Введение к работе
Актуальность темы. Создание биоинженерных форм в животноводстве, в том числе в птицеводстве является одним из перспективных направлений развития современной науки. Генетическая модификация сельскохозяйственной птицы рассматривается в качестве приема улучшения генотипа уже существующих пород для придания им устойчивости к различным возбудителям инфекционных заболеваний, улучшения продуктивных показателей, а также получения биореакторов, синтезирующих рекомбинантные белки в клетках яйцевода [Rapp et al., 2003; Kamihira et al, 2005; Kawabe et al., 2006; Kwon M.S. et al., 2008; Эрнст, 2008; Сураева, 2008].
Однако несмотря на заметные успехи в области трансгенеза птиц, само создание трансгенных кур представляет сегодня определенную проблему. Особенности воспроизводства и развития кур [Petitte, Mozdziak, 2002] значительно снижают эффективность традиционного метода введения экзогенной ДНК в клетки животных - микроинъекции, что требует поиска и разработки альтернативных методов направленного переноса генов. Одним из таких направлений, интенсивно развивающихся в последние годы, является разработка методических подходов, связанных с использованием в качестве клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК разных типов плюрипотентных стволовых клеток [Petitte et al., 2004; Zhu et al., 2005], в том числе примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) - предшественников высоко дифференцированных половых клеток. Генетическая трансформация ПЗК с последующей их трансплантацией в эмбрионы кур in vivo рассматривается как перспективный метод целенаправленной генетической модификации гонад и получения трансгенной птицы. В связи с этим проведение исследований в данном направлении представляется актуальным в рамках разработки высокоэффективных трансгенных технологий с целью их дальнейшего использования в птицеводстве.
Цель и задачи исследований. Исходя из выше изложенного, целью диссертационной работы явилось изучение результативности использования примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo.
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Изучить факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур.
Выполнить генетическую трансформацию ПЗК in vitro и in vivo.
Оптимизировать метод генетической трансформации ПЗК in vitro.
Ввести трансформированные ПЗК в эмбрионы кур in vivo и изучить эффективность колонизации данными клетками гонад эмбрионов-реципиентов.
Разработать методические приемы, позволяющие повысить эффективность трансгенеза.
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы изучены факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур. Впервые дана сравнительная оценка различных методов генетической трансформации данного типа клеток in vitro и in vivo и выполнено введение трансформированных ПЗК в эмбрионы кур in vivo. Впервые изучена эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов, а также исследовано влияние предъинкубационной обработки эмбрионов и концентрации донорских ПЗК на эффективность трансгенеза.
Практическая значимость. Усовершенствован метод выделения ПЗК из эмбрионов кур и оптимизированы условия поддержания в культуре данного типа клеток. Предложен эффективный способ генетической трансформации ПЗК и их введения в эмбрионы кур in vivo. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки генетической модификации гонад эмбрионов кур in vivo с эффективностью колонизации введенных трансформированных ПЗК до 39,1%. Предложен метод предъинкубационной обработки эмбрионов, блокирующий развитие эндогенных ПЗК в гонадах эмбрионов-реципиентов.
Основные положения, выносимые на защиту
Способ дезагрегации ткани, стадия развития эмбрионов, разделение клеток по адгезии как факторы, влияющие на результативность получения культуры ПЗК кур.
Электропорация как результативный способ генетической трансформации ПЗК in vitro.
Эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на
международных конференциях: «Высокие технологии, фундаментальные и
прикладные исследования, образование», Санкт-Петербург, 2007;
«Современные достижения и проблемы биотехнологии
сельскохозяйственных животных», Дубровипы, 2008, 2009.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 4.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 13 таблиц, 22 рисунка, 1 схему. Библиографический список содержит 117 источников, в том числе 96 на иностранных языках.
