Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Генная инженерия многоклеточных организмов является одной из областей современной биотехнологии.
Использование при создании трансгенных организмов генов маркерных
(репортёрных) белков, таких как Р-галактозидаза кишечной палочки Escherichia
' coli или зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein, GFP)
медузы Aequorea victoria, позволяет изучить эффективность генетической
N трансформации животных, установить функциональную активность различных
клонированных промоторов.
В течение многих лет эксперименты по трансгенезу насекомых проводились в основном на дрозофилах Drosophila meianogaster с помощью рекомбинантных Р-элементов - подвижных генетических структур (мобильных элементов, м. э.), обнаруженных у этого вида (Rubin et al., 1982).
Успешная генетическая трансформация насекомых, не относящихся к семейству drosophilidae, в последние годы стала возможна в результате создания учёными генных конструкций на основе м. э., обнаруженных у насекомых разных видов (Handler A.M., 2001). Подвижный элемент комнатных мух Musca domestica L. - Hermes (Warren et al., 1994) - относится к группе транспозонов, которые наиболее часто используются в качестве вектора для генетической трансформации насекомых (Handler A.M., 2001).
При проведении экспериментов по созданию трансгенных насекомых наряду с выбором генноинженерного вектора большое внимание уделяется таким генетическим маркерам, которые обеспечивают эффективный отбор трансгенных особей в потомстве микроинъецированных особей. В настоящее время наиболее эффективными прижизненными селективными маркерами являются гены флуоресцирующих белков, выделенные из медуз и кораллов, а также мутантные формы этих генов, в том числе улучшенный GFP (Enhanced GFP, EGFP) (Handler A.M., 2001).
Предварительным этапом получения трансгенных сельскохозяйственных млекопитающих (Брем и др., 1996; Эрнст Л.К., 2003, 2004) является анализ интеграции и тканеспецифической экспрессии чужеродных генов у модельных животных, в качестве которых, в основном, используют лабораторных мышей Mus Musculus L. Короткий промежуток времени, необходимый для смены генераций (65-70 дней) и высокая плодовитость мышей облегчают проведение
РОС. НАЦИОНАЛЬНА* |
СЯатаИт
амв>к
экспериментов по трансгенезу этих животных, обуславливая получение достоверных результатов.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в
создании новых моделей генетически трансформированных животных на
основе использования репортёрных генов.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
— провести трансформацию клеток зародышевого пути Musca domestica
методом микроинъекции в ранние эмбрионы рекомбинаншых Р и Hermes
мобильных генетических элементов, содержащих в качестве маркерного
гена ген бета-галактозидазы (LacZ) и ген зелёного флуоресцирующего
белка (EGFP);
~~ провести анализ генетической трансформации в первом и втором поколении комнатных мух, подвергшихся микроинъекции, по наличию экспрессии указанных репортёрных белков;
провести ПЦР-анализ ДНК комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии развития, и их потомков на наличие трансгена;
провести ПЦР-анализ ДНК лабораторных мышей, полученных в результате микроинъекции в пронуклеусы зигот генетической конструкции, содержащей ген EGFP под контролем промотора гена белка промежуточных филаментов кератина шерсти овец (К2.10), на содержание последовательностей трансгена;
провести молекулярно-генетический анализ наследования трансгена в первом и втором поколении трансгенных мышей;
— исследовать экспрессию гена EGFP в клетках коркового вещества волос у
полученных трансгенных мышей.
1.3. Научная новизна работы. В ходе выполнения диссертационной
работы впервые при проведении экспериментов по іенетической
трансформации комнатных мух с использованием гена улучшенного зелёного
флуоресцирующего белка медузы A. victoria под контролем промотора гена
hsp70 (гена белка теплового шока) Drosophila melanogaster подтверждена
возможность селекции трансгенных особей на эмбриональной стадии развития.
При проведении исследований на мышах впервые получены трансгенные особи, экспрессируюшие зелёный флуоресцирующий белок под контролем последовательности промотора, контролирующего у овец ген белка промежуточных филаментов кератина шерсти второго типа (К2.10).
f *'-., я -
I, > '
о 1» *vf .
1.4. Практическая значимость. Показана принципиальная возможность
использования гена EGFP - мутантной формы гена GFP медузы Aequorea
victoria - в качестве селективного маркера для отбора трансгенных комнатных
мух на эмбриональной стадии развития.
Определена функциональная активность последовательности промотора гена белка промежуточных филаментов второго типа (IF II) кератина шерсти овец (К2.10) длиной 735 пар нуклеотидов.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
Возможность использования репортёрного гена EGFP под контролем промотора Кег5 и промотора гена hsp70 для изучения эффективности генетической трансформации модельных животных Mus Musculus L. и Musca domestica L.
Локализация экспрессии гена EGFP в корковом веществе волос у мышей, трансгенных по Ker-EGFP.
Отклонение фактического расщепления по трансгену Ker-EGFP в первом поколении и подтверждение менделевского расщепления по тому же трансгену во втором поколении трансгенных мышей.
-
Апробация работы. Материалы диссертации были изложены на 49-й научной конференции аспирантов и молодых учёных «Достижения молодых учёных в области животноводства», проходящей 6 июля 2000 года в ВГНИИЖе; на отчётных научных конференциях отдела биотехнологии ВГНИИЖа 2001,2002,2003 и 2004 года.
-
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
-
Структура и объём работы. Диссертация написана на 140 машинописных листах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, который включает 249 источников, в том числе 197 на иностранных языках. Работа содержит 8 таблиц и 29 рисунков.
