентности является естественным биологическим ответом на использование антибиотиков, которые создают селективное давление, способствующее отбору, выживанию и размножению резистентных штаммов микроорганизмов. Резистентность к антибиотикам имеет большое социально-экономическое значение и в развитых странах мира рассматривается как угроза национальной безопасности. Инфекции, вызванные резистентными штаммами, отличаются длительным течением, чаще требуют госпитализации и увеличивают продолжительность пребывания в стационаре, ухудшают прогноз для пациентов. При неэффективности препаратов выбора приходится использовать средства второго или третьего ряда, которые, зачастую, более дороги, менее безопасны и не всегда доступны. Все это увеличивает прямые и непрямые экономические затраты, а также повышает риск распространения резистентных штаммов в обществе [MacPherson, 2001].
За последние 5 лет более 30 млрд. долларов было потрачено мировой
фармацевтической промышленностью на разработку новых антибиотиков. Если
резистентность микроорганизмов к лекарственным средствам будет развиваться столь
быстро, большинство этих инвестиций могут быть потеряны
(). В связи с этим, активно обсуждается вопрос о создании альтернативных терапевтических средств, резистентность к которым будет развиваться ограниченно, или полностью отсутствовать. Такими средствами могут явиться антимикробные пептиды (АМП) - уникальная и чрезвычайно разнообразная группа соединений, являющаяся основным компонентом врожденного иммунитета.
Природные антимикробные пептиды являются неотъемлемой частью любого организма и выполняют роль либо «наступательного», либо «оборонительного» оружия [Diamond, 2009]. В настоящее время идентифицировано более 2 000 антимикробных пептидов, выделенных из представителей всех классов растений и животных.
Несомненными преимуществами антимикробных пептидов перед антибиотиками являются: более широкий спектр антибактериального действия, функциональная активность при наномолярных концентрациях, ограниченная возможность формирования резистентности возбудителей к антимикробным пептидам, возможность синтеза аналогов природных пептидов с измененными биологическими свойствами [Palfy, 2009]. Ограниченная возможность формирования устойчивости к АМП объясняется уникальным механизмом их действия, заключающемся в формировании мембранных каналов с последующей фрагментацией мембраны бактериальной клетки [van't Hof, 2001].
Объектом исследования стали уникальные по своей биологии внутриклеточные паразиты - микоплазмы и хламидии.
В мировой лечебной практике для терапии этих инфекций используются антибиотики широкого спектра действия (тетрациклины, макролиды, фторхинолоны), однако, их действие, вследствие быстрого приобретения резистентности к ним, в редких случаях эффективно. Кроме того, уникальные особенности взаимоотношений этих внутриклеточных паразитов с иммунной системой человека часто способствуют развитию персистенции инфекционного агента в организме.
На сегодняшний день в Российской Федерации высокая заболеваемость внутриклеточными инфекциями остается одной из актуальных проблем в области практического здравоохранения. Во многом этому способствует сложившаяся в России и странах СНГ экономическая и демографическая ситуация (снижение социально-экономического уровня населения; создание рынка интимных услуг, наличие неконтролируемых миграционных потоков населения). Особое значение имеет внутриутробное инфицирование плода этими патогенами, приводящее к различным негативным последствиям, часто несовместимым с жизнью. Неконтролируемое применение антибактериальных препаратов, фальсификация лекарственных средств, и, как следствие, эскалация антибиотикорезистентности, отсутствие отечественных разработок в области создания новых антимикробных средств наносят колоссальный экономический ущерб и создают угрозу национальной безопасности страны.
Таким образом, разработка современных высокоэффективных антихламидийных и антимикоплазменных препаратов, развитие резистентности к которым будет ограничено, является чрезвычайно актуальной задачей.
Цель работы: разработать основу для реализации генотерапевтических подходов к лечению микоплазмозов и хламидиозов с использованием генов антимикробных пептидов.
Задачи исследования:
-
Сконструировать рекомбинантные плазмидные векторы, экспрессирующие гены антимикробных пептидов - мелиттина из яда пчелы и пептидов (латарцинов и оксиопининов) из яда двух видов пауков.
-
Адаптировать систему тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов к полученным рекомбинантным плазмидным векторам.
-
Создать инфекционные модели микоплазмозов и хламидиозов у лабораторных животных.
-
Протестировать полученные рекомбинантные плазмидные векторы в культуре клеток и на моделях микоплазмозов и хламидиоза у лабораторных животных.
-
Установить основные механизмы действия АМП на развитие микоплазменной и хламидийной инфекций.
Научная новизна.
Впервые в качестве потенциальных генотерапевтических агентов для подавления инфекций, вызываемых внутриклеточными паразитами - микоплазмами и хламидиями, использованы антимикробные пептиды из яда членистоногих. Создана серия рекомбинантных плазмидных векторов, экспрессирующих гены мелиттина из яда пчелы и гены латарцинов и оксиопининов из яда паука.
Впервые для снижения цитотоксического эффекта антимикробных пептидов использована система тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов АМП.
Впервые показана возможность элиминации M.hominis и C.trachomatis из линий клеток, трансфицированных полученными рекомбинантными плазмидными векторами.
Впервые, на созданных инфекционных моделях микоплазмоза и хламидиоза человека у лабораторных мышей, а также у цыплят-бройлеров, инфицированных возбудителем микоплазмоза птиц - M.gallisepticum показано ингибирование микоплазменной и хламидийной инфекций после введения полученных рекомбинантных плазмидных векторов.
Впервые, выявлены механизмы действия АМП на внутриклеточных паразитов.
Помимо прямого бактерицидного эффекта продемонстрировано снижение
трансмембранного потенциала клеток, экспрессирующих ген мелиттина, изменение редокс-состояния клетки и нарушение внутриклеточного трафика, приводящих к нарушению цикла развития хламидий.
Практическая значимость.
Для практического использования разработана система точного регулирования экспрессии генов АМП, которая позволяет решать следующие задачи: 1) определять антимикробную активность кандидатных АМП без их химического синтеза - при клонировании кодирующих их генов в созданный универсальный плазмидныи вектор и последующей трансфекции культуры эукариотических клеток; 2) определять степень цитотоксичности кандидатных пептидов при различном уровне экспрессии кодирущих их генов.
Созданные инфекционные модели, а именно урогенитальные микоплазмоз и хламидиоз человека у лабораторных мышей, респираторный микоплазмоз у цыплят-бройлеров, могут быть использованы для тестирования новых антимикоплазменных и антихламидийных препаратов.
Результаты исследований использовались при выполнении работ в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по соглашению с Федеральным агентством по науке и инновациям № 01.168.24.016 от 26 июня 2007 г. «Разработка методов высокопроизводительного скрининга активности антимикробных пептидов как препаратов для терапии внутриклеточных инфекций», по Государственному контракту с Федеральным агентством по науке и инновациям
№02.512.11.2202 от 12 мая 2008 г. «Новые генно-инженерные лекарственные препараты на основе антимикробных пептидов для терапии внутриклеточных инфекций».
Теоретические положения и результаты диссертационной работы используются в курсах лекций по молекулярной медицине в Московском Физико-Техническом институте (Государственном университете) и Российском государственном медицинском университете им. Н.И.Пирогова. По результатам работ поданы заявки на патенты на изобретения: «Способ раздельного выделения одно- и двунитевых нуклеиновых кислот на силикатных матрицах» (№2008137197), «Способ терапии внутриклеточных инфекций с использованием прототипов генно-инженерных лекарственных препаратов на основе генов антимикробных пептидов паука Lachesana tarabaevi» (№2009136937), «Способ конденсации плазмидной ДНК для трансфекции эукариотических клеток» (№2009136936).
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены на научной конференции в рамках межлабораторного семинара отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России и на секции "Молекулярная биология" Ученого Совета ФГУП "ГосНИИ генетика".
Результаты работы были представлены на: Международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века» (Москва, 2000), 10-ом и 11-ом Международных биотехнологических симпозиумах (Берлин, 2000; Мадрид, 2001), 11-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Стамбул, 2001), 8-ом Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001), 4-ой и 5-ой Международных конференциях МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2001; Москва, 2002), Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), 14-ом Международном конгрессе общества микоплазмологов (Вена, 2002), 11-ом Европейском конгрессе по биотехнологии (Базель, 2003), Международном симпозиуме «Геномика для изучения взаимоотношений паразит-хозяин» (Хинкстон, 2006), Научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 4-ом Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 45-й Международной конференции по медицинской химии (Орлеан, 2009).
Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 34 публикациях: 23 статьях и 11 материалах российских и международных научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 56 рисунками, библиографический указатель включает 611 публикаций.
