Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Теломераза 19
1.1.1. Проблема концевой репликации линейных молекул ДНК 19
1.1.2. Теломеры 19
1.1.3. Лимит Хейфлика 21
1.1.4. Теломераза 22
1.1.4.1. Каталитическая субъединица теломеразы hTERT 23
1.1.4.1.1. Регуляция транскрипции гена hTERT 24
1.1.4.1.2. Альтернанивный сплайсинг транскрипта гена hTERT 24
1.1.4.1.3. Пострансляционная модификация белка hTERT 26
1.1.4.1.3.1. Фосфорилирование/дефосфорилирование белка hTERT 26
1.1.4.1.3.2. Транспорт hTERT в ядро 26
1.1.4.2. РНК-компонент теломеразы hTR 27
1.1.4.3. Как работает теломераза 27
1.1.4.4. Теломеры, теломераза и шелтериновый комплекс 28
1.1.4.5. Активность теломеразы в нормальных и опухолевых клетках человека 31
1.1.4.6. Иммортализация, злокачественная трансформация и теломераза 33
1.1.4.6.1. Иммортализация 33
1.1.4.6.2. Злокачественная трансформация 34
1.1.4.7. Активность теломеразы при онкопатологиях щитовидной железы 37
1.2. Онкобелок с-Мус 39
1.2.1. Строение гена и белка 39
1.2.2. с-Мус как транскрипционный фактор 41
1.2.3. Функции с-Мус: регуляция клеточного цикла, дифференцировки и апоптоза 42
1.2.4. с-Мус и теломераза 44
1.2.5. с-Мус при онкопатологиях щитовидной железы 45
1.3. Онкосупрессор р53 47
1.3.1. Строение гена и белка 47
1.3.2. Гены-мишени белка р53 49
1.3.3. Нарушение функций р53 при опухолях 50
1.4. Транскрипционный фактор P65/RelA 52
1.4.1. Семейство транскрипционных факторов NF-KB 52
1.4.2. Структура гена RelA 54
1.4.3. Гены-мишени транскрипционного фактора NF-KB 55
1.4.4. Активность транскрипционных факторов NF-KB при раке 57
1.5. Циклооксигеназа СОХ-2 58
1.6. Матрилизин (ММР-7) 61
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 65
2.1. Материалы 65
2.1.1. Реактивы 65
2.1.2. Приборы и компьютерные программы 65
2.1.2.1. Приборы 65
2.1.2.2. Компьютерные программы 66
2.1.3. Клеточные линии 66
2.1.4. Клинический материал 67
2.2. Методы исследования 71
2.2.1. Анализ активности теломеразы 71
2.2.1.1. Получение экстрактов для анализа активности теломеразы 71
2.2.1.2. Измерение концентрации белка в экстрактах 71
2.2.1.3. Анализ активности теломеразы методом TRAP с
модификациями 72
2.2.2. Анализ экспрессии генов hTERT, с-Мус, р53, СОХ-2, TRF\, p65/RelA,
ММР-1 и р-актина 74
2.2.2.1. Выделение РНК 74
2.2.2.2. ОТ-ПЦР 75
2.2.3. Статистическая обработка результатов 79
2.2.4. ROC-анализ диагностической ценности онкомаркеров 79
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 84
3.1. Подбор праймеров и оптимизация условий проведения ОТ-ПЦР 84
3.2. Анализ активности теломеразы в тканевых и клеточном экстрактах от пациентов с различными онкопатологиями щитовидной железы 87
3.3. Исследование экспрессии генов hTERT, с-Мус, р53, СОХ-2, TRF1, p65/RelA, ММР-1 и З-актина в опухолях щитовидной железы 91
3.4. Особенности экспрессии онкомаркеров и активность теломеразы у больных аутоиммунным тиреоидитом 118
3.5. ROC-анализ диагностической ценности онкомаркеров 121
3.6. Обработка результатов исследования с целью нахождения логистической регрессионной модели, позволяющей определить наличие рака щитовидной железы у пациентов с неаутоиммунными заболеваниями данного
органа 130
Выводы 134
Список литературы 135
- Проблема концевой репликации линейных молекул ДНК
- Каталитическая субъединица теломеразы hTERT
- Получение экстрактов для анализа активности теломеразы
- Подбор праймеров и оптимизация условий проведения ОТ-ПЦР
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Злокачественные опухоли щитовидной железы (ЩЖ) составляют всего 1-3% в общей структуре онкологической заболеваемости. В то же время это самая распространенная опухоль органов эндокринной системы [4]. Статистические данные свидетельствуют о значительном росте этой патологии. За последнее десятилетие количество заболевших раком ЩЖ (РЩЖ) в России увеличилось в 1,5-2 раза в зависимости от региона страны. РЩЖ встречается у людей всех возрастов, но лица трудоспособного возраста составляют большую часть (до 80%) больных [23]. Риск развития злокачественных новообразований ЩЖ, начиная с пубертатного возраста, значительно выше в женской популяции. Так, в возрасте 30-39 лет женщины заболевают в 7 раз чаще мужчин [21]. РЩЖ является причиной смерти 1% больных из общего числа ежегодно умирающих от злокачественных опухолей
Согласно большинству опубликованных работ относительное число случаев РЩЖ среди больных, оперируемых по поводу различных заболеваний ЩЖ, составляет 4,8-22%. Вместе с тем ряд сообщений, преимущественно зарубежных авторов, свидетельствует о гораздо большей распространенности РЩЖ в популяции [23].
До настоящего времени в Российской Федерации поздние стадии (III-IV) РЩЖ устанавливаются более чем у 39% вновь выявленных больных [19]. На начальных стадиях рака ошибки диагностики составляют 50-100%о [6]. Большинство случаев раннего выявления этого заболевания является гистологической находкой при плановом исследовании ткани ЩЖ, удаленной по поводу предполагавшегося доброкачественного заболевания. Основные трудности в своевременной диагностике обусловлены тем, что рак может длительное время существовать под видом или на фоне других заболеваний ЩЖ. Особенно сложной является диагностика раннего рака в связи с отсутствием патагномоничных для него симптомов, частым сочетанием с другими видами патологий ЩЖ. Так, по некоторым данным почти в 90% случаев РЩЖ на ранних стадиях развивается в виде узлового зоба [16].
На данный момент цитологический анализ с применением тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) является «золотым стандартом» в дифференциальной диагностике узловых образований ЩЖ, так как в отличие от других методов диагностики дает морфологическую характеристику узла. Чувствительность цитологического анализа с использованием ТАБ под контролем УЗИ составляет 78%, специфичность - 62%, частота неинформативных пунктатов варьирует от 0 до 32% [23]. В 15-30% случаев стандартная ТАБ не позволяет дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли, имеющие сходную цитоморфологическую картину: фолликулярную аденому (ФА) и фолликулярный рак, а также фолликулярный вариант папиллярного рака и гюртлеклеточные опухоли [35]. Так, по мнению большинства авторов, диагноз фолликулярной карциномы ЩЖ требует демонстрации инвазии капсулы и/или сосудов, то есть может быть установлен только на гистологическом уровне [1]. Таким образом, диагностика РЩЖ остается достаточно сложной и актуальной задачей, особенно в случае высокодифференцированных и ранних форм злокачественной опухоли.
К традиционно рассматриваемым молекулярным маркерам РЩЖ относятся онкогены RAS, BRAF, химерные гены RET/PTC, PAM/PPARy и другие. В 2,6-34% случаев папиллярного рака обнаруживаются перестройки гена RET, в 29-83% случаев - мутации в гене BRAF [132]. Для фолликулярного рака характерными являются мутации в гене RAS (18-52% случаев), в то же время они обнаруживаются и при ФА практически с такой же частотой (24-52%) [125]. Поскольку ни один из предложенных онкомаркеров не обладает 100% чувствительностью и специфичностью, и ценность этих маркеров в диагностике ранних форм рака достаточно низка, в мире продолжаются исследования, направленные на выявление новых эффективных онкомаркеров РЩЖ. Цель исследования.
Цель данной работы состояла в оценке значимости теломеразы и других онкомаркеров (СОХ-2, TRP1, ММР-7, с-Мус, р53, RelA) в дифференциальной диагностике рака и доброкачественных новообразований щитовидной железы, таких как коллоидный зоб, фолликулярная аденома и аутоиммунный тиреоидит.
Задачи исследования.
1) Оптимизировать условия проведения анализа экспрессии генов СОХ-2, TRFI, ММР-7, с-Мус, р53 и RelA методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР.
2) Провести полуколичественный анализ экспрессии генов потенциальных онкомаркеров (hTERT, СОХ-2, TRF1, ММР-7, с-Мус, р53, RelA) методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР в клинических образцах тканей, полученных от пациентов с различными новообразованиями щитовидной железы, а именно папиллярным и фолликулярным раком, фолликулярной аденомой, коллоидным зобом и аутоиммунным тиреоидитом.
3) Исследовать активность теломеразы с помощью модифицированного метода TRAP (telomeric repeat amplification protocol) в клинических образцах тканей, полученных от пациентов с папиллярным и фолликулярным раком, фолликулярной аденомой, коллоидным зобом и аутоиммунным тиреоидитом.
4) Оценить значимость предложенных онкомаркеров для диагностики рака щитовидной железы с помощью ROC-анализа и выбрать онкомаркеры, имеющие наилучшую диагностическую эффективностью в отношении рака щитовидной железы.
5) Разработать логистическую регрессионную модель диагностики рака щитовидной железы у больных с новообразованиями щитовидной железы с использованием наиболее значимых онкомаркеров.
Научная новизна исследования.
Впервые проведено одновременное комплексное исследование относительных уровней экспрессии генов hTERT, СОХ-2, TRFI, ММР-1, с-Мус, р53, RelA, а также активности теломеразы (AT) в опухолях, полученных от больных с РЩЖ, КЗ, ФА и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ, что позволило получить новые данные об участии этих факторов в развитии опухолевого процесса в данном органе.
В работе впервые показано, что в дифференцированных карциномах ЩЖ (папиллярный и фолликулярный рак) одним из механизмов инактивации онкосупрессора р53 является подавление экспрессии гена р53 на транскрипционном уровне.
Впервые обнаружено, что при РЩЖ наблюдается тенденция к уменьшению уровня экспрессии гена TRFI по сравнению с КЗ, ФА и АИТ.
Впервые описаны различные варианты альтернативного сплайсинга пре-мРНК RelA в опухолях ЩЖ.
Получены новые данные по экспрессии генов некоторых молекулярных маркеров при АИТ, дополняющие представления об АИТ как о сложном в патогенетическом отношении заболевании.
Практическая значимость работы.
Проведена оптимизация условий анализа экспрессии генов СОХ-2, TRFI, ММР-1, с-Мус, р53 и RelA методом ОТ-ПЦР. Оптимизированные методики апробированы на клинических образцах тканей больных с различными новообразованиями ЩЖ.
Осуществлен сравнительный анализ различных показателей, определяющих ценность предложенных онкомаркеров в дифференциальной диагностике новообразований ЩЖ: чувствительности, специфичности, точности, положительной и отрицательной прогностической ценности, отношений правдоподобия положительного и отрицательного результатов, отношение шансов диагностического теста. Установлено, что наиболее полезными для диагностики РЩЖ являются онкомаркеры СОХ-2, р53 и TRF1, менее полезными - с-Мус и ММР-7, не имеющими диагностического значения -RelAnhTERT.
Разработана логистическая регрессионная модель дифференциальной диагностики РЩЖ у больных с неаутоиммунными заболеваниями данного органа на основе оценки относительных уровней экспрессии генов СОХ-2, р53, TRFI и ММР-7. Полученные данные позволяют провести дополнительные исследования на материале ТАБ на предмет создания диагностического теста с целью выявления РЩЖ на дооперационном этапе.
Высокая AT в постоперационных образцах у больных РЩЖ выявлена в среднем 2,2 раза чаще, чем у больных с ФА, и в 4 раза чаще, чем у больных с КЗ. Так как активная теломераза является маркером злокачественности в непролиферирующих нормальных тканях и в нашем исследовании AT обнаружена у 71% больных РЩЖ, после проведения дополнительных исследований анализ AT в ТАБ может быть предложен в качестве прогностического критерия развития РЩЖ у пациентов с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ.
Проблема концевой репликации линейных молекул ДНК
Проблема неполной репликации концов ДНК связана с тем, что ДНК-полимераза, в отличие от РНК-полимеразы, не способна синтезировать дочернюю полинуклеотидную цепь в отсутствии «праймера-затравки» [5]. Она может лишь наращивать уже имеющуюся полинуклеотидную нить, последовательно присоединяя дезоксирибонуклеотиды к ее 3 -концу [7]. В качестве таковой используется комплементарно присоединенная вдоль матричной цепи ДНК короткая праймерная РНК (менее 20 нуклеотидов), которая в состав реплики ДНК не включается [5]. После удаления РНК-праймеров фрагменты Оказаки, с помощью которых идет синтез отстающей цепи, сшиваются (в качестве затравки используется 3 -конец соседнего фрагмента Оказаки) (рис.1).
Удаление крайних РНК-праймеров, комплементарных 3 -концам обеих цепей линейной «материнской» молекулы ДНК, приводит к тому, что дочерние цепи оказываются короче на 10-20 нуклеотидов (у разных видов размер РНК-праймеров различен) [7]. Проблемы неполной репликации концов ДНК не существует в случае репликации кольцевых молекул ДНК прокариотических клеток, а также в митохондриях эукариотических клеток [5].
Таким образом, каждый цикл репликации ядерной ДНК эукариотических клеток сопровождается невосполнимой потерей небольшого участка на конце хромосомы.
Хромосомы соматических клеток человека несут на концах тандемные повторы TTAGGG — теломеры (от греч. telos - конец и meros — часть), которыми не кодируются уникальные белки. Поэтому потеря ДНК в пределах этих концевых участков не приводит к быстрой гибели клетки. Именно из таких, обогащенных гуанином, последовательностей ДНК состоят неспаренные 3 -концы ДНК, выступающие за пределы двойной спирали (G-богатые цепи). В пределах этого З -оверхэнга у концевых повторов ДНК имеются комплементарные им обогащенные цитозином партнеры. На конце ДНК, который соответствует 5 -концу матричной цепи, ничто не мешает полному завершению репликации, и З -конец ДНК не должен формировать З -оверхэнг. Однако и там имеется выступающий З -конец, обогащенный гуанином. Он появляется в результате действия специальных экзонуклеаз, которые укорачивают обогащенный цитозином 5 -конец.
Интересно, что у таких организмов как S. cerevisiae [69], гены, расположенные рядом с теломерами, находятся в репрессированном состоянии. Этот феномен получил название «telomere position effect» (ТРЕ). В свою очередь, чрезмерное укорочение теломер может активировать транскрипцию этих генов. Относительно генов, которые регулируются ТРЕ в хромосомах человека, известно мало. Обнаружение генов, чувствительных к укорочению теломер, или «telomere shotening-sensetive genes» (TSSG), позволит расширить представления о роли самих теломер. Относительно недавно стало известно, что у мышей чрезмерное укорочение теломер ведет к активации экспрессии онкосупрессора р53 [47]. В связи с этим, ген белка р53 может быть одним из TSSG-генов.
Еще в 1971 г. отечественный ученый A.M. Оловников в своей теории маргинотомии (от лат. marginalis — краевой, tome - сечение) предположил, что постепенное укорочение ДНК хромосом при репликации может лежать в основе ограниченного потенциала удвоения, наблюдаемого у нормальных соматических клеток, растущих в культуре in vitro, так называемого «лимита Хейфлика». Американский ученый Леонард Хейфлик в начале 60-х годов показал, что если для культивирования взять клетки новорожденных детей, то они могут пройти 80-90 делений, в то время как соматические клетки от 70-летних делятся только 20-30 раз. Ограничение числа делений клетки и называют лимитом Хейфлика [7].
Известно, что в ходе пассирования некоторых клонов нормальных клеток (например, фибробластов человека) происходит укорочение теломер в среднем на 50 пар нуклеотидов за каждый цикл деления. Подобное укорочение хромосом происходит in vivo в лейкоцитах периферической крови, клетках эпидермиса кожи, в эпителии кишечника человека.
A.M. Оловников выдвинул гипотезу о существовании особого биологического механизма, решающего проблему концевой репликации, предположив, что он действует в клетках организмов, размножающихся вегетативным путем, а также в половых и раковых клетках, но не работает в большинстве соматических клеток.
Каталитическая субъединица теломеразы hTERT
Компоненты малых ядерных нуклеопротеинов snoRNP - белки дискерин, GAR IP, NHP2P и NOP ЮР - взаимодействуют с РНК-матрицей TR. Шапероны Hsp90 и р23 необходимы для ассоциации субъединиц теломеразы TR и TERT и сборки активного холоэнзима. Белок ТЕР1 взаимодействует с TR и TERT. состоит как минимум из двух hTR-молекул [137] и двух hTERT-субъединиц [33], таким образом, теломеразный комплекс способен удлинить два конца хромосомы за один раунд элонгации.
Помимо двух основных компонентов теломераза включает несколько белков (рис.2), среди которых наиболее изучен hTEPl [74]: он участвует в формировании активного теломеразного комплекса, связываясь с hTERT и hTR.
Регуляция активности каталитической субъединицы теломеразы hTERT может осуществляться на нескольких уровнях: 1) активация или репрессия транскрипции гена hTERT; 2) управление сплайсингом первичного транскрипта гена hTERT; 3) пострансляционная модификация белка hTERT.
У человека единичная копия гена hTERTнаходится на конце хромосомы 5р [148]. Такое расположение гена (рядом с теломерами) позволяет сделать предположение об участии в регуляции его транскрипции ТРЕ.
Брюс и соавт. [42] обнаружили увеличение числа копий гена hTERT в некоторых видах опухолей. Большинство опухолевых клеточных линий имеют 2-4 копии гена hTERT. Предполагается, что «эффект количества» приводит к реактивации теломеразы, так как для такого большого количества копий гена недостаточно репрессоров.
Ген hTERT содержит более 37 т.п.н. и состоит из 16 экзонов и 15 интронов (рис.3). Похожая организация гена выявлена у Tetrahymena thermophila и Schizosaccharomyces pombe с 18 и 15 нитронами соответственно, в то время как гены hTERT Oxytricha trifallax, Euplotes aeduculatus и S. cerevisiae не содержат интронов [54; 184].
Область промотора гена hTERT не содержит консенсусных последовательностей типа СААТ и TATA, однако имеет протяженные GC-богатые участки. Последние образуют CpG-островки вокруг ATG-последовательности, что позволяет предположить о потенциальной роли метилирования в регуляции экспрессии гена hTERT. Промоторный участок гена hTERT содержит участки связывания для ряда факторов транскрипции: активаторов - эстрогена, с-Мус, Spl, HPV16 Е6, АР-2, HIF-la, Ets и репрессоров - ретиноевой кислоты, Mad, E2F-1, Р53, PI6, WT1, USF, CTCF, MZF-2 [82].
Полноразмерная мРНК hTERT состоит из -4000 нуклеотидов. На сегодняшний день обнаружено несколько вариантов сплайсинга hTERT транскрипта [76; 95; 194]. По типу делеции существует а- вариант - делеция в 36 нуклеотидов с 5 -конца экзона 6 ведет к потере 12 аминокислот из обратнотранскриптазного мотива А, (З-вариант, характеризующийся полной потерей 7 и 8 экзонов (делеция в 182 нуклеотида) из, у-вариант - делеция в 189 нуклеотидов в экзоне 11. По типу вставки существуют варианты, характеризующиеся включением 38 нуклеотидов в 4 интрон, частичной вставкой в 11 интрон, вставкой 159 нуклеотидов в 14 интрон, а также может быть замена всего 15 экзона и 5 -участка 16 экзона на первые 600 нуклеотидов 14 интрона. Показано, что в случае а-варианта снижается AT в теломеразопозитивных клетках, вызывая тем самым укорочение теломер и клеточную гибель [195].
Теломеразная активность проявляется только в тех клетках, в которых белок hTERT содержит полноразмерные обратнотранскриптазные мотивы А и В [170]. Однако существуют теломеразонегативные клетки, экспрессирующие hTERT с полноценными А и В мотивами, что свидетельствует о существовании посттрансляционных механизмов регуляции AT.
Белок hTERT состоит из 1132 аминокислот, имеет молекулярную массу 127 кДа, pi (изоэлектрическая точка) 11,3 и включает теломеразоспецифичный Т-мотив и семь обратнотранскриптазных RT-мотивов (1, 2, А, В, С, D, Е) на С-конце (рис.3) [115; 116; 126].
Белок hTERT может быть модифицирован путем фосфорилирования различными протеинкиназами [2]. В опухолевых клетках часто наблюдается усиление активности некоторых форм протеинкиназы С (ИКС). В клеточных линиях рака молочной железы и карциномы носоглотки, а также в культуре мононуклеарных клеток крови, ПКС является, по-видимому, одним из ферментов, опосредующих фосфорилирование белковых субъединиц hTEPl и hTERT, причем эта функция ПКС необходима для AT. Протеинфосфатаза 2А (РР2А), в свою очередь, ингибирует AT.
В раковых клетках протеинкиназа В (Akt) фосфорилирует hTERT по остатку серина в 824 положении, что приводит к повышению AT.
Получение экстрактов для анализа активности теломеразы
Клетки трижды промывали холодным PBS, осаждая их центрифугированием при 344 g в течение 10 мин при +4С. После промывания к клеткам добавляли холодный лизирующий CHAPS-буфер, содержащий 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, ОД мМ PMSF, 5 мМ (3-меркаптоэтанола, 0,5% (в/о) CHAPS и 10% (в/о) глицерина. Лизирующий буфер добавляли из расчета 1 мкл на 1000 клеток. Клеточный осадок ресуспендировали и инкубировали на льду в течение 30 мин. В процессе инкубации осадок интенсивно перемешивали через каждые 5 мин. Полученный клеточный экстракт центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин при +4С, после чего супернатант переносили в чистые пробирки и быстро замораживали в жидком азоте. Готовые экстракты хранили при -70С.
При использовании образцов тканей стадии лизирования предшествует стадия гомогенизации. Замороженный образец (30 мг) помещали в стеклянный мини-гомогенизатор и гомогенизировали в течение 1 мин в 400 мкл лизирующего CHAPS-буфера при +4С. Далее делали перерыв в 5 мин и повторяли гомогенизирование. Такое прерывистое гомогенизирование проводили в течение 30 мин. Затем, как и при обработке клеток, гомогенат клеток центрифугировали, отбирали супернатант, разделяли его на аликвоты, которые быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -70С.
Измерение концентрации белка в экстрактах Концентрацию белка в экстрактах из клеток и тканей определяли с помощью красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 по методу Брэдфорд [41] с некоторыми модификациями. Анализ активности теломеразы методом TRAP с модификациями
Определение активности теломеразы в экстрактах из клеток и тканей проводили с помощью модифицированного метода TRAP. Предложенный Кимом и соавт. метод TRAP [96] основан на ПЦР-амплификации продуктов теломеразной реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера. Этот метод состоит из двух этапов. Сначала к экстракту клеток добавляется олигонуклеотидный субстрат, который при наличии в экстракте активной теломеразы удлиняется за счет присоединения ферментом теломерных последовательностей к 3 -концу праймера-субстрата. Затем удлиненный олигонуклеотид амплифицируется методом ПЦР с использованием праймеров TS и СХ. Амплифицированные продукты теломеразной реакции детектируются ауторадиографически после разделения гель-электрофорезом. При этом наблюдается «лестница» дискретных полос (TRAP-продукты) с периодичностью в 6 п.н. Образец считается теломеразопозитивным при выявлении трех и более таких полос с шагом в 6 п.н.
В данной работе метод TRAP использовали с некоторыми модификациями [68]. Элонгацию олигонуклеотидного субстрата и последующую амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8); 16,6 мМ (NH4)2S04; 0, 01% Tween-20; 1,5 мМ MgCl2; 1 мМ EGTA; 50 мМ каждого dNTP; 0,1 мкг TS-праймера (5 -ATTCCGTCGAGCAGAGTT-3 ); 1-Ю мкл тканевого экстракта, содержащего 0,7 и 8 мкг белка или 1 мкл клеточного экстракта, разбавленного лизирующим буфером CHAPS и эквивалентного 1000 клеток опухолевой линии (для положительного контроля). Опосредованное теломеразой удлинение TS-праймера происходило при инкубации реакционной смеси при 37С в течение 25 мин. По окончании инкубации смесь выдерживали 5 мин при 94С для инактивации теломеразы, а затем добавляли 0,1 мкг СХ-праймера (5 -СССТТАСССТТАСССТТАСССТАА-3 ) и 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Реакционную смесь амплифицировали в течение 35 циклов ПЦР в следующем режиме: 94С - 60 сек, 50С - 60 сек, 72С - 90 сек. Разделение амплификационных продуктов осуществляли методом электрофореза в 10% неденатурирующем ПААГ, используя ІхТВЕ буфер. Образцы после ПЦР вносили в лунки геля в объеме 10 мкл, предварительно смешав их с лидирующим красителем Orange G. Электрофорез проводили в течение 20 мин при напряженности электрического поля 36 В/см. Визуализацию разделенных TRAP-продуктов проводили на УФ-трансиллюминаторе (X 300 нм) после окрашивания геля в течение 30 мин в растворе красителя SYBR Gold (разведенного деионизованной водой 1:10000) при комнатной температуре и в темноте. Окрашенные гели фотографировали цифровой камерой. Полученные цифровые фотографии TRAP-продуктов оценивали визуально и с помощью программы для анализа изображений ImageJ 1.351. При этом исследуемые пробы сравнивались с контрольным образцом экстрактом, полученным из клеток линии Вго и содержащим 0,7 мкг белка.
Теломеразная активность в контрольном образце принималась за единицу. Исследуемый образец считался теломеразопозитивным и подлежал обсчету при выявлении трех и более горизонтальных полос, располагающихся на расстоянии друг от друга, отличающимся на длину (6 п.н.) одного теломерного повтора. После полуколичественного анализа AT в экстрактах, содержащих 8 мкг белка, производили деление пациентов на группы с высокой AT (при уровне AT 0,4 отн.ед.), средней (0,2-0,39 отн.ед.), низкой (0,1-0,19 отн.ед.) и тех, у кого AT отсутствует.
В качестве отрицательного контроля использовали образец, в который вместо клеточного экстракта вносили чистый лизирующий CHAPS-буфер. Положительным контролем служил экстракт клеток теломеразопозитивной опухолевой линии
Подбор праймеров и оптимизация условий проведения ОТ-ПЦР
Для корректного полуколичественного анализа экспрессии генов необходимо было подобрать эффективные и специфичные праймеры для амплификации кДНК. Нами были проанализированы и выбраны опубликованные последовательности праймеров, комплементарные разным экзонам исследуемых генов, что позволило проводить анализ экспрессии генов даже в присутствии микропримесей геномной ДНК. Последовательности подобранных праймеров приведены в главе «Материалы и методы исследования» (табл.8).
Оптимизация условий ПЦР с выбранными праймерами была проведена на тотальной клеточной РНК, полученной из клеток линии меланомы человека Вго. Подбор условий ПЦР с праймерами к гену ММР-1 в виду отсутствия экспрессии этого гена в линии Вго осуществлялся с кДНК ЩЖ при температуре отжига (58С), рекомендуемой программой Oligo Ver.6.67.
Температурно-временные режимы ПЦР должны подбираться с учетом длины и состава праймеров, длины ПЦР-продукта, типа используемой ДНК-полимеразы, состава буфера и объема реакционной смеси, типа амплификатора и используемых пробирок. Для оптимизации условий реакцию ПЦР проводили с использованием значений температур отжига, находящихся в интервале 52-62С. На рис. 14 представлены результаты выхода специфических продуктов ОТ-ПЦР при различных температурах отжига праймеров. Оптимальная температура отжига для пар праймеров, подобранная нами экспериментально, составила 54С для СОХ-2 и TRF1; 56С для RelA; 58С для р53. В случае с-тус экспериментально подобранная температура отжига (62С) значительно превышала рассчитанную по программе (56С), т.к. при 62С наблюдалось исчезновение неспецифической полосы ПЦР-продукта размером около 120 п.н., расположенной ниже ожидаемой полосы ампликона (191 п.н.) (рис.14, А). Кроме того, для корректного определения относительной экспрессии исследуемых генов необходим правильный подбор оптимального количества циклов ПЦР при амплификациях соответствующих кДНК анализируемых генов с помощью специфических праймеров. Расчеты проводились на основании анализа экспоненциальных кривых выхода специфического ампликона. На рис 15. представлен выход специфических продуктов ОТ-ПЦР при проведении различного числа циклов ПЦР с кДНК линии Вго. При выборе оптимального количества циклов ПЦР с праймерами к гену ММР-1 в качестве матрицы в реакции ОТ использовали тотальную РНК, полученную из образцов ФА и РЩЖ (рис.16).
Таким образом, в результате оптимизации ПЦР были выбраны условия амплификации кДНК исследуемых генов, представленные в табл.9 главы «Материалы и методы исследования». М 56 58 60 62 М 54 56 58 60 62 М 54 56 58 60 Рис. 14. Анализ экспрессии генов RelA (A), TRF\ (Б), СОХ-2 (В), с-Мус (Г) и р53 (Д) методом ОТ-ПЦР при различных температурах отжига праймеров. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в 1,5% (Б-Д) и 2% (А) агарозных гелях, содержащих 5 мкг/мл бромистого этидия. Стрелками указаны положения и размер специфических продуктов ОТ-ПЦР. Цифрами над дорожками обозначены различные температуры отжига праймеров. М - маркер молекулярной массы ДНК «Gene Ruler 100 bp DNA Ladder Plus». В качестве РНК-матрицы на стадии ОТ использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК, полученной из клеточной линии Вго. 25 27 29 ЗО 32 34 27 29 31 33 Рис. 15. Выход специфических продуктов ОТ-ПЦР при проведении различного числа циклов ПЦР. Анализ экспрессии генов с-Мус (A), RelA (Б), TRF\ (В), СОХ-2 (Г) и р53 (Д) методом ОТ-ПЦР. Электрофорез специфических продуктов ОТ-ПЦР в 1,5% (Б-Д) и 2% (А) агарозных гелях, содержащих 5 мкг/мл бромистого этидия. Цифрами над дорожками указано количество циклов ПЦР. Стрелками указаны положение и размер специфических продуктов ОТ-ПЦР. В качестве РНК-матрицы на стадии ОТ использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК, полученной из клеточной линии Вго (меланома человека).
Выход специфических продуктов ОТ-ПЦР с праймерами к гену ММР-1 при проведении различного числа циклов ПЦР. Электрофорез специфических продуктов ОТ-ПЦР в 1,5%» агарозном геле, содержащем 5 мкг/мл бромистого этидия. Цифрами над дорожками указано количество циклов ПЦР. В качестве РНК-матрицы на стадии ОТ использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК, полученной из ткани ЩЖ двух пациентов РЩЖ (А, Б) и пациента с ФА (В). 3.2. Анализ активности теломеразы в тканевых и клеточном экстрактах от пациентов с различными онкопатологиями щитовидной железы
При использовании в TRAP-анализе реакционной смеси, содержащей 0,7 мкг белка, AT была выявлена у шести из 14 (43%) пациентов со злокачественными опухолями ЩЖ, семи из 19 (21%) пациентов с ФА и только у одного больного (9%) с КЗ. При АИТ AT детектировалась в 100% случаев (рис.17). При этом в четырех из восьми образцов РЩЖ, в которых не детектировалась AT в случае использования 0,7 мкг белка лизата, AT была выявлена при добавлении в реакцию 8 мкг белка (рис.18). Таким образом, присутствие активной теломеразы было подтверждено для 71% больных РЩЖ. Следовательно, использование в TRAP-анализе 8 мкг белка повышает чувствительность анализа AT в отношении рака. В то же время при увеличении количества экстракта, добавляемого в реакцию до 8 мкг по белку, повышается частота выявления AT у больных с доброкачественными опухолями ЩЖ: у больных с КЗ до 63,6% (семь пациентов), у больных с ФА до 37% (семь пациентов) (рис.18). Так как активная теломераза является маркером злокачественности в непролиферирующих нормальных тканях и в нашем исследовании AT обнаружена у 71% больных РЩЖ, выявление AT в доброкачественных опухолях ЩЖ может быть признаком ранней стадии злокачественной трансформации, не определяемой при гистологическом исследовании. В связи с этим, анализ AT в материале ТАБ после дополнительных исследований может быть использован в качестве прогностического критерия развития РЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ.
