Введение к работе
Актуальность темы. Разработка методов генетической модификации животных, основанных на использовании половых клеток в качестве векторов для переноса генов, рассматривается как альтернатива традиционному методу получения трансгенных животных - микроинъекции ДНК в пронуклеус зигот [КоржиковаС.В., 2002; Савченкова И.П. и др., 2006; Новгородова И.П. и др., 2008; Эрнст Л.К. и др., 2008; Волкова Н.А. и др., 2011]. Интерес к данному направлению связан, прежде всего, с природной способностью клеток сперматогенного эпителия самцов поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения [Gandolfi F., 1998]. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций на взрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства.
Несмотря на то, что для трансформации половых клеток (спермиев) используют ряд методов (липофекцию, электропорацию и вирусную трансдукцию), сегодня не разработаны системы, позволяющие эффективно доставлять рекомбинантную ДНК в данные клетки-мишени. Разработка эффективного метода генетической модификации половых клеток позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т.к. искусственное осеменение давно успешно используется в сельскохозяйственной практике.
Одним из возможных путей решения данной проблемы является трансформация половых клеток на ранних стадиях их дифференцировки с использованием генных конструкций, полученных на основе рекомбинантных ретровирусов.
Цель и задачи. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось изучение эффективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток хряков и самцов кроликов.
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Изучить компетентность клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков к ретровирусным векторам in vitro.
Осуществить трансформацию клеток сперматогенного ряда прямым введением генных конструкций в семенники кроликов и хряков in vivo.
Определить факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков in vivo (кратность введения, концентрация и тип используемого препарата).
Изучить результативность генетической трансформации сперматогенных клеток кроликов и свиней in vivo генными конструкциями, содержащими к ДНК инсулина человека.
Исследовать характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков.
Научная новизна. Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия кроликов и хряков посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда in vivo. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов (GFP, инсулин) в половых клетках самцов кроликов и хряков.
Практическая значимость. Отработан метод введения генных конструкций в семенники самцов кроликов и хряков in vivo, позволяющий трансформировать клетки сперматогенного ряда с эффективностью до 0,48±0,12 и 0,57±0,10%, соответственно. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в органы-мишени: отработан способ подготовки генных конструкций для инъекций и определена концентрация генных конструкций, эффективная для интеграции рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке. Доказано наличие рекомбинантной ДНК в спермиях опытных животных по достижении ими половой зрелости.
Основные положения, выносимые на защиту
Опосредованный ретровирусами перенос генов как способ генетической трансформации клеток сперматогенного ряда in vitro и in vivo.
Способ подготовки, концентрация, кратность введения ретровирусных векторов в семенники кроликов и хряков in vivo как факторы, влияющие на результативность трансгенеза.
Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия кроликов и хряков.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции: «ЕС-Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи»», Уфа, 2010 г.; на научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК (Достижения науки и техники АПК, Сельскохозяйственная биология) - 2.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 11 таблиц и 16 рисунков. Библиографический список включает 160 источников, в том числе 120 на иностранных языках.
