Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Саркотоксин IA 7
1.1.1. Саркотоксин IА - представитель семейства цекропинов 7
1.1.2. Структура и физические свойства пептида 8
1.1.3. Биологическая роль и механизм действия пептида 11
1.1.4. Синтез и выделение пептида 14
1.2. Гибридные белки 16
1.2.1. Структура гибридного белка 16
1.2.2. Регуляция уровня экспрессии рекомбинантного белка в клетках Escherichia col і 26
1.3. Зеленый флуоресцентный белок 46
1.3.1. Структура белка и образование хромофора 46
1.3.2. Мутантные варианты GFP и их спектрофотометрические свойства 48
1.3.3. Физико-химические свойства белка 53
1.3.4. Экспрессия GFP 56
1.3.5. Выделение GFP 59
Глава 2. Материалы и методы 61
2.1. Материалы 61
2.2. Методы исследования 61
2.2.1. Создание генно-инженерных конструкций 61
2.2.2. Продукция гибридных белков в клетках Е. coli 66
2.2.3. Выделение, ренатурация и очистка гибридных белков 66
2.2.4. Определение функциопалыюй активности и количества продукта 69
2.2.5. Ограниченный протеолиз 71
2.2.6. Иммуноблотинг 71
2.2.7. Аминокислотный и масс-спектрометрический анализ пептидов 72
2.2.8. Синтез гибридного белка Sarc-Ob in vitro 72
Глава 3. Результаты и обсуждение 73
3. 1. Влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro 73
3. 1.1, Изучение процесса протеолнтической деградации GFP-Ob in vitro 73
3. 1.2. Изучение процесса протеолнтической деградации GFP-Ob in vivo 78
3.2. Изучение влияния свойств белка-партнера и положения целевого пептида на синтез полноразмерного гибрида 81
3.2.1. Глутатион-Б-трансфераза - саркотоксин 82
3.2.2. Саркотоксин - обелин 83
3.2.3. Зеленый флуоресцентный белок - саркотоксин 84
3.3. Разработка метода вьщеления низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP 84
3.3. 1. Создание и синтез гибридных белков в клетках Е. coli 85
3.3.2. Выделение EGFP-PDEy 87
3.3.3. Выделение EGFP-Sarc, EGFP-Th и BCCP-EGFP 88
3.4. Биосинтез и выделение рекомбинантного саркотоксина IA из клеток Е. coli 93
3.4.1. Синтез рекомбинантного саркотоксина in vitro 93
3.4.2. Очистка и характеристика рекомбинантного саркотоксина 95
Заключение 99
Выводы 100
Список литературы 101
- Регуляция уровня экспрессии рекомбинантного белка в клетках Escherichia col і
- Определение функциопалыюй активности и количества продукта
- Изучение влияния свойств белка-партнера и положения целевого пептида на синтез полноразмерного гибрида
- Разработка метода вьщеления низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP
Введение к работе
Актуальность проблемы. Низкомолекулярные полипептиды — высокоактивные органические соединения, широко распространенные в живых организмах и выполняющие разнообразные, как правило, регулягорные функции. Для проявления функциональной активности достаточны следовые количества вещества. Однако для изучения физико-химических свойств и механизма действия пептидов требуются значительные количества высокоочищенного препарата. Низкое содержание пептидов в природных объектах требует разработки новых более продуктивных методов их получения. В настоящее время подавляющее большинство рекомбинантных белков и полипептидов получают культивированием генетически трансформированных микроорганизмов, чаще всего клеток Escherichia coli. Однако биосинтез низкомолекулярных полипептидов в чужеродных клетках зачастую сопряжен с рядом трудностей: низкой устойчивостью гетерологичных пептидов к действию внутриклегочньж протеаз, а также сложностью их последующего выделения из грубого клеточного лизата. Отсутствие в клетке подходящих условий для образования упорядоченной структуры полипептида ведет к его частичной или полной деградации в процессе синтеза. Отсутствие репоргерной и лиганд-связывающей активности осложняет подбор оптимальных условий для биосинтеза и выделения продукта. Более того, пептиды, обладающие антимикробным действием, могут оказывать отрицательное влияние на рост клеток-хозяев.
Включение целевого полипептида в состав гибридного белка на основе высокоэкспрессируемого белка-партнера — одно из возможных решений проблемы получения полноразмерного продукта в чужеродных клетках. Белок-партнер обеспечивает не только суперэкспрессию целевого пептида, но и возможность его последующего выделения. Несмотря на очевидные преимущества включения пептида в состав гибридного белка, успех синтеза во многом определяется структурой молекулы гибридного белка (положением пептида в молекуле, структурой аминокислотного линкера) и свойствами белка-партнера. Эти обстоятельства придают актуальность изучению влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность молекулы, а также поиску оптимального
белка-партнера, обеспечивающего высокую экспрессию, легкую идентификацию и эффективную очистку синтезируемого продукта.
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из Aequorea victoria, широко используемый в качестве репортерного белка, соответствует требованиям, предъявляемым к белку-партнеру: устойчив к действию внутриклеточных протеаз и хаотропных агентов, легко детектируется, экспрессируется с высокой эффективностью в различных организмах и клетках, в том числе в клетках Е. coli, экстрагируется органическими растворителями без потери функциональной активности. Эти свойства благоприятствуют использованию GFP не только в качестве репортерного белка, но и в качестве белка-партнера для биосинтеза и выделения низкомолекулярных полипептидов.
Цель диссертационной работы заключалась в изучении влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность гибридной молекулы и разработке нового эффективного метода выделения полипептидов. Были поставлены следующие задачи:
изучить влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность
гибридного белка in vivo и in vitro;
изучить зависимость эффективности биосинтеза целевого продукта от свойств
используемого белка-партнера и положения пептида в молекуле гибрида;
разработать новый метод очистки полипептидов в составе гибрида, используя
экстракционные свойства GFP;
разработать эффективный способ синтеза и выделения функционально активного
антибактериального пептида саркогоксина IA из клеток Е. coli.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе представлен новый метод очистки низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP с использованием двухфазной системы разделения.
Изучены особенности синтеза рекомбинантного саркогоксина IA в составе различных гибридных белков: глутатион-8-трансфераза-саркотоксина (GST-Sarc), саркотоксин-обелина (Sarc-Ob), зеленого флуоресцентного белка-саркотоксина
(EGFP-Sarc) в клетках Е. coli. Впервые предложен высокоэффективный способ получения функционально активного саркотоксина IA из прокариотических клеток.
Выявлена зависимость протеолитической деградации гибридных белков in vivo и in vitro от структуры аминокислотного линкера, функциональных свойств белка-партнера и положения целевого пептида в молекуле гибрида. Полученные результаты могут быть использованы при создании новых гибридных конструкций.
Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены на 9-м международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Marine Biological Laboratory, Woods Hole, 1996), на IV чтениях, посвященных памяти ЮА. Овчинникова (Пущино, 1998), на IV Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 1999), на отчетной конференции по биоорганической химии (Пущино, 1999), на V чтениях, посвященных памяти ЮА. Овчинникова (Пущино, 2000), на IX международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2002» (Москва, 2002).
По материалам диссертации опубликовано 11 работ в отечественной и зарубежной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах, содержит 27 рисунков и 17 таблиц. Библиографический указатель содержит 343 источников литературы.
Регуляция уровня экспрессии рекомбинантного белка в клетках Escherichia col і
Выбор экспрессирующей системы (клетки бактерий, дрожжей, насекомых, позвоночных [94, 95]) зависит от многочисленных факторов: уровня экспрессии белка, характеристик клеточного роста, возможности посттрансляционной модификации белка в клетке, токсического действия экспрессируемого продукта на клетку-хозяина, экономического фактора [96] и т.д. Всесторонняя изученность генетики, молекулярной биологии и биохимии клеток Escherichia coli дает огромное преимущество в использовании данного организма в качестве экспрессирующей системы. В настоящий момент в клетках Е. coli синтезировано значительное количество рекомбинантных белков эукариотического происхождения, что также подтверждает целесообразность их использования.
Однако, несмотря на всестороннюю изученность биологии Е. coli, не каждый ген может быть эффективно экспрессирован в данном типе клеток. Это обстоятельство связано с уникальными тонкими структурными свойствами гена, стабильностью и трансляционной эффективностью мРНК, протеолитической устойчивостью белка к клеточным протеазам, потенциальной токсичностью белка. Значительными недостатками использования Е. coli являются: отсутствие возможности посттрансляционной модификации эукариотических белков, отсутствие механизмов секреции для эффективного транспорта белков в культуральную среду, ограниченная возможность образования дисульфидных связей. Тем не менее, соблюдение некоторых эмпирических правил ограничивает появление непредсказуемых моментов при экспрессии рекомбинантных белков в клетках Е. coli.
Плазмида, несущая ген гибридного белка, содержит ряд элементов, критически влияющих на уровень синтеза белка [97]. Основные элементы экспрессирующего вектора, характерные для клеток Е. coli, представлены на рисунке 7. Промотор локализован примерно на 10-100 п.п. выше рибосом-связывающего участка и находится под контролем регуляторного гена, который может быть представлен в самом векторе или интегрирован в хромосому клетки хозяина. Промоторы, представленные в клетках Е. coli, содержат две иуклеотидные последовательности из шести оснований. Эти последовательности разделены коротким нуклеотидным линкером (рис. 7). Расстояние от точки инициации транскрипции до промотора фиксировано и равно соответственно 35 и 10 п.п. вверх от точки инициации. Существует значительное количество промоторов, подходящих для экспрессии генов в клетках Е. coli, включая промоторы из грамм-положительных бактерий и бактериофагов (табл. 4). Используемые промоторы должны обладать несколькими важными свойствами: быть сильными и обладать при этом низким уровнем базалыюй экспрессии; легко трансфецироваться в различные штаммы Е. coli; их индукция должна быть простой и экономически выгодной.
Ниже по нуклеотидной последовательности от промотора находится рибосом-связывающий участок (рис. 7). Он охватывает участок приблизительно равный 54 нуклеотидам от -35(±2) до +19-+22, частично включая последовательность, кодирующую мРНК. Участок Шайиа-Дальгарно (SD) взаимодействует с 3 концом 16S рРНК во время инициации трансляции. Расстояние между участком SD и стартовым кодоном, варьирующее от 5 до 13 пар нуклеотидов, препятствует образованию вторичной структуры мРНК транскрипта, которая препятствует эффективной инициации трансляции.
Терминатор транскрипции располагается за кодирующей последовательностью (рис. 7). Он управляет окончанием транскрипции и, кроме того, является защитным элементом, предостерегающим мРНК от нуклеазной активности, продлевая тем самым время жизни мРНК. Помимо вышеописанных элементов, имеющих прямое отношение к эффективности экспрессии гена, вектор содержит ген, отвечающий за резистентность клетки хозяина к антибиотику. Наличие данного гена способствует селективному отбору клеток, содержащих соответствующий ген резистентности.
Количество копий плазмиды определяется начальным участком репликации (Огі). Использование неконтролируемых ОгІ приводит к сильному увеличению количества копий плазмид с сопутствующим увеличением выхода синтезируемого белка [98], что, с другой стороны, может вести к снижению роста и гибели клеток [ 99 ].
Промотор должен обладать рядом характеристик, обеспечивающих высокий уровень синтеза белка [100]. Во-первых, он должен быть сильным, т.е. приводить к накоплению высокого количества целевого белка (10-30% и более от всего клеточного белка).
Во-вторых, он должен иметь минимальный уровень базальной транскрипции. Не полностью репрессированная система экспрессии может приводить к дестабилизации плазмиды, уменьшению скорости клеточного роста и, как следствие, к потере возможности синтеза рекомбинантного белка. Отсутствие базальной транскрипции промотора позволяет клеткам достичь высокой плотности [100]. Жесткая регуляция промотора является основным фактором при синтезе белков, имеющих губительное влияние на клетку хозяина [101]. Например, токсичный белок из ротавируса VP7 убивает клетку хозяина и может быть синтезирован только при жестко контролируемых условиях
Определение функциопалыюй активности и количества продукта
Флуоресцентную активность зеленого флуоресцентного белка определяли на спектрофлуориметре (Jasco 821 FP, Япония) при длинах волн возбуждения 395 нм и испускания 510 нм. Концентрацию гибридного белка определяли по величине поглощения активного EGFP при 488 нм на спектрофотометре S1000-10 (Ocean Optics, Inc., США), используя коэффициент поглощения Ei88 55,900 М cm" [ 336 ], Для определения люминесцентной активности обелинового модуля гибридных белков отбирали аликвоту (2-5 мкл) анализируемого раствора и добавляли к 100 мкл активирующего буфера: 50 мМ Трис, рН 7.1, 500 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ р меркаптоэтанола, 1 мг/мл БСА, 80 мкМ целентеразина. Полученную смесь инкубировали в течение ночи при температуре +4С. 1 -5 мкл смеси переносили в кювету биолюминометра (Наука БЛМ 8802, Красноярск), уже содержащую 200 мкл буфера: 100 мМ Трис, рН 8.8, 10 мМ ЭДТА. Люминесценцию инициировали добавлением 50 мкл 200 мМ СаСІг. К смеси 880 мкл ЩО, 100 мкл 1 М фосфата калия, рН 6.5 и 10 мкл 1-хлор-2,4- динитробензола в этаноле было добавлено 10 мкл 100 мМ раствора восстановленного глутатиона. Далее к 490 мкл приготовленного раствора был добавлен анализируемый образец белка до 50 мкл и перемешан в кварцевой кювете. В течение 5 минут при комнатной температуре была измерена оптическая плотность раствора при 340 нм с использованием спектрофотометра S1000-10 (Ocean Optics, Inc., США). В составе гибридного белка саркотоксин не проявлял антибактериальной активности, поскольку не влиял на скорость клеточного роста. Биологическую активность хромато графических фракций (ЖХВД) определяли в биотесте на клетках Bacillus megaterium VKM 41 (рис. 26). К агаризованной среде (LB-arap) при 40-45С добавляли суспензию клеток В. megaterium из расчета 2x105 CFU/мл и помещали в чашки Петри. Затем, в луики, проделанные в агаризованной среде после 30-минутного охлаждения, вносили по 50 мкл образца анализируемой фракции. Клетки инкубировали в течение ночи при 37С, О токсическом эффекте вещества судили по образованию зоны лизиса. В качестве контроля использовали канамицин (Km) - 2 мкг/мл.
Минимальная ингибирующая концентрация саркотоксина была определена для клеток Bacillus megaterium VKM 41, Pseudomonas aeruginosa PAOl и Escherichia col і C600. Свежую бактериальную культуру (100 мкл; 107 CFU/мл) добавляли к 1 мл стерильной среды, содержащей ряд последовательных разведений саркотоксина. Контрольная проба не содержала пептида. Клетки инкубировались при постоянном перемешивании при 37С. Минимальную ингибирующую концентрацию саркотоксина определяли по снижению оптической плотности тестируемых клеток в сравнение с контролем. Количество суммарного белка определяли по методу Брэдфорда [337], используя в качестве стандарта BSA. Ограниченный протеолиз гибридных белков GObl-GOb3 трипсином проводили при соотношении фермента и субстрата 1:25 (по весу) при температуре 4С в буферном растворе: 20 мМ Трис, рН 7.8, 5 мМ СаСЬ, 500 мМ NaCl, 5 мМ р-меркаптоэтанол. Останавливали протеолиз через 10, 30, 60, 120, 180 и 1440 мин добавлением буфера Лэммли [338] и прогреванием образцов в течение 2 мин при 90С Синтез белков в клетках, выращенных при 37С до оптического поглощения OEsoo 0.5, индуцировали добавлением ИПТГ до конечной концентрации 0.5 мМ. Дальнейшее культивирование продолжали при 25С. Аликвоты клеточной суспензии (0.07 OEsoo) отбирали через 0.5, 1, 2, 3 и 4 ч после начала индукции, осазщали центрифугированием, суспендировали в буфере Лэммли, прогревали в течение 2 мин при 90С, и полученный таким образом лизат подвергали электрофоретическому разделению в градиентном (9-25%) ПААГ. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроблотингом с использованием прибора SEMI-PHOR ТЕ70 (Hoefer scientific instruments, США) при 0.8 мА/см в течение 90 мин. Нитроцеллюлозную мембрану последовательно обрабатывали: 1. 1% БСА в буфере TBS (20 мМ Трис, рН 7.4, 150 мМ NaCl) в течение 30 мин при комнатной температуре; 2. кроличьими поликлональными антителами против GFP (20 мкг/мл) в буфере TBS с 0.1% Твин 20, в течение 1 ч при 37С; 3. антителами против IgG кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 в TBS с 0.1% Твин 20, в течение 45 мин при 37С; После каждой обработки нитроцеллюлозную мембрану отмывали не менее 5-ти раз буфером TBS, 0.1% Твин 20. Нитроцеллюлозную мембрану окрашивали 0.04% хлорнафтолом. Иммуноблоты переводили в цифровую форму сканированием на OpticPro 9630Р (Plustek, США). Графический профиль окрашенных полос получали с помощью программы Scion Image (http://www.scioncorp.corn). Дальнейший расчет площадей пиков проводили в программе Microcal Origin (http://www.microcal.com). Саркотоксин, предшественник тахиплезина, фрагмент у субъединицы фосфодиэстеразы были получены в результате химического гидролиза соответствующего гибридного белка BrCN и очищены с использованием ЖХВД. Масс-спектры (MALDI) были сняты на массепектрометре Vision 2000 (Therm0ВІ0Analyses, Англия). Пептиды (10-30 пмол в 50 мкл) были нанесены в лунки платы с 2,5-дигидробензойной кислотой в качестве матрицы. ЛГ-концевая аминокислотная последовательность BCCP-EGFP, yPDE фрагмента, тахиплезина и саркотоксина была определена по методу Эдмана на секвенаторе Applied Biosystem 477А. Количество очищенного саркотоксина было определено с помощью аминокислотного анализатора Biotronik LC 5000 (Germany). Ген гибридного белка саркотоксин-обелин был сконструирован следующим образом. С-концевой участок гена саркотоксина, вырезанного из плазмиды pDSlO, был модифицирован с помощью ПЦР замещением стоп кодона на ATG кодон и образованием сайта рестрикции Clal. После определения пуклеотидной последовательности ПЦР продукта, ген саркотоксина был клонирован в вектор pGcm (Promega, США). Ген обслина был вставлен в плазмиду по сайтам рестрикции Clal и Sphl. Результирующая плазмида была названа pS013. Синтез матричной РНК in vitro проводили, как описано в статье [339], Для трансляции мРНК in vitro использовали экстракт из зародышей пшеницы (BBL, Латвия) [334]. Для разделения и анализа синтезированных полипептидов использовали ДСН ПААГ. Через 60 минут после инициации трансляции 5 мкл реакционной смеси, содержащей радиоактивно меченные по лейцину [14C]Leu белки, подвергали электрофоретическому разделению. По окончании электрофореза, гель был окрашен, высушен и помещен на рентгеновскую пленку. Участки геля, соответствующие радиоактивным белковым полосам на пленке были вырезаны и помещены в раствор абсолютного этанола на ночь. Радиоактивность образцов была определена с использованием смеси толуол-РОР-РОРОР. Расчет количества синтезированного de novo белка, реактивацию апообелина и измерение люминесценции проводили как описано выше (определение функциональной активности обелина).
Изучение влияния свойств белка-партнера и положения целевого пептида на синтез полноразмерного гибрида
В процессе биосинтеза рекомбинантного саркотоксина (рис. 18) было обнаружено, что наряду с линкером критическое влияние на синтез полноразмерного продукта оказывает положение целевого пептида в молекуле гибрида и физические свойства, используемого белка-партнера.
Саркотоксин IA крайне неустойчив к действию сериновых протеаз и не имеет упорядоченной структуры в водном растворе. Кроме того, пептид высокотоксичен и обладает широким спектром действия как на грам-положительные, так и на грам-отрицательные бактерии, что усложняет задачу получения полноразмерного пептида в клетках Е. coli.
С целью оптимизации биосинтеза пептида in vivo ген рекомбинантного саркотоксина был слит в единой рамке считывания с генами белков, обладающих высокой экспрессией в клетках Е. coli. Были созданы химерные генные конструкции, кодирующие следующие белки: глутатион-8-трансфераза-саркотоксин (GST-Sarc), саркотоксин-обелин (Sarc-Ob), зеленый флуоресцентный белок-саркотоксин (GFP-Sarc) (табл. 12). Все используемые белки-партнеры хорошо экспрессируются в клетках Е. coli. Кроме того, наличие репортерной активности позволяет дополнительно осуществлять контроль за процессом биосинтеза и выделения белка.
Глутатион-8-трансфераза (GST), широко используемая в качестве белка-партнера, обеспечивает высокий уровень экспрессии гибридного белка и способствует его накоплению в растворимом виде в цитоплазме клеток. Аффинная хроматография с использованием глутатион-сефарозы позволяет свести процесс выделения GST содержащего продукта к одному этапу.
Ген саркотоксина был клонирован в единой рамке считывания с С-концевой последовательностью GST, используя коммерчески доступный вектор. Как ожидалось, гибридный белок GST-Sarc аккумулировался в клетках в растворимом виде (рис. 18А). Однако уровень его экспресси не был высоким. Только небольшая фракция экспрессируемого продукта содержала полноразмерный пептид. Мажорной полосе соответствовал продукт с молекулярным весом в 24.0 кДа, принадлежащий модулю GST (рис. 18А).
Результат последующей очистки белка на глутатион-сефарозе подтвердил, что значительная часть гибридного белка деградирует в клетках до GST (рис. 18А). В процессе выделения гибридный белок подвергался дальнейшему протеолизу, несмотря на присутствие в растворе ингибиторов протеаз, результатом чего явилось снижение доли полноразмерного белка и увеличение доли протеолитически стабильного GST. Обработка очищенного белка тромбином привела к полному расщеплению GST-Sarc и деградации саркотоксина. Таким образом, глутатион-5-трансфераза, способствующая накоплению гибридного белка в растворимом виде, не пригодна для биосинтеза рекомбинантного саркотоксина в клетках Е. colu Было предположено, что включение пептида в состав гибридного белка на основе белка-партнера, образующего в клетках E.coli тела включения, позволит избежать преждевременной деградации саркотоксина. Ранее было показано, что люминесцентный белок обелин из семейства кальций-связывающих фотобелков синтезируется в клетках Exoli с образованием тел включения и легко может быть переведен в активную форму при инкубации с субстратом. Однако только Л -концевая часть обелина может быть использована для создания гибридного белка, поскольку для проявления функциональной активности ему необходим свободный С-концевой участок [93 ].
Химерный ген sarc-ob, также как и gst-sarc, хорошо экспрессировался в клетках Exoli. Практически весь синтезированный белок аккумулировался в клетках в виде тел включения. Согласно результатам электрофоретического разделения (рис. 18Б), выделенный белковый препарат соответствовал по молекулярному весу гибридному белку Sarc-Ob и обладал люминесцентной активностью обелина. Однако последующий аминокислотный анализ iV-концевой последовательности белка показал, что более 80% продукта укорочено на 4 или 8 аминокислотных остатков, необходимых для проявления антибактериальной активности саркотоксина. Поскольку в составе тел включения белок устойчив к протеолизу (например, GOb3), деградация саркотоксинового модуля, вероятно, происходит котрансляционно. Незащищенный -концевой гидрофильный участок пептида подвергается действию внутриклеточных протеаз, что приводит к значительному снижению доли полноразмерного саркотоксина. Таким образом, введение пептида в N-концевое положение молекулы крайне нежелательно даже в составе гибридов на основе белков-партнеров, склонных к образованию нерастворимых агрегатов.
В отличие от обелина GFP позволяет создавать гибридные конструкции как с N-, так и С-концевым положением целевого пептида без потери функциональной активности GFP. Более того, при оптимальной температуре культивирования клеток Е. coli (37С), гибридные белки на основе GFP обычно образуют тела включения (например, GObl-GOb3). Учитывая результат синтеза саркотоксина в составе конструкции sarc-ob, ген пептида был слит с С-концевым участком гена egfp. Полученная в результате клонирования генетическая конструкция egfp-sarc хорошо экспрессировалась в клетках Е. coli, а продукт экспрессии накапливался в составе тел включения (рис. I8B). Незначительная часть синтезируемого белка находилась в растворимой фракции клеток и обладала флуоресценцией GFP. Электрофоретический анализ белка, выделенного из клеточного лизата органической экстракцией, показал, что данная фракция белка содержит протеолитически деградированный по модулю саркотоксина продукт (рис. 18В, дорожка 10). Напротив, в составе тел включения преобладал полноразмерный гибридный белок (рис. 18В, дорожка 9). В результате перемещения пептида в С-концевое положение молекулы гибрида на основе протеолитически устойчивого зеленого флуоресцентного белка был получен полноразмерный пептид саркотоксина (см. ниже)
Разработка метода вьщеления низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP
Саркотоксин - антибактериальный пептид, вырабатываемый личинками мух (Sarcophaga peregrina) в ответ на бактериальное заражение. Саркотоксин образует две амфифильные а-спирали в метаноле или в водном растворе лизо-фосфатидил холина, имитирующем условия мембранного окружения. Однако в водном растворе пептид не имеет упорядоченной структуры. Высокое содержание положительно заряженных аминокислотных остатков в составе саркотоксина делает его высокочувствительным к действию сериновых протеаз, которыми богаты клети Е. coli.
Тахиплезин, другой представленный нами антибактериальный пептид, обнаружен в гемоцитах японского краба {Tachypleus tridentatus) [340]. Хотя он представляет собой короткий полипептид, для формирования нативнои структуры необходимо образование двух дисульфидных связей. Цинк-связывающий фрагмент у-субъединицы зрительной фосфодиэстеразы в отсутствии ионов Zn2+ не имеет упорядоченной структуры [341 ].
Отсутствие в клетках Е. coli благоприятных условий для образования протеолитически устойчивой нативнои структуры пептидов, а также возможное отрицательное влияние пептидов на рост клеток-хозяев, ставит под сомнение возможность синтеза продукта в бактериальных клетках. Напротив, EGFP прекрасно синтезируется в Е. coli и устойчив к протеолизу как in vivo, так и in vitro. Вероятно, включение пептида в состав гибридного белка на основе GFP благоприятно отразится на синтезе целевого полноразмерного пептида.
Как и предполагалось, гибридные белки на основе GFP (рис. 19) активно экспрессировались в клетках Е. coli (рис. 20) и за исключением BCCP-EGFP аккумулировались в телах включения. Гибридные белки растворимой фракции полностью деградировали по модулю пептида. В составе тел включения GFP не обладал флуоресценцией ни в одной из гибридных конструкций. Последующая ренатурация белков in vitro приводила к восстановлению или образованию de novo флуоресценции GFP.
Общая схема очистки белка соответствовала ранее описанному методу выделения GFP, тогда как условия очистки несколько отличались от условий оригинального метода. В отличие от гибридных белков GObl-GOb3, содержащих дикий тип GFP, для разработки метода выделения пептидов мы использовали мутированную форму GFP (EGFP). EGFP содержит две мутации в области хромофора (F64L, S65T). Единственная замена F64L ведет к увеличению доли структурированного, функционально активного в клетке белка и способствует его эффективной ренатурации in vitro из тел включения. Замена S65T приводит к изменению спектральных характеристик GFP (сдвигу максимума поглощения). Несмотря на значительное изменение физических свойств белка, данные аминокислотные замены не влияли на экстракционные свойства EGFP.
После ренатурации EGFP-PDEy экстрагировался этанолом подобно GFP. Более 80% гибридного белка с нативной конформацией EGFP переходило в спиртовую фазу. Изменение величины рН раствора сульфата аммония в диапазоне физиологических значений (от б до 8) заметно не отражалось на количестве экстрагируемого белка. Тем не менее, наблюдалось снижение флуоресценции при рН ниже 8.0, что объясняется оптическими свойствами EGFP. рН - зависимое протонирование гидроксилыюй группы хромофорообразующей аминокислоты Туг-бб отражается на величине коэффициента экстинкции EGFP.
При добавлении и-бутанола к этанолыюй фазе GFP вытеснялся в водную фазу. Однако, в условиях полного перехода GFP в водную фазу, более 60% флуоресцентного EGFP-PDEy продукта оставалось в органической фазе. С увеличением ионной силы раствора, при минимальном перераспределении суммарного белка, увеличивалась фракция флуоресцентно активного гибридного белка, экстрагируемого в водную фазу (рис. 21). При 0,5 М концентрации NaCl значительная часть гибрида все еще остается в органической фазе, а также включается в интерфазу. Дальнейшее увеличение концентрации соли (до 1,5 М) ведет к полному переходу флуоресцентного белка в водную фазу. Образующаяся при этом плотная интерфаза не флуоресцирует и имеет белую окраску, что свидетельствует об оптимальных условиях реэкстракции.
После дополнительной хроматографической очистки EGFP-PDEy от примесей органических растворителей на колонке с Butyloyopearl было получено вещество 90% Чтобы оценить влияние модуля полипептида на экстракцию гибридного белка, условия выделения EGFP-Sarc and EGFPh полностью соответствовали оптимальным условиям выделения EGFP-PDEy. Как и в предыдущем случае, полипептиды гибридных белков EGFP-Sarc and EGFPh имели С-концевое положение. EGFP-Sarc, включая аминокислоты линкера, содержал самый короткий полипептид (рис. 19). Однако, несмотря на размер пептида, конечный выход белка оказался наименьшим (табл. 13). Вероятно, амфифильная структура пептида, образующаяся в органическом окружении, препятствует переходу гибридного белка из одной фазы в другую. Подобно амфифильным интегральным мембранным белкам саркотоксин в составе гибридного белка размещался на границе раздела фаз. Действительно, в процессе экстракции на границе раздела фаз образовывалась плотная флуоресцирующая интерфаза, содержащая гибридный белок. Дополнительным доказательством влияния структуры пептида на экстракцию гибрида является тот факт, что протеолитический фрагмент с удаленным С-концевым доменом саркотоксина свободно перемещался из водной фазы в органическую и обратно (рис. 18В, дорожка 10). Сравнительно невысокий выход EGFPh (15-18%) вероятно также связан со структурными свойствами предшественника тахиплезина. Для образования плотной конформации пептида необходимо наличие двух дисульфидных связей, отсутствие которых может препятствовать экстракции гибридного белка. Несмотря на невысокий выход EGFP-Sarc и EGFPh, чистота белков как и в случае EGFP-PDEy была от 80 до 90% (табл. 13, рис. 22 и 23).
