Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ТОБАМОВИРУСЫ: СТРУКТУРА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ. 9
Общая характеристика группы тобамовирусов 9
Классификация тобамовирусов 11
Нетранслируемые области рнк тобамовирусов 13
5'-концевая нетранслируемая область геномной РНК тобамовирусов 13
З'-нетраислируемая область тобамовирусов 16
РЕПЛИКАТИВНЫЕ БЕЛКИ. , 17
Участие 126 и 183К белков в репликации РНК и супрессия атЬег-кодона 17
Метил трансфераз! іьш домен 19
NTP-связывающий хеликазный домен 19
Домен РНК-зависимой РИК-полимеразы 20
Предполагаемый 5 4К белок 21
ТРАНСПОРТНЫЙ БЕЛОК 21
ТБ увеличивает пропускную способность плазмодесм 23
ТБ неспецифически связывается с вирусной РНК in vitro и in vivo и ингибирует
ее трансляцию 24
ТБ связывается с компонентами іщтоскепета,протешкииазой клеточной стенки и пектинметилэстеразой 25
ТБ подавляет «умолкание» генов 27
БЕЛОК ОБОЛОЧКИ. 28
Белок оболочки тобамовирусов необходим для дальнего транспорта по сосудистой системе растения 28
Роль БО в образованиирешикативных комплексов 29
Особенности структуры КРВТМ 30 бепки 122к и 178к 31
29к-транспортный белок 31
18k-белок оболочки 33
5 '-концевая петра полируемая область 33
3 '-концевая петра полируемая область 33
Механизм экспрессии генома тобамовирусов 34
Субгеномизация 35
Внутренняя инициация трансляции 37
Материалы и методы 41
Результаты и обсуждение 54
IRESCP 148 выполняет функцию сайта связывания рибосомы Escherichia coll. 54
Тестирование IRESCp,u8 в новом вирусном векторе, созданном на основе гетерологичного репликона ХВК 60
TRESCP,I4K вносит вклад в общий синтез белка оболочки во время вирусной инфекции 68
ВЫВОДЫ 74
БЛАГОДАРНОСТИ 75
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 76
- Общая характеристика группы тобамовирусов
- Участие 126 и 183К белков в репликации РНК и супрессия атЬег-кодона
- ТБ увеличивает пропускную способность плазмодесм
Введение к работе
Актуальность проблемы
Синтез белка у эукариот осуществляется с помощью кэшшрованных моноцистронных мРНК. Подавляющее большинство эукариотических мРНК транслируется с помощью так называемого механизма сканирования рибосомами. Этот механизм предполагает» что малая 40S субъединица рибосомы в комплексе со специфическими белковыми факторами инициации трансляции связывается с 5'-концевой m'G-kmi структурой, а затем перемещается по мРНК в 3'-направлении, пока не достигнет стартового AUG кодона в благоприятном нуклеотидном контексте. Далее происходит присоединение большой 60S субъединицы, и начинается синтез белка. Такая модель инициации трансляции считалась общепринятой, пока в 1988 году не был открыт механизм внутренней кзп-независимой инициации трансляции. При изучении инициации трансляции геномной РНК полиовирусов выяснилось, что 40S субъединица способна осуществлять посадку не на 5'-конец мРНК, а прямо на внутренние участки РНК, прилегающие к стартовому кодону. Оказалось, что с помощью такого механизма осуществляется трансляция не только вирусных РНК, но и клеточных мРНК. Более того, участки внутренней посадки рибосом (ОВПР, или internal ribosome entry sites, IRES) могут находиться в составе кэппированных матриц, а кэп-независимый механизм экспрессии активируется у некоторых мРНК (доля которых оценивается до 3% от всех эукариотических мРНК) в стрессовых условиях, когда нормальный многофакторный и сложный механизм сканирования рибосомой подавляется. Такие стрессовые условия создаются в клетке, например, при малигнизации, апоптозе, тепловом шоке и, конечно, во время вирусной инфекции. Хотя выявленных на сегодняшний день вирусных ОВПР немного, РНК-содержащие вирусы, по-видимому, широко используют этот механизм
экспрессии, чтобы обойти клеточный контроль на уровне кэп-зависимой инициации трансляции.
Несколько лет назад были идентифицированы и описаны два ОВПР из генома вируса табачной мозаики крестоцветных (крВТМ, или crTMV): нуклеотидные последовательности, предшествующие гену белка оболочки (БО, или coat protein, СР) и гену транспортного белка (ТБ, или movement protein, MP) -IREScp,i48CR и IRESMp,75CR соответственно. Кроме того, у классического ВТМ штамма U1 был обнаружен IRESmp,73U1*
IRESmpj5cr является достаточно эффективным трансляционным энхансером как in vitro, так и in vivo, по активности сравнимым. с последовательностью «омега» ВТМ. Доказано участие IRESmp.75CR в транспорте и репродукции ВТМ. Установлено что полилурин-(А)-богатые нуклеотидные последовательности, входящие в состав IREScp.hs011» обладают способностью обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции в различных трансляционных системах эукариот: клетках растений, животных и дрожжей. Подтверждено предположение, что любая 5*-нетранслируемая область (5-НТО) эукариотической мРНК, содержащая протяженные (А)-богатые последовательности, может обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции. Выявлены ранее не идентифицированные ОВПР растительных клеток (поли-А-связывающего белка и 48К протеинкиназы).
В данной работе продолжено изучение структуры и свойств IREScp.hs011 и исследована его роль в вирусной инфекции. Цели исследования
-
Выявление структурного и функционального сходства IREScp,u8CR и рибосомо-связывающего сайта кишечной палочки (Escherichia соН).
-
Разработка системы тестирования функциональной активности IREScp,u8CR в растении при использовании гомологичных и гетерологичных вирусных векторов.
3. Определение вклада IREScp.ug011 в синтез БО во время вирусной инфекции.
Научная новизна и практическая значимость работы
В ходе данной работы в составе IREScp.hs0* были выявлены два полипуриновых фрагмента, потенциально способные взаимодействовать с прокариотической рибосомной РНК. Проведен анализ трансляционной активности IREScp,i48Cf\ его отдельных элементов, мутантных вариантов, а также ряда искусственных полипуриновых последовательностей в модельной прокариотической системе — кишечной палочке (E.colit штамм BL-21). Показано, что IREScp.u»011 способен обеспечивать инициацию трансляции в E.coli, выполняя функции сайта связывания рибосомы. Полипуриновые блоки, входящие в состав IREScp.ms01*» и искусственные полипуриновые последовательности также обеспечивают инициацию трансляции в прокариотической системе. При этом трансляционная активность IREScp,i48CR в основном определяется структурным элементом pptll, а элемент pptl9 повышает эффективность инициации трансляции.
Проведено тестирование IREScp,i48CR в новом вирусном векторе, созданном на основе гетерологичного репликона ХВК. Показано, что эффективность трансляции второго цистрона бицистронных субгеномных мРНК, обеспечиваемой IREScp,i48CR, расположенным в межцистронной области, составляет 2-3% от экспрессии первого цистрона. Разработана система «визуализации» IRESo>,i48CR— содержащих бицистронных мРНК, «упакованных» в псевдовирион белком оболочки ВТМ, в клетке. Доказана способность IREScp,i«CR обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции на интактных матрицах.
Сконструирован бинарный вектор, содержащий инфекционную копию крВТМ. В область промотора, контролирующего синтез субгеномной мРНК БО, введены нуклеотидные замены, приводящие к его инактивации. Установлено, что вклад ntEScp,i48CR в общий синтез БО во время вирусной инфекции составляет, по крайней мере, 3-4%. Сделан вывод, что внутренняя инициация трансляции важна
для синтеза БО, обеспечивающего, по-видимому, раннее формирование вирусного репликативного комплекса.
Практическая значимость работы заключается в развитии системы одновременной экспрессии двух и более целевых белков с помощью вирусных векторов при использовании IRESc^ms011-
Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ 6 февраля 2006 года. Материалы работы докладывались на международных конференциях:
-
П Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2003, Москва.
-
XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», 2004, Москва.
-
ХП Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», 2005, Москва.
-
Международная школа-конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», 2005, Москва.
-
International symposium "Biosafety Issues in Implementation of GMOs: New Research Approaches, Regulation and Public Perception", 2006, Yalta, Ukraine.
-
EMBO Workshop in Plant Virology "Suppression and Circumvention of Host Defence by Plant Viruses", 2006, Hotel Haikko Manor, Finland.
-
XV FESPB Congress "Plant, People, Ecosystems and Applications", 2006, Lyon, France.
-
The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protein Interactions", 2006, Moscow Region, Russia.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.
Общая характеристика группы тобамовирусов
Объектом настоящего исследования является тобамовирус крестоцветных - представитель семейства тобамовирусов. Эта группа вирусов растений довольно хорошо изучена. В данном обзоре приведена лишь общая характеристика тобамовирусов, включающая в себя их классификацию, описание строения генома и содействующих последовательностей, контролирующих репликацию и экспрессию генома вирусов этой группы.
Тобамовирусы относятся к суперсемейству Синдбис-подобных вирусов. Однонитевая смысловая (+)-РНК размером около 6400 нуклеотидов кэппирована на 5 -конце, а в 3 -концевой области образует тРНК-подобную структуру. Вирионы имеют палочковидную форму, содержат одну молекулу РНК, примерно 2140 субъединиц капсидного белка и представляют собой полый цилиндр длиной около 300 нм. Внешний диаметр вирусных частиц -примерно 20 нм, а внутренний - приблизительно 4 нм.
Как показано на рис.1, геном ВТМ-Ш, типового представителя группы, содержит 4 открытые рамки трансляции и кодирует, по крайней мере, 3 неструктурных белка (126-, 183-, 30-кДа белки) и белок оболочки. 126- и 183К белки транслируются с одной и той же открытой рамки считывания (ОРТ1/2), причем 183К образуется за счет проскока слабого терминирующего amber-кодона UAG (Pelham, 1978). Предполагается также возможность синтеза 54К белка, кодируемого расположенной за amber-кодоном С-концевой частью гена 183К-белка (Sulzinski et al., 1985): была обнаружена соответствующая субгеномная РНК (сгРНК), ассоциированная с полисомами в листьях табака (Zaitlin, 1999), однако в зараженных растениях данный белок обнаружить не удалось (Carr et al., 1992; Zaitlin, 1999).
Участие 126 и 183К белков в репликации РНК и супрессия атЬег-кодона title2 17 Метил трансфераз! іьш домен
Метилтрансферазный домен. Крупные репликативные белки тобамовирусов имеют несколько функциональных центров. Воспроизводство вирусов с кэшшрованной геномной (-ь)-РНК требует участия клеточных или вирусспецифических метилтрансфераз. Соответствующий домен обнаружен при сравнении аминокислотных последовательностей в различных вирусных репликативных белках, в том числе в N-концевой части 126К белка тобамовирусов (рис. 4) (Rozanov et а/., 1992). В этом домене выявлены 3 уникальных консервативных мотива, отличные от мотивов клеточных метилтрансфераз (Rozanov et at., 1992; Koonin and Dolja, 1993; O Reilly and Kao, 1998). 126K белок BTM обладает гуанилилтрансферазной активностью in vitro (Dunigan and Zaitlin, 1990) и участвует в метилировании ГТФ перед формированием комплекса, состоящего из 126К белка и 7шТМФ (Merits et ah, 1999). Метилтрансферазы тобамовирусов относятся к т.н. первому типу и причислены к "тобамоподобной" группе (Koonin and Dolja, 1993).
NTP-свюываюгций хеликазный домен. Большинство вирусных геномов протяженностью более 6000 нуклеотидов кодируют собственную РНК-хеликазу; предполагается ее участие в расплетении РНК-дуплексов во время трансляции и репликации вирусного генома (Gorbalenya and Koonin, 1989). Хеликазы (+)-РНК содержащих вирусов классифицированы в 3 суперсемейства; в суперсемействе 1, куда отнесены тобамовирусы, обнаружены 7 консервативных мотивов (Hodgman, 1988; Gorbalenya and Koonin, 1989; Koonin and Dolja, 1993). Хеликазный домен тобамовирусов находится в С-концевой области 130К белка (рис. 4). Экспериментально показана важность NTP-связывающего мотива для репродукции вируса -мутации в соответствующем районе 2С белка вируса полиомиелита заметно снижали уровень репликации вирусного генома (Mirzayan and Wimmer, 1992: Teterina et ah, 1992).
ТБ увеличивает пропускную способность плазмодесм
В 1984 году Атабеков и Дорохов (Atabekov and Dorokhov, 1984) предположили существовании двух функций ТБ: (а) «открытие» плазмодесм и (б) подавление клеточной защитной реакции, препятствующей распространению вирусной инфекции. В последующие годы помимо этих функций обнаружено множество других свойств ТБ (см., например, обзор Waigmann et al., 2004), описанных ниже.
ТБ увеличивает пропускную способность плазмодесм. При перемещении из первично зараженной клетки в соседнюю вирусы проходят через растительную клеточную стенку, используя для проникновения плазмодесмы (ПД), представляющие собой поры, состоящие из одного или нескольких сквозных микроканальцев, через которые осуществляется сообщение между клетками. Электронные микрофотографии ПД показывают, что эндоплазматический ретикулум (ЭР) и плазматическая мембрана пронизывают пору, образуя непрерывную симпластическую связь между клетками (Ding et al, 1992). Важным параметром ПД является пропускная способность - SEL (size exclusion limit). SEL меняется в ходе развития ПД, уменьшаясь с созреванием листа (Imlau et al, 1999; Oparka et al, 1999). Если в верхних, молодых листьях ПД может пропускать молекулы размером до 50 кДа (Oparka et al, 1999), то SEL в нижних, зрелых листьях ограничена 1 кДа (Tucker, 1982; Barclay et al, 1982; Crawford and Zambrysky, 2000, 2001). Такая пропускная способность позволяет транспортировать только маленькие молекулы, такие как вода, ионы металлов, гормоны и т.д. При заражении табака вирусом табачной мозаики через ПД зрелых листьев проходят и такие огромные структуры как вирусные РНП, однако для этого должно происходить повышение SEL плазмодесм (Wolf et al, 1989; Waigmann et al, 1.994; Waigmann & Zambryski, 1995; Derrick et al, 1992; Angell et al, 1996).
