Введение к работе
Актуальность проблемы. Термин псевдовирусы появился для описания вирусных частиц, образованных при совместной инфекции клеток двумя разными вирусами, при этом образовывались вирусные частицы, содержащие кор одного вируса, а поверхностные белки от другого. Позднее этот термин стал употребляться для описания искусственно созданных вирусов, получаемых в результате трансфекции клеток различными плазмидами, экспрессирующими белки кора и оболочки различных вирусов. Наибольшее распространение получили псевдовирусы на основе ретровирусов. Основным преимуществом псевдовирусов служит возможность создания на их основе так называемых вирусов одного цикла (single cycle virus) – вирусов, способных только к одному циклу размножения, что обеспечивает безопасность работы с такими вирусами
Одной из основных проблем при создании псевдовирусов является обеспечение эффективной трансфекции ДНК в различные типы клеток. Для доставки ДНК используются многочисленные химические и физические подходы, но их эффективность сильно различается, и в значительной степени зависит от типа трансфицируемых клеток. В целом эта проблема решена для фибробластов, эпителиальных клеток, но до настоящего времени не удается обеспечить эффективную трансфекцию лентивирусных векторов в лимфоидные и макрофагальные клетки.
Эффективная трансфекция плазмид – важный этап при получении псевдовирусов, и для его реализации применяются самые разнообразные подходы. Исторически в 70-е годы стал использоваться простой и недорогой кальций-фосфатный метод трансфекции, потом последовало использование положительно заряженных комплексов с ДНК DEAE-декстрана, полиэтиленимина, расширен метод электропорации, использованы катионные липоплексы и различные биополимеры E.I. Golub, et al. 1989. Катионные агенты защищают ДНК от деградации нуклеазами и являются посредником при проникновении в клетку и последующем высвобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции. Применение катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ), несмотря на очевидные преимущества (простота синтеза и доступные реагенты, низкие концентрации, высокая комплексообразующая способность) имеет существенный недостаток, кроющийся в низкой эффективности трансфекции, в связи с чем поиск новых систем-переносчиков является актуальной задачей.
Тест-система оценки активности противовирусных соединений, построенная на основе псевдолентивирусной технологии имеет преимущество перед системой на основе изолированных вирусных ферментов, поскольку последняя не пригодна для оценки проникновения соединений в клетку и оценки активности т.н. пролекарств, для которых необходимо метаболические преобразования в клетке. Примером может служить азидотимидин, из которого должен образоваться трифосфат азидотимидина для проявления его ингибиторной активности в отношении обратной транскриптазы. Псевдолентивирусная технология по сравнению с вирус-клеточной системой обладает значительно более высокой биобезопасностью, а также позволяет вычленить и изучить отдельные стадии вирусного цикла. Это может быть необходимо при изучении активности, механизмов действия и специфики антиретровирусных препаратов различных классов, в том числе новосинтезированных и ранее не изучавшихся. С другой стороны преимуществом системы является совпадение жизненных стадий вируса и псевдовируса от проникновения в клетку до продукции вирусных частиц, что недостижимо при исследовании ингибиторов на изолированных ферментах in vitro.
Целью настоящей работы являлся поиск и изучение эффективных антиретровирусных препаратов с использованием псевдовирусных векторов.
В задачи настоящего исследования входило:
Разработать модельную систему для оценки активности антиретровирусных соединений, построенной на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии и проверить эффективность системы с использованием известных ингибиторов.
Проверить эффективность геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой для проведения трансфекции в различные типы клеток, определить оптимальные условия для проведения трансфекции.
С использованием разработанной тест-системы оценить эффективность новых антиретровирусных соединений на основе интерферирующих РНК, направленных против консервативных сайтов-мишеней в последовательностях генов белка вирусного капсида (gag), обратной транскриптазы и интегразы (pol).
Научная новизна и практическая ценность работы.
Хотя существует значительное продвижение в исследовании ретровирусных инфекций, доступные терапевтические соединения обладают рядом недостатков (токсичность, недостаточная селективность, короткая продолжительность действия, возникновение устойчивых к препаратам вариантов вирусов). Одним из необходимых этапов на пути к созданию более эффективных антиретровирусных препаратов является получение адекватной модельной тест-системы. Проведена оптимизация модельной лентивекторной псевдовирусной системы и проверка малых органических соединений и новых shРНК в качестве антиретровирусных агентов.
В первой части работы на полученной и оптимизированной нами тест-системе оценки активности противовирусных соединений были исследованы известные антиретровирусные препараты. Данная система дает возможность оценивать эффективность кандидатных препаратов еще до стадии доклинических испытаний.
Впервые найдена и испытана группа соединений на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой. Изучены эффективности трансфекции с помощью соединений и цитотоксичность. Соединения, обладающие трансфекционной способностью, находятся в стадии патентования.
В заключительной части работы были изучены новые антиретровирусные препараты на основе интерферирующих РНК по отношению к эффективности ингибирования лентивирусной инфекции. Наибольшую активность показали shРНК, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы. Получены данные о влиянии числа замен в нуклеотидной последовательности мишени на эффективность ингибирования продукции псевдовируса.
Результаты исследовательской работы и наработанные методики активно применяются в учебном процессе у студентов 3-го курса Медицинского факультета НГУ на практических занятиях по предмету «Микробиология и Вирусология»
Положения, выносимые на защиту:
1. Соединения на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой способны к трансфекции плазмидной ДНК в различные типы клеток. Оптимизирована процедура трансфекции и достигнуты значения эффективности свыше 50% клеток HEK293T.
2. Разработана тест-система оценки активности противовирусных соединений на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии, что оптимизирует процедуру поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов.
3. На псевдолентивирус-клеточной системе исследована эффективность соединений на основе коротких шпилечных shРНК, направленных против продукции псевдовируса. Наибольшую активность (до 90% ингибирования репродукции псевдовируса) показывают shРНК, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы.
4. Эффекторные молекулы анти-ВИЧ shРНК с не более чем одним несоответствием между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени в сайте связывания демонстрируют высокую эффективность ингибирования.
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы в журналах из рекомендованного списка ВАК и отправлена заявка на патент. Результаты представлены на более чем 10 международных научных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 126 страницах, содержит 22 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает в себя 255 литературных источника.
