Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Физиология, распространение и видовое разнообразие бактерий рода Geobacillus 11
1.2. Биотехнологический потенциал бактерий рода Geobacillus 14
1.3. Молекулярно-биологические методы, используемые в таксономии бактерий и изучении микробных сообществ 19
1.4. Гены ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий 30
1.4.1. Система окисления н-алканов у Pseudomonas putida GPo1 30
1.4.2. Организация alk генов у других грамотрицательных бактерий – 37 деструкторов н-алканов .
1.4.3. Организация генов деградации н-алканов у грамположительных бактерий 39
1.5. Строение и функции гиразы и топоизомеразы IV у бактерий 43
1.6. Заключение по обзору литературы 46
Экспериментальная часть 50
2. Объекты и методы исследования 50
2.1. Бактериальные штаммы 50
2.2. Состав сред и условия культивирования бактерий рода Geobacillus 51
2.3. Выделение ДНК и РНК 52
2.4. Обратная транскрипция 54
2.5. Создание праймеров, специфичных к генам gyrB и parE 54
2.6. Амплификация генов 16S рРНК, gyrB, alkB и раrЕ 55
2.7. Клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов 57
2.8. Филогенетический анализ полученных последовательностей и построение филогенетических деревьев 58
2.9. Использование ПЦР в режиме реального времени для изучения синтеза мРНК генов alkB 58
3. Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1. Определение первичной структуры генов гиразы (gyrB) и топоизомеразы IV (parE) у бактерий рода Geobacillus 60
3.2. Идентификация представителей рода Geobacillus на основе сравнительного филогенетического анализа генов 16S рРНК и генов gyrB и топоизомеразы IV и оценка возможности использования последних для таксономии геобацилл 65
3.3. Поиск генов ферментативной системы биодеградации н-алканов у бактерий рода Geobacillus и определение первичной структуры алкан-гидроксилаз 74
3.3.1. Амплификация и сравнительный филогенетический анализ генов alkB геобацилл 74
3.3.2. Анализ нуклеотидного состава alkB-генов и использования кодонов 80
3.4 Исследование гомологов алкан-монооксигеназы alkB у G. subterraneus K 85
3.4.1 Локализация генов alkB в геноме углеводородокисляющей бактерии Geobacillus subterraneus штамм К 86
3.4.2 Детекция мРНК генов alkB у бактерии G. subterraneus K при росте на н-алканах 89
3.5. Филогенетическое разнообразие генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, полученных на основе ДНК и РНК из накопительных культур аэробных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературного
нефтяного пласта 96
4. Заключение 102
5. Выводы 104
6. Список литературы 105
- Биотехнологический потенциал бактерий рода Geobacillus
- Организация alk генов у других грамотрицательных бактерий – 37 деструкторов н-алканов
- Состав сред и условия культивирования бактерий рода Geobacillus
- Идентификация представителей рода Geobacillus на основе сравнительного филогенетического анализа генов 16S рРНК и генов gyrB и топоизомеразы IV и оценка возможности использования последних для таксономии геобацилл
Введение к работе
Актуальность проблемы. Термофильные углеводородокисляющие бактерии рода Geobacillus являются обычными обитателями высокотемпературных нефтяных пластов (Назина, Беляев, 2004). В процессе окисления н-алканов нефти геобациллы образуют биосурфактанты, что обусловливает их большой биотехнологический потенциал для повышения нефтеизвлечения. Надежное обнаружение углеводородокисляющих геобацилл в микробном сообществе нефтяного пласта позволяет принимать решение о возможности применения биотехнологий повышения нефтеизвлечения, основанных на активации нефтеокисляющих бактерий. В период после первого описания рода Geobacillus (Nazina et al., 2001) были предложены 19 новых видов, размывающих границы существующих видов и рода. В 2010–2012 годах на основании анализа генов 16S рРНК была начата новая ревизия рода. Часть видов была перенесена в новые роды (Aeribacillus, Caldibacillus), а ряд видов объединен в подроды (Miana-Galbis et al., 2010; Dinsdale et al., 2011; Coorevits et al., 2012). Последовательности генов 16S рРНК представителей рода Geobacillus очень близки, а у ряда видов эти гены не различаются. Таким образом, существует необходимость в поиске новых генетических маркеров или признаков, позволяющих осуществить внутривидовую и межвидовую дифференциацию геобацилл. Эти сведения необходимы также для обнаружения геобацилл в микробных сообществах и выявления их метаболической активности.
На настоящий момент показана возможность использования генов «домашнего хозяйства» бета-субъединиц гиразы (gyrB) и топоизомеразы IV (parE) для уточнения филогенетического положения представителей родов Pseudomonas (Izumi et al., 2007, Anuj et al., 2009), Vibrio (Luo and Hu, 2008), Paenibacillus (Wu et al., 2010) и др. на видовом уровне. Продукты генов gyrB и parE принимают непосредственное участие в процессе репликации ДНК и разделения дочерних клеток. Высказано предложение об использовании генов gyrB и parE для идентификации бактерий на внутри- и межвидовом уровне в качестве альтернативы метода ДНК-ДНК гибридизации (Suzuki et al., 2001, Wang et al., 2007).
Анализ генов 16S рРНК в сочетании с анализом генов дополнительных путей метаболизма является наиболее востребованным молекулярно-биологическим подходом при изучении микробных сообществ. Выбор генов в качестве дополнительного маркера во многом зависит от предполагаемого ключевого биогеохимического процесса, осуществляемого сообществом. В экосистеме заводняемых высокотемпературных нефтяных пластов особый интерес представляет процесс аэробного окисления нефти и ее компонентов. У мезофильных бактерий, деструкторов н-алканов, наиболее часто в качестве дополнительного гена-маркера используют ген алкан-монооксигеназы (alkB), ключевого фермента аэробной деградации н-алканов (van Beilen et al., 2005). К началу нашей работы появились первые сообщения об обнаружении у термофильных бактерий Geobacillus thermoleovorans 70 и Geobacillus thermoglucosidasius TR2 фрагментов последовательности alkB-гена (Sharkey et al., 2004; Marchant et al., 2006). Таким образом,
представлялся актуальным анализ генов 16S рРНК геобацилл в сочетании с генами alkB, кодирующими ключевые ферменты деградации н-алканов.
Отдельной проблемой является доказательство функциональной активности геобацилл в природном местообитании. В настоящее время метаболически активные компоненты сообщества выявляют путем применения анализа генов 16S рРНК, полученных на основе тотальной РНК сообщества (Mills et al., 2004, 2005). Обнаружена прямая корреляция между высоким количеством рРНК и метаболической активностью микроорганизма. Сравнение библиотек клонов генов 16S рРНК, созданных на основе ДНК и РНК, позволяет выявить метаболически активные группы прокариот (Mills et al., 2004, 2005; Михайлова, 2012).
В имеющихся публикациях идентификацию и детекцию геобацилл в природных образцах в основном осуществляли на основании анализа генов 16S рРНК, поскольку сведения о других рассматриваемых генах-маркерах (gyrB, parE и гены деградации углеводородов) у геобацилл практически отсутствовали (Назина и соавт., 2000; 2006; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003; Dahle et al., 2008; Mnif et al., 2011). Таким образом, представляется актуальным исследование генов, перспективных как для идентификации и обнаружения бактерий рода Geobacillus в природных сообществах, так и для доказательства их метаболической активности.
Цель и задачи исследования. Целью работы является поиск и сравнительная характеристика белок-кодирующих генов бета-субъединицы гиразы, бета-субъединицы топоизомеразы IV и алкан-гидроксилазы у термофильных нефтеокисляющих бактерий рода Geobacillus и оценка возможности использования этих генов для определения таксономического положения геобацилл и их обнаружения в составе микробных сообществ высокотемпературных нефтяных пластов.
Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.
-
Определить первичную структуру генов gyrB и топоизомеразы IV у новых и известных штаммов бактерий рода Geobacillus и оценить возможность их использования для таксономии геобацилл.
-
Определить первичную структуру генов alkB у 11-ти штаммов, принадлежащих к роду Geobacillus.
-
Разработать праймеры для детекции разных алкан-гидроксилаз и исследовать разнообразие и локализацию генов alkB в геноме углеводородокисляющей бактерии Geobacillus subterraneus штамм К, а также транскрипцию генов alkB в зависимости от стадии роста культуры и используемых углеводородных субстратов.
-
Определить филогенетическое разнообразие микроорганизмов в культурах термофильных углеводородокисляющих бактерий из высокотемпературных нефтяных пластов методом клонирования и секвенирования генов 16S рРНК и alkB, полученных на основе тотальных ДНК и РНК культур.
Научная новизна работы. Впервые определены последовательности генов бета-субъединицы гиразы и топоизомеразы IV у 18 штаммов геобацилл, и показана возможность использования этих генов для определения таксономического положения бактерий рода Geobacillus. В геномах 11 исследованных штаммов геобацилл выявлено от трех до семи генов алкан-гидроксилаз, из которых только два являются универсальными для всех штаммов. Показано высокое сходство нуклеотидных последовательностей генов alkB родов Geobacillus и Rhodococcus, что свидетельствует об отсутствии видовой специфичности генов alkB и не позволяет использовать их в качестве единственного маркера для определения таксономической принадлежности геобацилл в природных экосистемах. Впервые показана хромосомная локализация генов alkB в геноме углеводородокисляющей бактерии Geobacillus subterraneus штамм К. С использованием разработанных праймеров к 8-и генам alkB исследована их транскрипция в зависимости от стадии роста культуры и используемых углеводородных субстратов. Выявлен высокий уровень транскрипции генов alkB-geo5, alkB-geo6 и alkB-geo4 при росте бактерии G. subterraneus К на н-алканах, что подтверждает участие белковых продуктов этих генов в деградации н-алканов. Определена функциональная роль трех из семи генов alkB. При росте на н-алканах с разной длиной углеродной цепи (н-C16H34 и н-C22H46) в экспоненциальной фазе обнаруживается мРНК alkB-geo5 и alkB-geo6, имеющих высокий уровень сходства между собой, а в начале стационарной фазы обнаруживается мРНК alkB-geo4. Впервые созданы библиотеки 16S рДНК на основе ДНК и РНК культур углеводородокисляющих бактерий из нефтяных пластов. Анализ библиотеки, созданной на основе РНК, свидетельствует о доминировании геобацилл в культурах из высокотемпературных нефтяных пластов и дает более полное представление о метаболически активных группах микроорганизмов.
Практическая значимость работы. Оптимизированы условия выделения ДНК и РНК из биомассы геобацилл с последующей амплификацией генов 16S рРНК и alkB. Созданы праймеры для детекции разных алкан-гидроксилаз в накопительных культурах и природных образцах. Сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов бета-субъединицы гиразы и топоизомеразы IV рекомендован в качестве признака, альтернативного ДНК-ДНК гибридизации для внутри- и межвидовой идентификации бактерий рода Geobacillus.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на III-ой и V Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2009), на международном симпозиуме по микробиологии подземных экосистем (ISSM 2008) (Шизуока, Япония, 2008); на Пятом Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009); на 2-м международном симпозиуме по прикладной микробиологии и молекулярной биологии нефтяных систем (ISMOS2, Орхус, Дания, 2009), и на Международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 обзор и 5 материалов отечественных и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает разделы «Введение», «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Материалы диссертации изложены на 123 страницах и включают 21 рисунок и 7 таблиц. Список литературы включает 12 отечественных и 213 зарубежных наименований.
Биотехнологический потенциал бактерий рода Geobacillus
Бактерии рода Geobacillus представляют большой интерес, как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. особенностью фермента является наличие хеликазной активности. Оптимальная температура работы Bst полимеразы находится в пределах 60–65С. Благодаря своим свойствам, фермент нашел широкое применение в так называемой изотермической амплификации нуклеиновых кислот. Подход позволяет исключить из цикла нагрев до 95С для денатурации ДНК и проводить полимеразную цепную реакцию в один шаг. Таблица 2. Физиолого-биохимические признаки аэробных термофильных бактерий рода Geobacillus, выделенных из высокотемпературных нефтяных пластов
Назина и соавт., 2000; Nazina et al., 2001 Kuisiene et al., 2004 Nazina et al., 2005 Особое внимание представляет обнаруженная у геобацилл термостабильная РНК зависимая ДНК-полимераза, или термостабильная обратная транскриптаза, работающая при температуре 75С (патент US20110020897) (Vellore et al., 2004). Обратные транскриптазы являются незаменимыми ферментами в молекулярной биологии. Они позволяют анализировать и идентифицировать методом ПЦР различные РНК путем получения комплементарной ДНК (кДНК), получать рекомбинантные гены животных для экспрессии в клетках прокариот и т.д. Ранее все используемые для этих целей коммерческие ферменты получали на основе обратных транскриптаз ретровирусов животных, что не позволяло использовать их при температурах выше 42С. Возможность проводить реакцию обратной транскрипции при температуре до 75С дает преимущество в выходе кДНК, так как повышение температуры способствует лучшей денатурации одноцепочечной РНК, устраняет шпильки и другие вторичные структуры.
Близкое родство и высокая степень сходства геномов термофильных бактерий рода Geobacillus с геномами мезофильных Bacillus обусловили повышенное внимание к представителям геобацилл с точки зрения изучения механизмов адаптации мезофильных бактерий к высоким температурам. Выявление факторов, обеспечивающих устойчивость к повышенной температуре, имеет не только фундаментальное значение, но и представляет определенный коммерческий интерес, так как знание механизмов возникновения устойчивости позволило бы создавать белки с новыми свойствами. На настоящий момент рассматриваются 3 основных гипотезы о механизме адаптации мезофильных микроорганизмов к высокой температуре: 1) мутации и модификации существующих мезофильных генов основных биохимических путей метаболизма, 2) горизонтальный перенос генов из термофильных архей, 3) модификации и повышение активности белков-шаперонов мезофилов.
Первый проект по секвенированию полного генома геобацилл G. kaustophilus штамм HTA426 был направлен на проверку этих гипотез. Основное внимание было уделено поиску уникальных для G. kaustophilus генов в сравнении с геномами бацилл. (Takami et al., 2004). В 2007 году был завершен еще один проект по сиквенсу полного генома G. thermodenitrificans NG80-2 (Feng et al., 2007). В настоящее время проводится полное секвенирование геномов наиболее востребованных в биотехнологии штаммов G. stearothermophilus 10 и G. thermoleovorans T80.
Полученные последовательности геномов геобацилл позволили уточнить и проверить группу генов, которая была определена как специфичная для G. kaustophilus HTA426 по сравнению с генами бактерий рода Bacillus. В эту группу вошло 839 генов, что составило 24% от их общего числа. Для 204 генов из этой группы функция остается неизвестной. Между большинством генов основных метаболических путей геобацилл и бацилл не найдено значительных отличий. Доля таких генов в геноме составила 37%. Остальные гены являлись ортологами генов бацилл. Небольшое количество генов идентифицированы как ортологи генов термофильных архей (Takami et al., 2004).
Опубликованные геномы пока не позволили четко идентифицировать факторы, связанные с обеспечением устойчивости бактерий к высоким температурам роста. Не найдено подтверждений версии, что мутации и модификации существующих генов мезофильных бактерий привели к возникновению термоустойчивых белков. Однако для геобацилл удалось выявить такие особенности, как наличие в геноме большого числа мобильных элементов. Геном бактерии G. kaustophilus содержит 91 транспозон, тогда как у бацилл максимальное количество транспозонов (21) выявлено в геноме B. cereus, а в геноме B. subtilis они отсутствовали (Takami et al., 2004). Возможно, наличие большого числа транспозонов свидетельствует о высоком уровне горизонтального переноса генов у геобацилл. В то же время, какие ключевые гены из термофильных микроорганизмов попали в геном геобацилл путем горизонтального переноса, осталось невыясненным. Таким образом, вопрос о механизмах адаптации мезофилов к высокой температуре остается открытым.
Большие надежды связаны с изучением и последующим использованием способности геобацилл деградировать нефть и ее компоненты. В экспериментах с чистыми культурами бактерий рода Geobacillus, выделенными из нефтяных пластов, показана их способность использовать различные компоненты нефти, прежде всего н-алканы, в качестве единственного источника углерода и энергии (Михайлова, 2012). При этом геобациллы могут расти как на короткоцепочечных, так и на длинноцепочечных н-алканах. Ряд исследованных штаммов геобацилл использует широкий спектр н-алканов (С10H22-С36H74). Исключением является G. thermodenitrificans, использующий н-алканы с длиной цепи не менее С15. Для штамма G. thermoleovorans T80 показана способность деградировать н-алканы и ароматические углеводороды (Marchant et al., 2002; Omokoko et al., 2008). Некоторые штаммы вида G. thermoleovorans окисляют нафталин, фенол и другие полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) (Mutzel et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Feitkenhauer et al., 2003).
Штамм G. thermoleovorans T80 был использован для биоремедиации при повышенных температурах. Считается, что повышение температуры при проведении биоремедиации будет способствовать увеличению биодоступности углеводородов, особенно длинноцепочечных (Perfumo et al., 2007). Следовательно, эффективность биоремедиации должна возрастать в термофильных условиях. Исследование деградации н-гексадекана консорциумом углеводородокисляющих бактерий, включающим штамм G. thermoleovorans T80, при температуре 18С и 60С показало, что при 60С утилизировался 71% н-гексадекана, тогда как при 18С консорциум бактерий деградировал только 42% С16. Через 40 дней эксперимента деградация н-гексадекана при 60С достигла 90%. Возрастание деградирующей способности бактериальной смеси авторы объясняют присутствием термофильного углеводородокисляющего штамма G. thermoleovorans T80 (Perfumo et al., 2007).
Результаты изучения окисления углеводородов геобациллами, полученные на чистых культурах, дают основание полагать, что бактерии рода Geobacillus могут участвовать в деградации нефти в загрязненных нефтью экосистемах и в высокотемпературных нефтяных пластах. На это косвенно указывает и то, что они часто встречаются в сообществах микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов.
Возможность использовать термофильные углеводородокисляющие бактерии для биоремедации и повышения нефтеотдачи имеет значительный биотехнологический потенциал, который может быть реализован на основе изучения генов, ответственных за деградацию н-алканов.
Организация alk генов у других грамотрицательных бактерий – 37 деструкторов н-алканов
Особенности alk генов и их белковых продуктов подробно были исследованы у мезофильных грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas (P. putida GPo1 (=P. oleovorans) и P. aeruginosa), Acinetobacter, Alcanivorax и Burkholderia (Ratajczak et al., 1998; Marin et al., 2001, 2003; Tani et al., 2001; van Beilen et al., 2004; Hara et al., 2004). В геномах мезофильных штаммов-деструкторов алканов, принадлежавших к различным видам и родам, были обнаружены наборы alkB генов, значительно различающихся между собой (Smits et al., 2002; Coleman et al., 2006). Близкородственные гомологи генов alkB штамма P. putida GPo1 найдены в штамме того же рода, P. putida P1. Подобно alk генам P. putida GPo1, alk гены P. putida P1 организованы в 2 оперона. Отличаются штаммы локализацией и расположением оперонов относительно друг друга. У P. putida P1 alk гены являются хромосомными, оперон alkST находится перед опероном alkBFGHJKL, и расстояние между ними значительно меньше (van Beilen et al., 2001).
Штаммы P. aeruginosa PAO1 и RR1 содержат два гена ключевого фермента алкан-монооксигеназы (alkB1 и alkB2), гомологичных гену alkB P. putida GPo1, два гена рубредоксина (alkG1 и alkG2 соответственно) и только один ген рубредоксин редуктазы (alkT) (Stover et al, 2000; Marin et al., 2003). В штамме P. aeruginosa PAO1 гены alkB1, alkB2 и alkG1 имеют свои собственные промоторы, в то время как alkG2 и alkT составляют единую единицу транскрипции (Smits et al., 2002). Показано, что экспрессия alkB1 и alkB2 штамма P. aeruginosa RR1 происходит в различные фазы роста культуры: alkB2 более активно экспрессируется в начале экспоненциальной фазы, в то время как alkB1 индуцируется в конце экспоненциальной фазы роста культуры клеток, когда скорость роста клеток падает. В отношении двух генов рубредоксина не отмечено какой-либо закономерности в экспрессии. Гены alkG1, alkG2 и alkT экспрессировались на постоянном уровне при росте клеток на н-алканах во всех изученных условиях (Marin et al., 2003).
Наличие нескольких копий отдельных alk генов не является особенностью P. aeruginosa. Несколько генов алкан-монооксигеназ были обнаружены и у других бактерий. Два гомолога гена alkB обнаружено у штамма Alcanivorax borkumensis SK2 (van Beilen et al., 2004). Анализ alkB генов этого штамма показал, что гомолог гена alkB1 ответственен за деградацию короткоцепочечных н-алканов (н-гексана) (Hara et al., 2004). Мутантный штамм A. borkumensis SK2, дефектный одновременно по двум гомологам гена alkB1 и alkB2, сохранял способность расти на среднецепочечных н-алканах, что свидетельствует о том, что гены, отличные от alkB1 и alkB2 также вовлечены в гидроксилирование н-алканов. Дальнейшие исследования штамма выявили наряду с генами алкан-монооксигеназы alkB1 и alkB2 гены и их белковые продукты Р450-монооксигеназы и флавин-связывающей монооксигеназы, которые обеспечивали окисление н-алканов у мутантного по alkB штамма A. borkumensis SK2 (Sabirova et al., 2006). В другом штамме этого рода, Alcanivorax sp. 2B5, обнаружен только один гомолог alkB. Штамм характеризуется широким спектром субстратов и способен окислять н-алканы с длиной цепи С13-С30 и разветвленные алканы. Продукт гена alkB штамма Alcanivorax sp. 2B5 отвечает за окисление С14-С16 н-алканов. Таким образом, для окисления длинноцепочечных и разветвленных алканов штамм использует ферментные системы, отличные от AlkB (Liu et al., 2010). Следует отметить, что обнаруженная у бактерий рода Alcanivorax способность окислять н-алканы несколькими путями коррелирует с характерной для углеводородокисляющих бактерий этого рода широкой субстратной специфичностью. Возможно, это свидетельствует о том, что диапозон субстратов у алкан-монооксигеназы структурно и функционально ограничен. Следовательно, ожидаемые эволюционные изменения этого фермента могут быть направлены только на сдвиг диапазона, но не на расширение спектра утилизируемых субстратов.
Результаты исследований функционирования гомологов алкан-монооксигеназы в других штаммах свидетельствуют в пользу этого предположения. У штамма Acinetobacter sp. М-1 обнаружено два гена алкан-монооксигеназы alkMa и alkMb, различающихся по спектру окисляемых субстратов. Субстратами для одной из алкан-монооксигеназ являются углеводороды с длинной цепи С12-С16, другая окисляет н-алканы длиной более 20 атомов углерода. Дифференциальная экспрессия гена каждого фермента становится возможной благодаря наличию специфических факторов транскрипции, реагирующих на субстраты с определенной длиной углеродного скелета (Maeng et al., 1996).
У бактерий рода Acinetobacter найден новый класс алкан-гидроксилаз. Первым штаммом этого рода, изученным на предмет генетической структуры системы окисления н-алканов, стал Acinetobacter sp. M-1, о котором упоминалось выше (Maeng et al., 1996). Обнаруженное кардинальное отличие в аминокислотной последовательности двух гомологов алкан-монооксигеназы, AlkMa и AlkMb, от последовательности белка AlkB P. putida GPo1 потребовало выделения алкан-монооксигеназы Acinetobacter sp. M-1 в качестве нового изофункционального фермента.
В другом штамме Acinetobacter sp. ADP1, обнаружена alkM-подобная система, состоящая из пяти хромосомных генов (alkM, rubA, rubB, alkR, xcpR). Система обеспечивает деградацию штаммом C12-C18 н-алканов. Гены организованы, по крайней мере, в 3 отдельных локуса. Как и у P. putida GPo1, начальное терминальное окисление н-алканов катализируется трехкомпонентной алкангидроксилазной системой, которая состоит из тех же компонентов: алкан-монооксигеназы (белок AlkM, продукт гена alkM), рубредоксина (RubA, rubA) и рубредоксин редуктазы (RubB, rubB) (Ratajczak et al., 1998) (рисунок 5).
Организация генов деградации н-алканов у грамположительных бактерий. К настоящему времени об организации алкан-гидроксилазных систем грамположительных бактерий и их разнообразии получено мало сведений. Исследование alk-подобных генов проводилось у грамположительных бактерий родов Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia и Praserella (Andreoni et al., 2000; Vomberg and Klinner, 2000; van Beilen et al., 2002; Whyte et al., 2002). В большинстве случаев использовался метод амплификации фрагментов гена alkB с помощью специфичных праймеров к этому гену, что позволяет только констатировать присутствие определенной системы окисления н-алканов и степень гомологии ее последовательности с ранее изученными последовательностями alkB. Только для отдельных штаммов были проведены подробные исследования на предмет генетической и структурной организации систем окисления н-алканов, регуляции их генов и спектра утилизируемых субстратов.
Состав сред и условия культивирования бактерий рода Geobacillus
Создание праймеров к генам gyrB и раrЕ и их амплификация. Первоначально для амплификации генов gyrB у геобацилл использовали ранее предложенные вырожденные праймеры Up-1–Up2R (Yamamoto and Harayama, 1995), позволяющие проводить амплификацию и прямое секвенирование ПЦР-продуктов у широкого круга бактериальных объектов, однако оказавшиеся неэффективными для геобацилл. Амплификация гена с помощью праймеров Up-1–Up2R дала отрицательный результат, что указывало на необходимость доработки вырожденных праймеров, в частности, для повышения их сродства к последовательности gyrB геобацилл. Поскольку для бактерий рода Geobacillus на момент исследования было известно только 2 последовательности -субъединицы гиразы, подбор праймеров проходил в несколько этапов, что связано с корректировками относительно получаемых результатов исследования.
Первым шагом подбора праймеров стало сравнение праймера Up-1 и Up2R с последовательностями генов gyrB из полных геномов Geobacillus kaustophilus HTA 426 и G. thermodenitrificans NG80-2. В результате анализа, праймер Up-1 был модифицирован путем удаления нуклеотида А с 3 конца, поскольку для Geobacillus характерным нуклеотидом в этом положении является G. Амплификация с использованием модифицированного праймера Up-1-deA дала положительный результат для 10 штаммов геобацилл: G. stearothermophilus DSM 22T, G. thermocatenulatus B1259T, G. jurassicus DS1T G. subterraneus 34T и Sam, а также Geobacillus sp. 3Feng, 46, B-1024, 1017 и 8m3. Продукт амплификации соответствовал ожидаемой длине около 1100 нуклеотидов. Однако прямое секвенирование полученных ампликонов удалось только для G. stearothermophilus DSM 22T G. jurassicus DS1T, а также штаммов Geobacillus sp. 1017, 8m3, B1024 и vw3-1, причем только для первых 4-х штаммов полученная последовательность соответствовала гену gyrB, a для штаммов В-1024 и vw3-1 она соответствовала гену -субъединицы топоизомеразы IV раrЕ. В результате клонирования оставшихся ампликонов для 4-х штаммов геобацилл в библиотеке клонов были обнаружены одновременно как последовательности гена gyrB, так и раrЕ. Таким образом, используемые вырожденные праймеры были не всегда специфичны для гена gyrB, что отмечалось и ранее (Kasaiet al., 1998; Watanabe et al., 2001). Для решения проблемы неспецифичности существующих вырожденных праймеров к гену gyrB были разработаны и применены праймеры, избирательно специфичные к генам gyrB и раrЕ геобацилл соответственно (таблица 3). К обнаруженной консервативной области имеющихся на тот момент последовательностей -субъединицы гиразы G. kaustophilus HTA426 и G .thermodenitrificans NG80-2 наряду с полученными в работе последовательностями gyrB для G. stearothermophilus 22T, G. jurassicus DS1 T, был подобран праймер gyrBs-G для отжига в паре с существующим вырожденным праймером Up2R (рисунок 7). Получение последовательности gyrB для штамма G. subterraneus K и ее дальнейший анализ обнаружил отличие в 2-х положениях от последовательности праймера gyrBs-G, что указывало на необходимость применения вырожденных праймеров для этой области у геобацилл. Решением стало создание праймеров gyr1-G и gyr2-G для проведения realime PCR на матрице штамма G. subterraneus K. Прямой праймер gyr1-G, обладающий сродством к последовательности гена gyrB для штамма G. subterraneus K, подобран с учетом его использования для амплификации в паре с вырожденным праймером Up2R (рисунок 7).
Схема посадки вырожденных и специфичных праймеров для амплификации фрагментов гена gyrB геобацилл. Черными прямоугольниками обозначены места посадки праймеров на последовательности гена gyrB, белыми – 5 - концевая часть праймеров Up1-deA Up2R с искусственной последовательностью для прямого секвенирования ПЦР продукта.
Для создания праймеров к гену -субъединицы топоизомеразы IV геобацилл, был проведен поиск консервативных областей у пяти последовательностей гена parE, две из которых были размещены в GeneBank и принадлежали штаммам G. kaustophilus HTA426, G. thermodenitrificans NG80-2, а оставшиеся три последовательности были получены нами для G. subterraneus 34T, G. thermocatenulatus B1259T и Geobacillus sp. 1024. Выравнивание и анализ генов относительно друг друга обнаружили 3 фрагмента в районах около 450 п.н., 680 п.н. и 1620 п.н., перспективных с точки зрения подбора праймеров (рисунок 8).
К этим фрагментам последовательности были подобраны вырожденные праймеры top1F-geo, top3F-geo, top2R-geo c температурой отжига 55С. Работа праймеров была проверена путем постановки контрольной ПЦР на препаратах тотальной ДНК, выделенных из клеток G. subterraneus K и Geobacillus sp. 1024. Для амплификации фрагментов parE с вырожденными праймерами top1F-geo/top3F-geo и top2R-geo был подобран алгоритм проведения ПЦР следующего содержания: денатурация ДНК (95С – 3 мин) и 35 циклов реакции, состоящей из денатурации (94С – 1 мин), отжига праймеров (55С – 1 мин) и элонгации (72С – 1 мин).
Благодаря использованию пар праймеров gyrBs_G(gyrl_G)–Up2r(Up2Sr) были получены ПЦР-продукты ожидаемой длины около 850 п.н. для 6 штаммов геобацилл: G. jurassicus DS2, G. gargensis GaT, G. subterraneus К, G. uzenensis UT и X, а также Geobacillus sp. 49, которые в результате прямого секвенирования оказались фрагментами гена gyrB. Аналогично в результате использования пар праймеров top2F-geo_toplR-geo(top3R-geo) были получены фрагменты генов раrЕ ожидаемой длины около 1150(900) п.н. для G. stearothermophilus DSM 22T, G. jurassicus DS1T, Geobacillus sp. 8m3, G. gargensis GaT, G. subterraneus K, G. uzenensis UT и Х, а также Geobacillus sp. 46, 49 и 1017. Однако ни одно сочетание праймеров не позволило получить специфичные ПЦР продукты гена раrЕ для штамма Geobacillus sp. 8m3.
Таким образом, существующие в настоящее время системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генов gyrB и раrЕ пока нельзя признать универсальными для всех представителей рода Geobacillus (либо исследованный штамм 8m3 не относится к геобациллам), что следует учитывать при использовании их в молекулярно-экологических исследованиях разнообразия геобацилл в природных экосистемах.
Результаты филогенетического анализа генов gyrB и parE сравнивали с результатами, полученными при анализе последовательностей генов 16S рРНК новых штаммов геобацилл, штаммов, относящихся к ранее описанным видам (Nazina et al., 2001; 2004, 2005), а также типовых штаммов других узаконенных видов геобацилл (Kuisiene et al., 2004; Caccamo et al., 2000, Schaffer et al., 2004, Banat et al., 2004, Sung et al., 2002). Кроме того, использовали последовательности генов 16S рРНК из имеющихся в генетическом банке полностью секвенированных геномов пяти референтных штаммов геобацилл: два штамма относились к видам G. kaustophilus и G. thermodenitrificans, а остальные штаммы не были идентифицированы. Согласно филогенетическому анализу, последовательности генов 16S рРНК геобацилл образовали 5 основных кластеров (рисунок 9), уровень сходства внутри которых составлял 97.6–100%, а между кластерами – 93.5–97.3%. При этом, большинство видов геобацилл относилось к кластеру I, а уровень межвидового сходства последовательностей внутри этого кластера был очень высоким (97.8–99.9%). Этот уровень во многих случаях был сравним с внутривидовым для геобацилл (99.8–100%), что не позволяло надежно дифференцировать виды.
Идентификация представителей рода Geobacillus на основе сравнительного филогенетического анализа генов 16S рРНК и генов gyrB и топоизомеразы IV и оценка возможности использования последних для таксономии геобацилл
Проверить наличие плазмидной ДНК в препарате хромосомной ДНК методом ПЦР не представлялось возможным ввиду отсутствия информации о нуклеотидной последовательности обнаруженной у G. subterraneus K плазмиды.
Амплификация фрагмента гена alkB с использованием вырожденных праймеров (Alk-BFB и Alk-BRB) происходила только на матрице хромосомной ДНК (рисунок 17). Кроме того, с помощью ПЦР-РВ исследовали образование ПЦР продуктов гена alkB в зависимости от количества ДНК матрицы (от 50 до 500 нг на реакцию). В случае плазмидной ДНК синтез специфичного ПЦР-продукта не наблюдали ни при одной концентрации, тогда как амплификация фрагмента гена alkB на хромосомной ДНК начиналась уже при использовании 50 нг ДНК в реакции.
Как отмечалось выше, наличие нескольких копий alkВ генов в геноме одного организма не является особенностью геобацилл. У грамположительных бактерий было обнаружено не менее 4-х гомологов в геномах штаммов R. erythropolis NRRL B-16531 и Rhodococcus sp. Q15 (Whyte et al., 2002). Причем гомолог alkB2 близок гомологам alkB-geo5 и alk-geo6 геобацилл, а гомолог alkB3 сходен с гомологом alkB-geo4 геобацилл. Мультикопийность генов алкан-гидроксилаз, по-видимому, является одним из механизмов адаптации углеводород-использующих бактерий к условиям внешней среды. Экспериментально на настоящий момент для генов алкан-монооксигеназы обнаружено два возможных способа адаптации: 1. Приспособление к изменяющимся факторам роста (рН, температуры, аэрации и т.д.); 2. Субстратная специфичность. Приспособление к изменяющимся условиям роста показано для штаммов P. aeruginosa, экспрессия двух генов-гомологов в геноме которого происходит в различные фазы роста культуры (Mercedes et al., 2003). Дифференциальное разделение гомологов в зависимости от условий культивирования обнаружено для гомологов гена alkB Rhodococcus sp. TMP2 (Takei et al., 2008) и R. opacus B4 (Sameshima et al., 2008). Функциональное разделение по спектру утилизируемых субстратов показано для генов-гомологов alkB Acinetobacter sp. М1 и Alcanivorax borkumensis SK2, которые дифференциально эксперессируются в зависимости от длины цепи окисляемого н-алкана (Maeng et al., 1996; Hara et al., 2004).
Для определения функциональной роли генов-гомологов у исследуемого штамма G. subterraneus К была проведена экспериментальная оценка уровня транскрипции этих генов (образования мРНК) в зависимости от различных условий культивирования. Для проверки, вызывает ли добавление определенного субстрата индукцию транскрипции соответствующего гомолога, исследовали образование матричной РНК гомологов alkB в экспоненциальную фазу при росте на н-алканах с длиной цепи С16 (н-гексадекан) и С22 (н-докозан) в оптимальных температурных условиях (60С). Для проверки, влияют ли факторы роста на индукцию определенного гомолога, исследовали образование мРНК гомологов alkB в начале стационарной фазы роста культуры при 60С на углеводородах С16H34 и С22H46 и сравнивали с данными, полученными для клеток в экспоненциальной фазе роста. Кривые роста культур с соответствующими точками отбора проб представлены на рисунке 18. Культуры, выращенные на глюкозе и ацетате в тех же условиях, использовались в качестве отрицательного контроля.
В процессе подготовки препаратов РНК экспериментально показано, что для эффективной очистки препаратов РНК от ДНК необходимо использовать 0.5 и больше единиц активности ДНКазы на 200 мкг препарата нуклеиновых кислот. Проверка остаточного загрязнения ДНК в препаратах РНК с помощью ПЦР показала, что молекулы ДНК остались в минорных количествах, однако их число было незначительным и давало слабый положительный сигнал только при амплификации с праймерами к 16S рРНК, с праймерами к gyrB результат был отрицательным.
Первоначальное проведение амплификации гомологов генов alkB со специфичными праймерами методом ПЦР-РВ на матрице кДНК показало, что количество копий мРНК генов alkB в препарате тотальной РНК очень мало (Ct 35–37), что не позволяло провести анализ уровня транскрипции гомологов непосредственно на кДНК. Для получения достаточного количества копий генов alkB в препарате и, следовательно, достоверной детекции их мРНК, проводили предварительную амплификацию с помощью вырожденных праймеров к гену alkB, что позволяло одновременно увеличить количество копий всех присутствующих в геноме G. subterraneus К гомологов. После амплификации продукт ПЦР переосаждали, разводили в 100 раз и использовали в качестве матрицы для постановки ПЦР со специфичными праймерами. Для того чтобы убедиться, что сигнал в реамплификации получен именно с мРНК, а не с остаточной ДНК, параллельно ставили реамплификацию продукта контрольной ПЦР на препарате РНК в том же разведении, что и продукт, полученный на кДНК.
Ожидалось, что реакция будет проходить только на препарате кДНК культур, выращенных на н-гексадекане и н-докозане. Однако положительный сигнал был получен и для культуры, выращенной на ацетате. Для определения, какие именно гомологи гена транскрибируются на этом субстрате, был проведен второй раунд амплификации со специфичными праймерами к каждому гомологу гена alkB, в результате которого Рисунок 18. Рост G. subterraneus K в среде MSM с н-алканами (С16H34 и С22H46) в качестве единственного источника углерода и энергии при 60С. оказалось, что положительный сигнал ПЦР на матрице кДНК из этой культуры, образуется за счет присутствия в препарате кДНК alkB-geo3 гомолога (рисунок19б). Для объяснения неожиданного факта индукции транскрипции одного из гомологов генов алкан-монооксигеназы при росте на ацетате необходимо проведение отдельного исследования в дальнейшем.
Для культуры в экспоненциальной фазе роста (OD 0.28) на н-гексадекане (С16H34) реамплификация с использованием специфичных праймеров, как в обычной ПЦР (рисунок 19в), так в ПЦР-РВ (рисунок 20а), показала, что положительный сигнал был обусловлен присутствием в препарате кДНК alkB-geo5 и alkB-geo6 гомологов гена алкан-монооксигеназы.
Согласно значению Ct (22.41 и 23.35 соответственно), количество мРНК обоих гомологов было практически равным. Приводимые значения Ct соответствуют 6.75 106 и 3.81 106 копиям матрицы в исходной реакции, т.е. одному порядку. Использование реамплификации в постановке эксперимента с учетом погрешности метода в Ct 0.5, не позволяет считать достоверной полученную разницу количества копий для alkB-geo5 и alkB-geo6. Для культуры, растущей в экспоненциальной фазе (OD 0.38) на н-докозане (С22), также была обнаружена транскрипция alkB-geo5 и alkB-geo6 (рисунок 19д, рисунок 20в) примерно в равных количествах (Сt 18.25 и 19.27 соответственно).
