Содержание к диссертации
Введение
Общая характеристика работы 7
Актуальность темы исследования 7
Цели и задачи исследования 8
Научная новизна и практическая значимость работы 9
Положения, выносимые на защиту 10
Степень достоверности и апробация результатов 10
Личное участие автора в проведении исследований 11
Обзор литературы 12
Бактериоцины 12
Микроцины 13
Микроцины класса 1 16
Микроцин B17 16
Микроцин J25 17
Микроцин С7-C51 19
Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик 21
История открытия микроцинов 21
Расшифровка структуры микроцина 22
Гены синтеза микроцина С 23
Роль белков микроцинового кластера 27
Возможные гомологи генов микроцинового кластера 28
Регуляция генов микроцинового кластера 30
Механизм действия микроцина С 33
Антибактериальная активность микроцина С и его аналогов 34
Белок MccB 39
Ферментативная функция белка МссВ 39
Структура белка МссВ 42
Положение пептидного субстрата в активном центре пептид-связывающего домена 45
Структура аденилирующего активного центра 46
Уникальные черты активного центра белка МссВ 48
Конформационная подвижность активных центров 48
E1-суперсемейство 51
Филогенетическиое древо белков Е1-суперсемейства 51
Характерные структурные элементы белков Е1-суперсемейства 53
Структурные особенности белков Е1-суперсемейства 54
Сравнительный структурный анализ некоторых представителей прокариотических белков E1 суперсемейства 58
Биологическая роль белков ThiF и MoeB 58
Сравнительный структурно-функциональный анализ белков Е1-суперсемейства MccB,
MoeB, ThiF 62
Материалы и методы 70
Бактериальные штаммы 70
Геномная и плазмидная ДНК 70
Питательные среды 70
Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам 71
Метод ПЦР 71
Праймеры для ПЦР 72
Праймеры для мутагенеза по методу Даценко-Уорнера 73
Электрофорез в агарозном геле 73
Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля 73
Расщепление ДНК рестриктазами 74
Лигирование фрагментов ДНК 74
Клонирование фрагментов ДНК 74
Мутагенез по методу Даценко-Уорнера 76
Приготовление химически компетентных клеток E. coli 76
Трансформация компетентных клеток E. coli 77
Пептиды 77
Получение и очистка рекомбинантных белков 78
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) 80
Аденилирование пептидов in vitro 81
Масс-спектрометрический анализ (MALDI-MS и MS/MS) 81
Тесты на чувствительность к микроцину и его аналогам 81
Приготовление S30 клеточных экстрактов 82
Реакция аминоацилирования тРНК 82
Процессинг пептидов МссА в S30 экстрактах 83
Аминопропилирование аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L. johnsonii in vitro 83
Введение радиоактивной метки in vitro 83
Проверка токсичности аденилированного белка in vivo 84
Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ 84
Биоинформатический анализ белковых последовательностей 85
Результаты работы 87
Часть 1. Изучение ортологов белка МссВ и микроцин С-подобных соединений, закодированных в mcc-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli 87
Анализ результатов биоинформатического поиска гомологов микроцинового оперона 87
Энзиматический синтез аденилированных пептидов in vitro 89
Биологическая активность аденилированных пептидов 95
Активность аденилированных пептидов in vitro 98
Биологическая активность аминопропилированных микроцин С-подобных соединений 101
Филогенетическое древо МссВ-подобных аденилат-трансфераз 103
Анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ 106
Часть 2. STRONG Получение новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной
пептидной частью с помощью белка МссВ E. coli STRONG 111
Поиск нового субстрата для белка MccB E. coli путем трехмерного моделирования 111
Тестирование различных пептидных субстратов белка МссВ in vitro 116
Биологическая активность аденилированных пептидов 120
Сравнение антибактериальной активности некоторых аналогов микроцина С 122
In vitro аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN 124
In vivo аденилирование белка, содержащего на своем C-конце пептид MRTGNAN 126
Обсуждение полученных результатов 129
Выводы 145
Список используемой литературы 146
- Научная новизна и практическая значимость работы
- Расшифровка структуры микроцина
- Структурные особенности белков Е1-суперсемейства
- Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ
Научная новизна и практическая значимость работы
Отношение к «Феноменологии духа», «Науке логике» и к ранним систематическим произведениям Гегеля, начиная с середины XIX века, сформировалось в большей степени на основе изданий сочинений, предпринятых многочисленными учениками Гегеля. Для учеников Гегеля, взявших на себя труд по изданию как можно полного собрания его сочинений (К. Михелет, Г. Гото, Л. Хеннинг, К. Розенкранц и др.), характерно невнимание к эволюции взглядов Гегеля на взаимосвязь феноменологической и логической концепции. Некоторые исследователи истории издания сочинений философа связывают это с ограниченными представлениями последователей Гегеля о системе, которую они трактовали как абстрактную схему.1 Отсутствие в корпусе источников теологических сочинений молодого Гегеля, йенских ранних произведений, а также поверхностный взгляд на «Феноменологию духа» – всё вместе затруднило понимание основного замысла Гегеля в построении системы, способствовало ограниченному восприятию всей его философии, и повлияло на последующие её оценки как неогегельянцами, так и философами, состоявшими в антагонизме к гегелевской философии.
Поскольку для философии середины XIX – середины XX века в целом характерна утрата интереса к проектам, связанным с построением системы и неприятие таких принципов как целостность, полнота, единая исходная основа, то критика и интерпретация гегелевской философии, философии по преимуществу, имеющей системный вид, не соответствовала масштабу задуманного Гегелем, приводила к непониманию, игнорированию или, напротив, к феноменологического или логического. Отсюда многочисленные критики и интерпретаторы философии Гегеля (особняком здесь стоят работы К. Маркса и некоторые работы философов, развивавших марксистскую традицию) так и не смогли справиться с проблемой определения действительного предмета развёрнутого сначала в «Феноменологии духа», а затем и в «Энциклопедии».
Во второй половине XIX – начале XX века интерес к философии Гегеля возникает в связи пересмотром роли субъективности в экономических, политических, культурных контекстах существования человека. В связи с раскрытием эзотерической стороны гегелевских построений уже в начале XX века возникает потребность нового прочтения Гегеля. Представители персонализма находили в гегелевской системе позитивную основу для утверждения абсолютной ценности конкретного бытия. В. Дильтей,1 исследуя ранние произведения, интерпретирует искания молодого Гегеля в духе «философии жизни» и иррационализма, с акцентом на понимание свободы как исторически становящегося качества субъекта деятельности.
Обращение к Гегелю неокантианцев в начале XX века (В. Виндельбанд),2 связанное с попытками содержательного обновления неокантианства, привело к возрождению интереса к философскому наследию Гегеля и возникновению новой волны гегельянства, к активной переработке его идей, осмыслению логической концепции в целом. Представители указанного движения, выросшего из попыток синтеза философии Канта и Гегеля, занялись также переизданием корпуса сочинений Гегеля. К значительным фигурам неогегельянства этого периода можно отнести: Г. Лассона, Г. Глокнера, Р. Кронера, Т. Херинга. Виндельбанд В. Философия в немецкой духовной жизни XIX столетия. М., 1993. указывал на её двойственный характер, выделял аспект иррациональности как источник живого начала в философии Гегеля.1 Другой видный исследователь гегелевской философии Р. Кронер также, отмечая противоречие между рациональным и иррациональным в гегелевских построениях, указывал на невозможность в концепте Абсолютного духа соединить указанные выше две стороны, признавал значение «Феноменологии духа» для построения системы.2 Для Т. Херинга, напротив, «Феноменология духа» – не организованный в систему материал, отсюда, согласно Херингу, требовался перенос акцента в исследованиях произведений Гегеля на этапы становления принципа системности.3
Как значительную работу начала XX века следует отметить книгу русского философа И.А. Ильина «Философия Гегеля как учение о конкретности Бога и человека»,4 которая отклоняется от традиции как простого заимствования идей, так и прямой критики Гегеля, характерной для русской философской мысли XIX века.5 И.А. Ильин рассматривает, прежде всего, систему Гегеля как своеобразную «судьбу мира», выраженную в «цепи побед», ведущих к пределу господства божественного. Эта «цепь побед» может быть продолжена, если будет снята ограниченность человека, но поскольку существование человека противоречиво, то достижение указанного идеала есть, по Ильину, утопия. Указывая на то, что в философии Гегеля отражается противоречивое бытие человека, Ильин гораздо точнее улавливает суть гегелевских построений, нежели представители «философии жизни» и персонализма. Достоинством гегелевской системы Ильин считает наличие в ней живой синтетической связи, представленной через единство смысловых определений.
Расшифровка структуры микроцина
Особенности этой ферментативной реакции были достаточно подробно изучены в лаборатории Уолша (Walsh) [77]. В ходе эксперимента к рекомбинантному белку МссВ в реакционную смесь были добавлены пептид MRTGNAN (полученный методом твердофазного химического синтеза), АТФ и соли магния (магний является кофактором нуклеотид-связывающих ферментов). После инкубации реакционной смеси, продукты были разделены с помощью ВЭЖХ. Отдельные пики были проанализированы с помощью масс спектрометрического анализа. Было выявлено, что в результате реакции образуется три продукта: АМФ, аденилированный пептид (идентифицирован по сдвигу массы пептидного пика - плюс 329 ед.м.) (Рисунок 12-5) и интермедиат - сукцинимидное производное пептида MRTGNAN (сдвиг массы - минус 18 ед.м. относительно пептидного пика) (Рисунок 12-3), образующееся в ходе циклизации С-концевого аспарагина (Рисунок 12). Также в реакционной смеси присутствовал исходный пептид, не прореагировавший с ферментом МссВ. Образование аденилированного продукта и формирование связи N-P было подтверждено с помощью ЯМР [77]. Рисунок 12. Схема двустадийной реакции пост-трансляционной модификации пептида МссА ферментом МссВ. В ходе реакции происходит формирование N-P связи. На первой стадии -карбоксильная группа С-концевого аспарагина (1) пептида MccA атакует -фосфат первой молекулы АТФ, в результате чего образуется гидролитически лабильное соединение гептапептидил-СО-АМР (2). Далее атом азота -карбоксамидо группы С-концевого аспарагина атакует С-концевой ацил-АМФ-ангидрид (2), с образованием кольцевого аддукта - сукцинимидного производного МссА (3) и выделением АМФ. Атом азота в составе сукцинимида представляет собой слабый нуклеофильный агент, который подвергается атаке -фосфата второй молекулы АТФ (3) с образованием N-P связи (4). Такой продукт, по всей видимости, гораздо более подвержен нуклеофильной атаке, по сравнению с исходным карбоксамидом. На последней стадии происходит размыкание кольца в ходе нуклеофильной атаки воды (4) с образованием изоаспарагинил-производного (5) - микроцина МсС 1092. (6) Ингибитор белка МссВ -MccA-N7isoAsn, пептид МссА с заменой С-концевого аспарагина на его аналог изоаспарагин [77].
В ходе реакции происходит изомеризация C-концевого остатка аспарагина в изоаспарагин под действием фермента MccB. Судя по всему, эта реакция представляет собой двустадийный процесс (Рисунок 12). На первом этапе расходуется одна молекула АТФ, в результате чего образуется интермедиат -сукцинимидное производное (далее сукцинимид-МссА) (Рисунок 12-3), которое служит субстратом для второй реакции, в ходе которой расходуется вторая молекула АТФ и образуется продукт - аденилированный изоаспарагин (Рисунок 12-5). Первая реакция протекает медленнее второй, но сродство фермента МссВ к первому пептидному субстрату (МссА) больше, чем ко второму (сукцинимидному производному), что приводит к накоплению в реакционной смеси сукцинимид-МссА. Тот факт, что последний является именно интермедиатом, а не побочным продуктом, было подтверждено следующими экспериментами: очищенный из реакционной смеси ВЭЖХ сукцинимид-МссА, а также сукцинимид-МссА, полученный синтетически, были добавлены в реакционную смесь к ферменту МссВ. Фермент конвертировал оба соединения в конечный продукт - микроцин С 1092 [77].
В этой же работе было показано, что синтетический субстрат MccA-N7isoAsn (Рисунок 12-6) не является субстратом для фермента МссВ, но ингибирует его активность. Таким образом преобразование сукцинимидного производного в фосфоамидат идет путем нуклеофильной атаки молекулы АТФ в активном центре фермента непосредственно на замкнутую в цикл молекулу, и раскрытия цикла перед второй стадией реакции не происходит.
Остается открытым вопрос о субстратной специфичности фермента МссВ. Так в работе Казакова и соавторов она была отчасти исследована in vivo [42]. В ген mccA вносились точечные мутации, приводившие к замене каждой отдельно взятой аминокислоты пептида за исключением N-концевого метионина, на остальные 19 аминокислот. Было показано, что практически в любую позицию, за исключением седьмого C-концевого остатка аспарагина, можно внести аминокислотную замену, которая приводит к синтезу активного антибиотика (Рисунок 10). Замена аспарагина в седьмом положении пептида MccA на любую другую аминокислоту полностью нарушает продукцию микроцина С [42].
Результаты Казакова и соавторов согласуются с предложенным механизмом энзиматической реакции синтеза МсС из пептида МссА ферментом МссВ [77]. Так как в ходе ферментативной реакции происходит конверсия С-концевого аспарагина в аспартат. Казалось бы заманчиво предположить, что пептид с заменой С-концевой аминокислоты с аспарагина (N) на аспартат (D) также будет служить субстратом для фермента МссВ. Но в ходе тестов in vitro было продемонстрировано, что пептид MccA-N7D (MRTGNAD), в отличие от пептида дикого типа MRTGNAN, не взаимодействовал с ферментом МссВ и, соответственно, накопления аденилированного продукта не происходило [77]. Промежуточный продукт реакции MccB с пептидом MRTGNAD должен был бы представлять собой циклическое производное, но в отличие от сукцинимида (имида янтарной кислоты), в случае аспартата, должен образовываться внутримолекулярный ангидрид (Рисунок 12). Такие соединения крайне нестабильны и легко гидролизуются. Возможно, время жизни этого интермедиата настолько мало, что он не успевает войти во вторую стадию энзиматической реакции [77] и гидролизуется с образованием исходного продукта, т.е. пептида MRTGNAD. Более того, если допустить, что интермедиат образовался и вступил во вторую стадию реакции, то образовавшийся продукт - ацил-фосфорный ангидрид (соединение эквивалентное веществу 5 на рисунке 12, но с кислородом вместо атома азота). Такие соединения в водной среде крайне нестабильны и гидролизуются практически мгновенно, в нашем случае, с образованием исходного пептида с С-концевым аспартатом.
Для лучшего понимания субстратной специфичности фермента МссВ следует подробно рассмотреть его структуру и обратить внимание на организацию его каталитического центра. Структура белка МссВ Полипептидная цепь МссВ образована из 351 а.о. По принципу структурной гомологии белок МссВ можно условно разделить на 2 региона: N-концевой участок (длиной порядка 90 а.к.), для которого не установлена схожесть с известными белковыми структурами, и С-концевой участок (длинной порядка 260 а.к.), который имеет сходство с аденилирующим доменом убиквитин-подобных ферментов (ubiquitin-like protein-activation enzyme, UBL) [76].
Группа исследователей под руководством Уолша (Walsh) и Шулмана (Schulman) получила ряд кристаллов белка MccB и разрешила их структуры [76]. Белки были кристаллизованы в виде гомодимеров, имеющих удлиненную форму (полипептидные цепи, соответствующие каждому протомеру, для удобства обозначены А и В).
Структурные особенности белков Е1-суперсемейства
Клетки, чувствительные к микроцину С, E. coli BW25113, а также изогенный штамм ABN (дефектрый по генам пептидаз pepA, pepB и pepN) [43], устойчивый к действию микроцина С, растили в 200 мл питательной среды LB при температуре 37 оС, до достижения культурой клеток оптической плотности 0,5 при длине волны 600 нм. Клетки были отделены от питательной среды центрифугированием и промыты буфером (20 мM Трис-HCl, pH 8.0, 10 мM MgCl2, 100 мM KCl), после чего клетки ресуспендировали в том же буфере с добавлением ДТТ до конечной концентрации 1 мМ и разрушили путем обработки ультразвуком. Клеточные лизаты центрифугировали при 30000g и температуре +4 оС в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отобрали, определили концентрацию белка с помощью реактива Бредфорда (Bio-Rad), разделили на аликвоты и хранили при температуре -70 оС.
Реакция аминоацилирования тРНК 4 мкл S30 экстрактов (концентрация белка 2 мг/мл) смешали с 2 мкл реакционных смесей, содержащих аденилированные пептиды (см. выше), или 0,1 мМ микроцина С 1092 (положительный контроль) и инкубировали в течение 15 минут, для прохождения протеолитического процессинга пептидной части антибиотика. Через 15 минут к экстрактам был добавлен реакционный буфер (30 мM Трис-HCl, pH8.0, 30 мM KCl, 8 мM MgCl2, 1 мM ДТТ, 3 мM ATФ, 5 мг/мл тотальной тРНК (тРНК из E. coli MRE 600, Roche Diagnostics) и 40 мкM 14C-Asp. Такие смеси инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Продукты реакции осадили на бумажные фильтры (Whatman 3MM paper, Sigma-Aldrich) холодной 10% трихлоруксусной кислотой и подготовили для сцинтилляционного счетчика.
Процессинг пептидов МссА в S30 экстрактах По 2,5 мкл 5 мМ пептидов MRTGNAN и MDHIGFN смешали с 5 мкл S30 экстрактов E. coli BW25113. Реакции инкубировали 0, 5, 15 и 60 минут при комнатной температуре. Реакции останавливали перенесением 1 мкл реакционной смеси в 99 мкл 0,5% трихлоруксусной кислоты. Такие смеси были проанализированы с помощью масс-спектрометрии.
Аминопропилирование аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L. johnsonii in vitro 50 мкМ аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L. johnsonii смешали с ферментами MccD, MccE и белком Mtn до конечной концентрации 5 мкМ, 1 мкМ и 5 мкМ соответственно. Реакции проводили в буфере 100 мM Трис-HCl pH 7.5, 50 мM NaCl, 10 мM MgCl2 и 200 мкM SAM при температуре 25оС в течение 16 часов. Реакцию ингибировали охлаждением до -20оС. Образование продуктов реакции подтверждали с помощью масс-спектрометрии.
Введение радиоактивной метки in vitro Реакции были поставлены в объме 50 мкл: 7.5 мM Трис-HCl pH8.0, 10 мM MgCl2, 4 мМ ДТТ, 4 мкМ МссВ E. coli, 2,5 мМ АТФ и 0,75 мкМ [-32P]-АТФ (3000 Кю/ммоль). В реакционные смеси были добавлены субстраты: 4 мкМ MBP-pepN или 200 мкМ пептида MRTGNAN. Контрольные реакции не содержали субстрат для МссВ E. coli. Реакции инкубировали при температуре 23оС в течение 24 часов. Для того чтобы удостовериться, что за время инкубации белок МссВ аденилировал свои субстраты, аликвоты по 10 мкл реакционных смесей были помещены на поверхность мягкого агара, содержащего клетки E. coli B, клетки инкубировали несколько часов при 37оС (как описано выше) и детектировали образование зон ингибирования роста клеток под действием реакционных смесей, содержащих пептид MRTGNAN. Далее аликвоты по 10 мкл реакционных смесей были нанесены на денатурирующий 10% ПААГ и разделены в электрическом поле. После чего гель окрасили с помощью Кумасси R-250 бриллиантового синего, сфотографировали и сделали радиоавтограф. Проверка токсичности аденилированного белка in vivo
Клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали генетическими конструкциями pCol-MccB-MBP и pCol-MccB-MBP-pepN и растили на питательной среде LB (с добавлением канамицина и 1% глюкозы) при температуре 37оС и постоянном помешивании ночь. Далее аликвоты клеточной культуры переносили в свежую среду LB с добавлением канамицина и 0,1 мМ ИПТГ до достижения конечной оптической плотности культуры 0,1 при длине волны 600 нм. Далее клетки растили при температуре 37оС и постоянном помешивании в течение 7 часов. Через каждые 30 минут в отбирали 100 мкл клеточной культуры для измерения ее оптической плотности при длине волны 600 нм.
Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ Продукты реакции аденилирования белками MccB своих пептидных субстратов анализировали с помощью обратно-фазовой С-18 ВЭЖХ. Из реакционных смесей предварительно удаляли белки путем осаждения подкисленным ацетонитрилом (к реакционной смеси добавляли равный объем охлажденного 100% ацетонитрила с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты, тщательно перемешивали и инкубировали смеси на льду в течение 10 минут, после чего отделяли белковый осадок от растворимой пептидной фракции центрифугированием при 30000g, +4оС в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирали в чистую пробирку и сушили с помощью вакуумного роторного испарителя SpeedVac. Осадки перерастворяли в mQ). Разделение продуктов реакции проводили с помощью ВЭЖХ хроматографа Breeze (Waters) с использованием С-18 хроматографической колонки (4.6x150 мм, XSELECT HSS C-18 3.5 мкм, Waters) при скорости тока растворителя 2 мл/мин и градиенте растворителя 0-10% Б в течение 10 мин., затем 10-50% Б за 40 мин. (растворитель A: 0,1% трифторуксусная кислота; растворитель Б: 100% ацетонитрил). Соответствие хроматографических пиков продуктам и реагентам реакции проверяли с помощью масс-спектрометрии.
Для аналитических целей мы использовали прибор Милихром-02 (Эконова). Разделение проводили на С-18 колонке (2х75 мм, заполненной сорбентом ProntoSIL 120-5-C18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Gerte GmbH, Германия)) при скорости тока растворителя 150 мкл/мин. (растворитель A: 0,005 М HClO4, 0,2 M LiClO4; растворитель Б: 100% ацетонитрил). Анализ хроматографических пиков проводили с помощью ПО Мультихром (Эконова).
Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ
Возможно, это связано с необходимостью транспорта из клетки-продуцента Synechococcus sp. микроцина, длина пептидной части которого значительно превышает «стандартные» семь аминокислотных остатков. В опероне генов синтеза микроцин С-подобного соединения синенококка также присутствуют гены гомологичные генам mccD и двум доменам mccE E. coli. Мы предполагаем, что пептид МссА из организма Synechococcus sp. помимо аденилирования ферментом МссВ, подвергается также дальнейшим пост-трансляционным модификациям, например, аминопропилированию, повышающими базовый уровень активности. В недавно опубликованной работе Паз-Йепес (Paz-Yepes) и соавторов было продемонстрировано, что штамм Synechococcus sp. CC9605, геном которого кодирует гены синтеза микроцин-подбного соединения, ингибирует рост двух других штаммов рода Synechococcus, не содержащих таких генов. Мутации в генах mccA и mccB снимают ингибирование [70]. Synechococcus sp. CC9605 устойчив к действию микроцина С E. coli. В свою очередь клетки синенококков, чувствительные к микроцину С E. coli, т.е. не содержащие генов синтеза микроцина, при трансформации генетической конструкцией, кодирующей микроциновый оперон Synechococcus sp. CC9605, приобретают устойчивость к микроцину С E. coli. Также эти штаммы становятся устойчивыми к угнетающему их рост действию Synechococcus sp. CC9605 [70]. Опубликованные в этой работе данные еще раз подтверждают верность сделанных нами предположений о физиологической функции ортологов генов синтеза микроцина С, как инструмента внутри- и межвидовой борьбы бактерий. Тем не менее, наши попытки идентифицировать с помощью MALDIOF анализа масс-пик, соответствующий микроцин С-подобному соединению, в культуральных средах из Synechococcus sp. CC9605 закончились неудачей. Возможно, это связано с тем, что удлиненный микроциновый пептид-предшественник МссА синенококка в процессе созревания антибиотика подвергается дополнительным пост-трансляционным модификациям, включающим и протеолитическую деградацию его пептидной части, а конечный продукт имеет значительно меньшие размеры, по сравнению с размерами исходного пептида. Согласно результатам биоинформатического анализа, белки группы MccB/PaaA, которые, вероятно, способны аденилировать небольшие пептидные субстраты, широко распространены среди различных таксономических групп бактерий, в том числе паразитов человека, растений и животных (Рисунок 35). Тем не менее, мы не исключаем, что в наше филогенетическое древо не попали некоторые представители таких ферментов, по причине сильной дивергенции и отсутствия в открытых базах данных нуклеотидных последовательностей прилегающих к кодирующим их генам. Мы предполагаем, что некоторые из обнаруженных нами коротких пептидов (представлены на рисунке 35), содержащих остатки аспарагина, являются субстратами для соответствующих ферментов группы MccB/PaaA. Такие пептиды кодируются короткими генами, расположенными в непосредственной близости от генов, кодирующих белки MccB/PaaA. Одним из способов экспериментального подтверждения правильности биоинформатического предсказания может служить описанный нами энзиматический метод проверки специфичности субстрат-ферментной пары предполагаемых гомологов MccB-MccA in vitro. Тем не менее, для многих представителей группы MccB/PaaA, приведенных на филогенетическом дереве, нам не удалось идентифицировать гены, которые могли бы кодировать потенциальные пептидные субстраты. Это может быть связано с тем, что в некоторых случаях аденилирование может осуществляться по другой аминокислоте, отличной от аспарагина, или же тем, что ОРС пептидного субстрата расположена вне предполагаемого оперона в другом месте генома. Такой случай отсутствия сцепленности генов пептидного субстрата и фермента модификации был описан для тиазол-содержащего бактериоцина бацилл [33].
Белок МссВ E. coli - это представитель Е1-суперсемейства, характерной особенностью которого является Е1-укладка, представляющая собой модифицированную укладку Россманна (Рисунок 20). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ, протестированных в нашей работе, показал, что именно Е1-домен, ответственный за связывание АТФ, является наиболее консервативной частью этих белков. Следует отметить, что белок МссВ E. coli не проявляет сродства к другим нуклеотидам, отличным от АТФ (данные не представлены), в то время как ортологи МссВ из Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis способны с разной степенью эффективности использовать в качестве субстратов нуклеозид трифосфаты, отличные от АТФ (Дубилей С.А., личное сообщение). При анализе аминокислотных выравниваний ортологов МссВ, нам не удалось обнаружить значимых замен, изменяющих консервативные участки, ответственные за связывание нуклеотидов, которые могли бы обеспечивать способность ортологов МссВ Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis взаимодействовать с другими нуклеотидами. Чтобы дать ответ на этот вопрос, потребуются дополнительные исследования, включая структурный анализ.
Белок МссВ E. coli и родственные белки обладает рядом уникальных свойств, что позволяет выделить их в отдельную группу среди белков Е1-суперсемейства. Самой значимой отличительной особенностью является наличие домена "пептидные клещи", принимающего участие в связывании пептидного субстрата МссА [76]. Этот домен формируется за счет N-концевого участка белка МссВ и части кроссоверной петли (Рисунок 36). Аналогичные структуры отсутствуют у характерных представителей прокариотической ветви белков Е1-суперсемейства, таких как ThiF и MoeB (Приложение: Рисунок 1). На основании выравнивания аминокислотных последовательностей белков, протестированных в этой работе, их можно разделить на две группы: 1) ортологи МссВ, использующие в качестве субстрата гептапептиды, в эту группу входят белки, закодированные в геномах B. washoensis, S. thermophilus, L .johnsonii и на плазмидах E. coli и H. pylori; 2) ортологи МссВ, использующие в качестве субстрата удлиненные аналоги МссА, закодированные в геномах Synechococcus sp. и Y. pseudotuberculosis.
