Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Антигенные особенности опухолевых клеток 12
2. Методы получения водорастворимых опухолеассоциированных антигенов 18
3. Методы определения специфической биологической активности опухолеассоциированных антигенов 26
4. Угнетение тимусзависимого звена системы иммунитета при онкологических заболеваниях и восстановление его активными факторами тимуса... 40
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Биологический материал .45
2. Биохимические методы. 46
2.1. Методы получения водорастворимых препаратов трансплантиционных и опухолеассоциированных антигенов 46
2.2. Физико-химические методы,применявшиеся в работе для частичной очистки препаратов тканевых антигенов 51
2.3. Метод определения белка в препаратах 54
3. Методы определения биологической активности антигенных препаратов 55
3.1. Способ определения миграционной способности лейкоцитов в присутствии ОААГ 55
3.2. Тест на угнетение цитотоксического действия антисыворотки препаратами ТАГ. 58
4. Статистическая обработка результатов 63
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Разработка метода получения водорастворимых препаратов тканевых антигенов 64
2. Изучение оптимальных условий теста миграции лейкоцитов. 72
3. Сравнение эффективности двух методов экстракции водорастворимых тканевых антигенов, ассоциированных с опухолью 76
4. Получение препаратов ОААГ меланомы новым методом и исследование их специфической активности 81
5. Исследование препаратов ОААГ при лимфогранулематозе 90
6. Исследование влияния Т-активина in vitro на эффекты,вызываемые препаратом ОААГ ЛГМ в тесте миграции лейкоцитов 99
7. Изучение некоторых физико-химических характеристик препарата ОААГ ЛГМ 104
8. Изучение возможности применения нового метода для получения препаратов ОААГ из других опухолевых тканей НО
Глава ІV. ОБОТДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Разработка нового метода получения тканевых антигенов 114
2. Специфичность препаратов ОААГ ЛГМ 117
3. Влияние Т-активина in vіtro на ответ к препарату ОААГ ЛГМ в тесте миграции лейкоцитов 121
4. Значение эффектов,вызываемых опрсолевыми антигенами в тесте миграции лейкоцитов...122
5. Выбор оптимальной концентрации препаратов ОААГ 128
6. Специфичность препаратов ОААГ,полученных при других злокачественных лимфомах 134
Глава V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 135
ЛИТЕРАТУРА 136
- Антигенные особенности опухолевых клеток
- Методы получения водорастворимых препаратов трансплантиционных и опухолеассоциированных антигенов
- Разработка метода получения водорастворимых препаратов тканевых антигенов
- Разработка нового метода получения тканевых антигенов
Введение к работе
Актуальность работы. Одной из актуальных проблем биохимии опухолевого роста является исследование антигенной чужеродности злокачественных новообразований 21,63,83 .Изучение этих особенностей опухолевых клеток имеет не только большое теоретическое,но и важное практическое значение 50 I. Работы последних лет указывают на возможность использования специфических антигенов раковых клеток в иммунодиагностике злокачественных опухолей I, 67,68,84,129,138,147,148,154. Ясно,что от правильной и своевременной диагностики новообразований зависит в значительной степени успех борьбы со злокачественными опухолями 75,76 .
До настоящего времени основным критерием подтверждения диагноза при развитии опухолей является гистологический анализ,проведение которого оказывается не всегда возможным,особенно при труднодоступной для биопсии локализации опухоли 76 L Поэтому ВОЗ указывает на необходимость разработки методов диагностики in vitro ,так как используемые в настоящее время методы in vivo могут приводить к нежелательной сенсибилизации организма больного 91, ПО . И конечно,для диагностики опухолевого роста необходимо разрабатывать методы с использованием очищенных препаратов опухолеассоциированных антигенов (ОААГ) 83 .К настоящему времени не предложено удовлетворительного метода получения ОААГ из опухолевых тканей 44,77 .Первой задачей в этом направлении является получение биологически активных водорастворимых препаратов опухолей.
К настоящему времени установлено,что нарушение иммунологического надзора за антигенным составом организма является благоприятным для развития опухолевой ткани 63,21 .Оценка функцио- нального состояния тимусзависимого звена системы иммунитета,его активности в отношении к антигенам опухоли,является,таким образом, необходимой в осуществлении контроля за клиническим состоянием онкологических больных Г46 [.Это еще раз указывает на важность создания высокоспецифических методов in vitro.
Еще более остро встал этот вопрос с появлением иммунокорре-гирующих препаратов.Стало необходимо быстро и четко решать вопрос о необходимости и эффективности иммунокоррегирующей терапии в каждом отдельном случае 31,47 .К настоящему времени разработан ряд подходов с использованием иммунологических методов для оценки Т-звена системы иммунитета человека.Однако,ни один из этих тестов не дает достаточно полной информации,так как иногда даже при явных клинических признаках заболевания могут выявляться нормальные ос- новные показатели иммунитета
31,28,29,59 .Состояние тимусзависи- мого иммунитета особенно подробно изучено при развитии лимфограну- лематоза у детей 31,46,47 .Именно при этом заболевании был получен хороший клинический эффект при использовании иммунорегулятора Т-активина с целью восстановления функций тимуса I7,8,47 .Но надежных критериев для определения показаний к назначению Т-активина больным,страдающим лимфогранулематозом (ЛГМ),и оценки эффективности иммунокоррекции пока не предложено [зі I.Это указывает на необходимость исследования диагностических возможностей антигенных препаратов,которые можно получать из лимфатических узлов,пораженных ЛШ,при гистологическом подтверждении диагноза.Однако,пока не удавалось получать препараты ОААГ,пригодные для диагностики ЛГМ 132, П8|.Практически все существующие методы экстракции ОААГ имеют недостатки,не позволяющие применять их для получения специфических диагностикумов Т-звена иммунитета [77,П5,Пб] .Показано,
8. что наиболее перспективными являются методы,позволяющие получать антигенные препараты в водорастворимой форме,так как они дают возможность изучать не только физико-химические,но и биологические свойства ОААГ б].
Обнаружено,что антигены,ассоциированные с опухолями,вызывают в системе лn vitro эффекты,по которым можно судить о состоянии Т-звена иммунитета 28,32,57,58,147,148,150І .Однако,из-за низкой специфичности препаратов ОААГ,получаемых известными методами,вопрос о биологическом значении обнаруженных эффектов до настоящего времени не решен,что также препятствует применению препаратов ОААГ в диагностике [28,71,94,118,149].
Таким образом,вопросы о методе получения препаратов ОААГ и об их диагностической ценности остаются нерешенными 83 .Решение этих вопросов является наиболее актуальными задачами в обсуждаемой проблеме.
Цель работы и основные задачи исследования. Целью работы явилась разработка метода получения водорастворимых антигенных препаратов из опухолевых тканей,изучение их биологической активности и диагностической ценности.
В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:
Разработать эффективный метод получения антигенных препаратов в водорастворимой форме из опухолевых тканей.
Провести сравнение нескольких методов экстракции ОААГ и выбрать оптимальный.
Получить препараты ОААГ из лимфатических узлов человека,пораженных лимфогранулематозом,исследовать их биологические свойства и некоторые физико-химические параметры.
Подобрать иммунологический метод для оценки in vitro реакции
9. Т-звена системы иммунитета на препараты ОААГ.
Провести исследования по оценке диагностических возможностей полученных препаратов ОААГ в случае лимфогранулематоза.
Изучить влияние иммунокорректора Т-активина на реакцию тимус-зависимого иммунитета к препаратам ОААГ у больных лимфогранулематозом.
Научная новизна результатов исследования. Епервые предложен биохимический метод экстракции тканевых антигенов,при котором исключается выход нуклеопротеидов в раствор,что не приводит к увеличению вязкости гомогената ткани при использовании ЗМ раствора KGI для фрагментирования цитоплазматических мембран.Этот эффект достигается благодаря найденным оптимальным значениям рН (4,5-5,0),при которых достигается максимальный выход водорастворимого антигенного материала,обладающего высокой биологической активностью.С помощью этого метода удалось получить препараты ОААГ,проявляющие высокоспецифические свойства в тесте миграции лейкоцитов.
Удалось значительно повысить точность метода миграции лейкоцитов для определения активности препаратов ОААГ.Благодаря разработанным в диссертации методам впервые найдено,что угнетение миграции лейкоцитов in vitro в присутствии ОААГ является показателем острого периода заболевания и нарушения функций тимусзависимого иммунитета,а стимуляция - это нормальная реакция на ОААГ,наблюдающаяся у больных ЛГМ в фазе клинической ремиссии после иммунокор-регирующей терапии с Т-активином,а также у практически здоровых доноров.Показано,что у больных лимфогранулематозом в остром периоде заболевания (до лечения,в процессе лечения и при рецидиве заболевания) препараты ОААГ ЛШ,полученные из пораженных лимфатических узлов,угнетают миграцию лейкоцитов практически в 100% случаев.В фазе клинической ремиссии после химио-лучевой терапии у
10. 50% больных сохраняется эффект угнетения миграции лейкоцитов в ответ на препараты ОААГ ЛШ.У больных ЛГ,получавших комбинированную терапию с Т-активином,в фазе клинической ремиссии препараты ОААГ ЛШ вызывают стимуляцию миграции лейкоцитов,то есть практически в 100% случаев наблюдается отмена эффекта угнетения.
Впервые показано влияние иммунокоррегирукнцего препарата тимуса Т-активина invitro на эффекты,вызываемые препаратами ОААГ в тесте миграции лейкоцитов: отмена угнетения миграции и восстановление до нормальных значений индекса миграции в присутствии ОААГ. Показана корреляция действия Т-активина in vivo и invitro на реакции Т-звена иммунитета к препаратаїл ОААГ,что позволяет определять показания к назначению иммунокоррекции и оценить ее эффективность.
Впервые предложен способ оценки диагностических возможностей препаратов ОААГ в тесте миграции лейкоцитов,а также определения оптимальной концентрации их при использовании с диагностической целью,что осуществляется путем вычисления коэффициента специфичности.
Практическое значение работы. Разработан эффективный способ получения водорастворимых препаратов тканевых антигенов (авт.свид. № 1079246 с приоритетом от 21.12.1982 г.). Разработан способ определения миграционной способности лейкоцитов периферической крови (авт.свид.Р 1076090 с приоритетом от 4.07.1983 г.).Предложен специфический тест invitro для оценки состояния тимусзависимого звена системы иммунитета у больных лимфогранулематозом с использованием препаратов ОААГ ЛГМ.Предложен также специфический тест invitro для оценки эффективности иммунокоррекции и определения показаний к назначению Т-активина больным лимфогранулематозом. Предложен способ определения оптимальной концентрации препаратов
ОААГ и оценки их диагностических возможностей в тесте миграции лейкоцитов.
Внедрение. Результаты,получеиные в диссертационной работе,используются в научно-практической деятельности лаборатории молекулярной иммунологии НИИ ФХМ при 2 МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова,в лаборатории клинической иммунологии ІУ-го управления МЗ СССР,на кафедре внутренних болезней Щ педиатрического факультета 2 МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова,в лаборатории клинической иммунологии академической группы академика АМН СССР В.П.Бисяриной Омского государственного ордена Трудового Красного Знамени Медицинского института им. М.И.Калинина.
Практические рекомендации. Разработанный в диссертации способ получения водорастворимых препаратов,содержащих трансплантационные или опухолеассоциированные антигены,можно применять для получения специфических антигенных препаратов как из свежих,так и из замороженных тканей.Он может быть использован для получения антигенных препаратов из различных нормальных и опухолевых тканей.Разработанный способ определения миграционной способности лейкоцитов в присутствии препаратов ОААГ может быть использован для определения необходимости и эффективности иммунокоррекции Т-активином у больных лимфогранулематозом.
Антигенные особенности опухолевых клеток
В настоящее время не вызывает сомнения тот факт,что опухолевые клетки содержат антигены,отсутствующие в нормальных клетках той же ткани 11,2,3,11,21,40,44,80,81 .Они получили название опу-холеассоциированных антигенов - ОААГ.Наряду с появлением новых антигенов,в процессе малигнизации клетки может наблюдаться также утрата некоторых антигенов,свойственных нормальной клетке І ЗІ.
В связи с этими особенностями опухолевых клеток важное значе ниє имеет исследование закономерностей взаимоотношений между организмом и опухолью,как антигенно чужеродной тканью.Эти взаимоотношения неизбежно должны возникать,поскольку над антигенным постоянством внутренней среды организма осуществляется постоянный контроль иммунной системы.ОААГ могут находиться как внутри клетки,так и на ее поверхности.Антигены,локализующиеся внутри клетки,либо не играют никакой роли,либо незначительную роль в индукции противоопухолевых реакций,так как они недоступны для распознавания их. Реакции имунной системы против опухоли развиваются в ответ на легко доступные антигены,локализующиеся на поверхности злокачественной клетки - трансплантационные опухолеспецифичные антигены.Это и определяет важность изучения опухолевых антигенов,связанных с поверхностной мембраной клетки.
Доказательства наличия опухолеспецифичных трансплантационных антигенов были получены первоначально для химически индуцированных опухолей,а также вызванных физическими агентами и вирусами; затем это было доказано и для спонтанных опухолей 124,137 . Антигенная чужеродность опухолевых клеток обеспечивает возможность формирования состояния трансплантационного противоопухолевого иммунитета.Опухолевые антигены относят к слабым антигенам тканевой совместимости,поскольку они индуцируют слабую противоопухолевую реакцию 21 .Поэтому интенсивность противоопухолевого ответа организма зависит от активности ОААГ на поверхности злокачественной клетки,от степени гетерогенности опухоли.
Опухолевые антигены появляются вследствие структурных и функциональных изменений генетического аппарата клетки.Причинами этих изменений могут быть: I - мутации различной этиологии, 2 - включение вирусной ДНК в геном клетки,либо достройка молекул ДНК клетки ревертазой онкорнавируса, 3 - репрессия или дерепрессия определенных участков молекулы ДНК клетки,кодирущих антигены,как дифференцированных зрелых клеток,так и эмбриональных [71]
Методы получения водорастворимых препаратов трансплантиционных и опухолеассоциированных антигенов
Этим методом в данной работе получали водорастворимые препараты тканевых антигенов из опухолевого материала (меланома) и из лимфоидной ткани мышей.
Образец ткани размораживали,очищали от жира,взвешивали,измельчали и гомогенизировали в 0,04 М Тгі -НСІ + 0,9% NaCl буферном растворе,рН7.3 в стеклянном гомогенизаторе при соотношении 1:9 (масса ткани в граммах : объем раствора в мл),в ледяной бане.
Гомогенат фильтровали через капроновую сеточку и к фильтрату добавляли навеоку сухого KGI до конечной концентрации З М.
Смесь при постоянном перемешивании на магнитной мешалке оставляли на 16 часов при +4С.
Затем материал центрифугировали при 105000 g в течение 1,5 часов при +4С.
Полученный вязкий супернатант диализовали в течение 24 часов против трех смен большого (200-кратного) объема дистиллированной воды при ч4С.
Образовавшиеся в результате диализа нерастворимые фрагменты нуклеопротеидов (ДНП,РНП) удаляли центрифугированием при 105000 в течение 1,5 часов при 44С.
Полученный -таким образом супернатант исследовали на биологическую активность: препарат меланомы - в тесте миграции лейкоцитов периферической крови человека,препарат ТАГ мышей СВА - в ци-тотоксическом тесте.Препарат ТАГ мышей подвергался хроматографии на сефадексе G-200 и определяли выход-антигенной активности в растворимой форме от исходной активности гомогената,удельную активность антигенов на I мг белка.
Перед исследованием в иммунологических тестах в антигенных препаратах определяли концентрацию белка.
3). Метод экстракции в З М KCI в сочетании с ДНКазой
Этим методом в данной работе получали растворимые препараты ТАГ мышей GBA из ткани селезенки и лимфатических узлов.
Начальные этапы метода экстракции в З М KCI с использованием ДНКазы полностью совпадают с этапами оригинального метода I42L Однако,после добавления хлористого калия до З М концентрации в гомогенат,который при этом становится желеобразным (вязким),применяется процедура,направленная на устранение вязкости,обусловленной образованием растворимого комплекса нуклеопротеидов в растворе высокой ионной силы [54,1151 .
Для этого в образовавшийся вязкий "раствор" (гомогенат) вносили хлористый магний до конечной концентрации 0,05 М и ДНКазу в концентрации 50 мкг в мл (СССР,Ленинградский мясокомбинат).Смесь инкубировали 1,5-2 часа при комнатной температуре на магнитной мешалке,при постоянном перемешивании.Поеле того,как гомогенат становился жидким,его инкубировали в течение 16 часов при +4С, поскольку это время является оптимальным для достижения максималь ной экстракции водорастворимого материала в З М КСІ,обладающего антигенной активностью.
Разработка метода получения водорастворимых препаратов тканевых антигенов
По данным литературы наибольший выход водорастворимого активного материала при получении трансплантационных антигенов (ТАГ) обеспечивает метод экстракции с применением З М KCI [l42J. Однако,существеиным недостатком этого метода является длительный диализ (в течение 24 часов),который применяют с целью удаления избытка KCI и осаждения нуклепротеидов,создающих сильную вязкость гомогената ткани.Кроме того,диализ приводит к снижению активности антигенного материала,получаемого в воднорастворимой форме.Мы предположили,что устранение этого методического этапа может повысить эффективность метода.Возникла необходимость в подборе уеловий,предупреждающих появление вязкости гомогената ткани после добавления к нему КСІ в З М концентрации,то есть не допускающих переход нуклеопротеидов (ДНП и РШ) в растворимую форму.
Оказалось,что растворимостьнуклеопротеидов клеток в З М KCI (степень вязкости) зависит от рН гомогената.В работе были определены предельные значения рН для некоторых тканей,выше которых гомогенат становится вязким после добавления к нему З М КСІ.Весьма важно было определить зависимость возникновения вязкости от состояния ткани,то есть была она свежей или предварительно замороженной.Как указывалось в "Обзоре литературы",метод с применением 3 М КСІ пригоден для получения антигенного материала только из живых,выращенных в культуре,клеток.Однако,на практике мы стал 65. киваемся с тем,что биопсийный материал может быть накоплен постепенно и в это время ткань должна быть сохранена в замороженном виде.
Б табл.1 показано,что предельные значения рН для свежих и хранившихся в замороженном виде образцов одной и той же ткани различны.Они не одинаковы также для разных типов биологических тканей,что связано,по-видимому,с относительным содержанием ДНП в клетках различных тканей.
Разработка нового метода получения тканевых антигенов
Поскольку существующие методы получения опухолевых антигенов вначале применялись для получения трансплантационных антигенов, выход которых достаточно лекго можно определить количественно в цитотоксическом тесте,то разработка нового метода была проведена в данной работе на модели ТАГ.
Наиболее часто в настоящее время для получения тканевых антигенов (как ТАГ,так и ОААГ) применяют метод экстракции с З М KCI в сочетании с диализом.Как указывают авторы метода 142 ,значительный выход растворимого антигенно-активного материала достигается только из жизнеспособных клеток -30-80% при пересчете на исходную антигенную активность живых клеток.Снижение количества живых клеток в исходной суспензии до 20% приводит к существенному уменьшению выхода растворимых антигенов - до 9%- от начальной активности клеток.Метод оказался не пригодным для получения антигенов из тканей,хранящихся в замороженном виде І54І.Таким образом, возможности метода крайне ограничены.
Большим недостатком метода является и то,что после добавления к суспензии клеток КСІ до З М концентрации образуется вязкая смесь в результате перехода нуклеопротеидов (ДНІ и РНП) в раствор. Устранение вязкости достигается длительным диализом материала с целью освобождения от хлористого калия.В результате этого происходит частичная деградация активного материала,что приводит к снижению выхода антигенов в растворимом препарате. 54 Известна модификация этого метода с применением ДНКазы, устраняющей вязкость материала I54,115 .Было показано,что в этих условиях повышается выход растворимых антигенов из размороженных тканей 1541.Эта модификация также иммет свои недостатки.Трудно обеспечить стандартные условия обработки материала ДНКазой. Время устранения вязкости зависит от активности фермента,который может быть разной степени чистоты.Удлинение этой процедуры,которая проводится при 37С,приводит к снижению антигенной активности в результате происходящих при этом протеолитических процессов. Добавление ДНКазы загрязняет препарат получаемых антигенов,снижает их удельную активность.Невозможность стандартизации этого метода приводит к тому,что активность получаемого антигенного материала варьирует от опыта к опыту.
В данной работе было найдено условие,предупреждающее выход нуклеопротеидов в раствор после добавления КСІ в З М концентрации - рН гомогената ткани.Это условие также способствовало значительному увеличению выхода растворимого антигенного материала - до 60% от исходной активности клеток.Наиболее эффективным оказался метод получения растворимых ТАГ путем экстракции с З М KCI при рН 4,5-5,0,как в отношении общего процентного выхода антигенов,так и в отношении их удельной активности.Этот метод можно применять как для живых,так и для нежизнеспособных клеток. Кроме того,он проще и удобнее применявшихся ранее его аналогов с использованием З М КСI.Разработанный в диссертации метод получения тканевых антигенов был применен для получения экстрактов из опухолевых тканей.
