Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТИРАТУРЫ 11
1.1. Использование промоторной области регуляторных генов в
экспериментах по генетической трансформации 11
1.1.1. Экспрессия стрессовых белков - белков теплового шока 11
1.1.1.1. Промоторный район гена белка теплового шока 70 (БТШ70)
в экспериментах по трансформации эукариотических клеток 14
1.1.2. Тканеспецифическая экспрессия генов медленной эстеразы у насекомых 15
1.1.3. Регуляция экспрессии генов кератина волос у млекопитающих 16
1.2. Репортёрные гены - маркеры генетической трансформации 18
1.2.1. Ген Р-галактозидазы Escherihia coli 18
1.2.2. Флуоресцирующие белки кишечнополостных 19
1.2.2.1. Зелёный флуоресцирующий белок Aequorea victoria 22
1.2.2.1.1. Особенности пространственной структуры GFP 23
1.2.2.1.2. Хромофор GFP 24
1.2.2.1.3. Спектральные характеристики GFP и его мутантных форм 26
1.2.2.1.4. Физико-химические свойства GFP 28
1.3. Генетическая трансформация насекомых 29
1.3.1. Первые эксперименты по трансгенезу насекомых 29
1.3.2. Мобильные элементы - векторы генетической трансформации насекомых 30
1.3.2.1. Характеристика мобильных элементов 30
1.3.2.2. Р-элемент дрозофилы 34
1.3.2.2.1. Механизм интеграции мобильных элементов в хромосомы насекомых на примере Р-элемента 36
1.3.2.2.2. Трансформация насекомых с помощью Р-элементов 38
1.3.2.3. Мобильный элемент Hermes - эффективный вектор для трансформации насекомых 39
1.3.3. Микроинъекция эмбрионов - основной метод трансформации насекомых 41
1.3.4. Маркеры генетической трансформации насекомых 44
1.3.4.1. GFP - эффективный маркер генетической трансформации у насекомых 46
1.3.5. Генетическая трансформация комнатных мух 48
1.3.6. Мутагенное действие экзогенной ДНК 49
1.4. Получение трансгенных мышей 51
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 53
2.1. Объекты исследований 53
2.2. Схемы исследований 55
2.3. Использованные векторы 56
2.4. Получение генетически трансформированных животных 59
2.4.1. Микроинъекция эмбрионов комнатных мух 59
2.4.1.1. Микроинъектор и микроинструменты 59
2.4.1.2. Проведение микроинъекции эмбрионов комнатных мух 60
2.4.1.3. Получение потомства от комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии 61
2.4.2. Получение трансгенных мышей 61
2.5. Молекулярно - генетический анализ 62
2.5.1. Выделение ДНК 62
2.5.2. ПЦР-анализ 64
2.5.2.1. Праймеры 65
2.6. Анализ экспрессии чужеродных генов у трансформированных животных 67
2.6.1. Выявление продуктов экспрессии гена Р-галактозидазы Е. coli. у комнатных мух 67
2.6.2. Выявление экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка A. victoria 68
2.6.2.1. Выявление экспрессии гена EGFP у комнатных мух 68
2.6.2.2. Выявление экспрессии гена EGFP у мышей 69
2.6.2.2.1. Определение флуоресценции EGFP у трансгенных мышей 69
2.6.2.2.2. Иммуногистохимическое выявление экспрессии гена EGFP 70
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 73
3.1. Результаты микроинъекций эмбрионов комнатных мух 73
3.1.1. Получение и разведение взрослых комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии плазмидами pwLacZ и p7c25wc 73
3.1.1.1. Результаты определения бета-галактозидазной активности у потомков Musca domestica L., микроинъецированных на эмбриональной стадии 74
3.1.1.2. Анализ наследования формы крыльев у комнатных мух 74
3.1.1.3. Сравнение жизнеспособности комнатных мух линии с нормальными (прямыми) крыльями и мух линии curly 76
3.1.1.4. Аллелизм мутации curly у комнатных мух 77
3.1.1.5. Молекулярный анализ хромосомной ДНК комнатных мух мутантной линии curly 78
3.1.2. Микроинъекция эмбрионов комнатных мух плазмидами pHermNeo-EGFP и pHlpHt 79
3.1.2.1. Исследование экспрессии гена EGFP у комнатных мух 80
3.1.2.2. Молекулярный анализ ДНК комнатных мух, на содержание последовательностей рекомбинантных мобильных элементов Hermes 81
3.1.2.3. Анализ ДНК комнатных мух на содержание эндогенных элементов Hermes 83
3.2. Получение трансгенных мышей 85
3.2.1. Получение первичных трансгенных мышей 85
3.2.2. Получение первого и второго поколения трансгенных мышей.. 86
3.2.3. Анализ экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка Aequorea victoria у трансгенных мышей 88
3.2.3.1. Исследование флуоресценции волос у трансгенных особей... 88
3.2.3.2. Исследование флуоресценции гистологических препаратов кожи трансгенных мышей 95
3.2.3.3. Иммуногистохимическое исследование тканеспецифической экспрессии гена EGFP 97
ОБСУЖДЕНИЕ 103
ВЫВОДЫ 112
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 113
Список опубликованных работ по теме диссертации 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
Введение к работе
Актуальность проблемы
Генная инженерия многоклеточных организмов является одной из областей современной биотехнологии.
Трансгенные животные представляют собой удобную модель изучения механизмов регуляции ткане- и стадиеспецифической экспрессии, структуры и функциональной организации генов, заключительных стадий биосинтеза белка (Вайсман и др., 1988).
Наряду с изучением фундаментальных вопросов трансгенеза большое внимание привлекают работы по созданию трансгенных животных-продуцентов рекомбинантных белков, трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к заболеваниям или трансгенных животных, имеющих улучшенные продуктивные качества (Брем и др., 1996; Эрнст Л.К., 2003, 2004).
В течение многих лет эксперименты по трансгенезу насекомых проводились, в основном, на дрозофилах Drosophila melanogaster с помощью рекомбинантных Р-элементов - подвижных (мобильных) генетических структур, обнаруженных у этого вида (Rubin et al., 1982). Исследования по трансгенезу насекомых, не относящихся к семейству drosophilidae, часто заканчивались неудачно, что было обусловлено отсутствием эффективных генно-инженерных векторов (Crampton J.M., Eggleston P., 1994). Успешная генетическая трансформация насекомых в последние годы стала возможна в результате создания учёными генных конструкций на основе транспозонов, обнаруженных у насекомых разных видов (Handler A.M., 2001). Среди этих структур большую популярность в качестве вектора генетической трансформации насекомых приобрёл мобильный элемент комнатных мух Musca domestica L. - Hermes (Warren et al., 1994).
При проведении экспериментов по созданию трансгенных насекомых наряду с выбором генно-инженерного вектора большое внимание уделяется таким селективным маркерам, которые обеспечивают эффективный отбор трансгенных особей среди потомков, полученных от подопытных животных. В настоящее время наиболее эффективными прижизненными маркерами являются гены флуоресцирующих белков, выделенные из медуз и кораллов, а также мутантные формы этих генов, в том числе улучшенный GFP (Enhanced GFP, EGFP) (Handler A.M., 2001).
Клонирование промотора одного из генов белков промежуточных филаментов (IF) кератина шерсти овец - К2.10 (Rogers G.E., Powell B.C., 1993) и синтез аналогов гена белка спидроина 1, обуславливающего прочность каркасной нити паутины крестовика Уемуры (Araneus uemura) (Дебабов В.Г., Богуш В.Г., 1999; Пирузян и др., 2003), обеспечивает возможность создания рекомбинантных генных конструкций для получения трансгенных овец с улучшенными механическими качествами шерсти.
Использование при создании трансгенных организмов генов маркерных (репортёрных) белков, таких как р-галактозидаза Escherichia coli или зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein, GFP) медузы Aequorea victoria, позволяет установить функциональную активность различных промоторов, обуславливающих экспрессию чужеродных белков в определённых тканях трансгенных животных.
Предварительным этапом получения генетически трансформированных сельскохозяйственных млекопитающих является анализ интеграции и тканеспецифической экспрессии чужеродных генов у трансгенных модельных животных, среди которых, в основном, используют лабораторных мышей Mus musculus L.
Короткий промежуток времени, необходимый для смены генераций (65-70 дней), высокая плодовитость мышей облегчают проведение экспериментов по трансгенезу этих животных и обуславливают получение достоверных результатов.
Цель и задачи исследований
Цель настоящей работы заключалась в создании новых моделей генетически трансформированных животных на основе использования репортёрных генов.
Для достижения намеченной цели перед нами были поставлены следующие задачи:
- провести трансформацию клеток зародышевого пути Musca domestica методом микроинъекции в ранние эмбрионы рекомбинантных Р и Hermes мобильных генетических элементов, содержащих в качестве маркерного гена ген бета-галактозидазы (LacZ) и ген зелёного флуоресцирующего белка (EGFP);
- провести анализ генетической трансформации в первом и втором поколении комнатных мух, подвергшихся микроинъекции, по наличию экспрессии указанных репортёрных белков;
- провести ПЦР-анализ ДНК комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии развития, и их потомков на наличие трансгена;
- провести ПЦР-анализ ДНК лабораторных мышей, полученных в результате микроинъекции в пронуклеусы зигот генетической конструкции, содержащей ген EGFP под контролем промотора гена белка промежуточных филаментов кератина шерсти овец (К2.10), и выявить первичных трансгенных животных;
- провести молекулярно-генетический анализ наследования трансгена в первом и втором поколении трансгенных мышей;
- исследовать экспрессию гена EGFP в клетках коркового вещества волос у полученных трансгенных мышей.
Научная новизна
При проведении нами экспериментов по генетической трансформации комнатных мух с использованием гена улучшенного зелёного флуоресцирующего белка медузы Aequorea victoria под контролем промотора гена hsp70 (гена белка теплового шока) Drosophila melanogaster впервые подтверждена возможность получения трансгенных особей и их отбор на эмбриональной стадии развития.
При проведении исследований на мышах впервые были получены трансгенные особи, экспрессирующие зелёный флуоресцирующий белок (EGFP) под контролем промотора (Кег5), полученного из регуляторной области гена белка промежуточных филаментов (типа II) кератина шерсти овец (К2.10).
Основные положения, выносимые на защиту
• Возможность использования репортёрного гена EGFP под контролем промотора гена hsp70 и промотора Кег5 для изучения эффективности генетической трансформации модельных животных: Musca domestica L. и Mus musculus L.
• Локализация экспрессии гена EGFP в корковом веществе волос у мышей, трансгенных по Ker-EGFP.
• Отклонение фактического расщепления по трансгену Ker-EGFP в первом поколении и подтверждение менделевского расщепления по тому же трансгену во втором поколении трансгенных мышей.
Практическая значимость
В результате проведённых исследований показана принципиальная возможность использования гена зеленого флуоресцирующего белка медузы Aequorea victoria (EGFP) в качестве селективного маркера для отбора трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития.
Тканеспецифическая экспрессия гена улучшенного зелёного флуоресцирующего белка (EGFP), наблюдаемая у трансгенных мышей, обуславливает возможность использования промоторной области гена К2.10 (735 пар нуклеотидов) в экспериментах по направленной экспрессии рекомбинантных белков в корковом веществе волос у трансгенных млекопитающих.
Апробация работы
Материалы диссертации были изложены на 49-й научной конференции молодых учёных и аспирантов ВГНИИЖа «Достижения молодых учёных в области животноводства», проходящей 6 июля 2000 года в ВГНИИЖе, п. Дубровицы, Подольского района, Московской области; на отчётных научных конференциях отдела биотехнологии ВГНИИЖа 2001, 2002, 2003, 2004 года.
Структура и объём работы
Диссертация написана на 140 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение (5 страниц), обзор литературы (42 страницы), материалы и методы исследований (20 страниц), результаты исследований (30 страниц), обсуждение (9 страниц), выводы (1,2 страницы), практические предложения (0,3 страницы).
Диссертация включает 8 таблиц и 29 рисунков. Список использованной литературы состоит из 249 источников.
