Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
ГЛАВА II. Материалы и методы 20
ГЛАВА III. Результаты 32
I. Кутикулярный эпителий 32
1. Эпителиальные клетки 32
2. Кутикула 33
3. Гранулярные клетки в покровном эпителии 46
II. Клетки полостной жидкости 71
1. Эритроциты 71
2. Гранулоциты 83
3. Обновление клеток полостной жидкости
III. Защитные реакции клеток полостной жидкости 104
1. Фагоцитоз 104
2. Коагуляция полостной жидкости 108
3. Инкапсуляция инородных тел 127
4. Репаративные процессы в покровах 136
ГЛАВА ІV. Обсуждение 157
Выводы 208
Литература 210
- Гранулярные клетки в покровном эпителии
- Обновление клеток полостной жидкости
- Коагуляция полостной жидкости
- Репаративные процессы в покровах
Введение к работе
Проблема взаимоотношений тканей внутренней среды и эпителиальных тканей была впервые поставлена в эволюционном плане А.А.Заварзиным на основании серии экспериментальных исследований, проведенных на представителях различных групп беспозвоночных животных - моллюсках, олигохетах, насекомых, ракообразных (Заварзин, 194-5, 1947). Актуальность этой проблемы стала еще более очевидной в настоящее время в связи со значительным усовершенствованием методов исследования и углублением критериев, по которым можно сопоставлять эти первичные ткани многоклеточных, а также характер их взаимодействия у представителей различных групп животных.
Исследования, проводимые на кафедре цитологии и гистологии ЛГУ, позволили сформулировать представление о гранулярных амебоцитах, как широко распространенном типе подвижных клеток тканей внутренней среды у беспозвоночных животных (обзор: Заварзин, 1981).
Гранулярные амебоциты представляют собой амебоидно-подвижные клетки, содержащие в цитоплазме многочисленные гранулы и осуществляющие комплекс защитных реакций (коагуляция, инкапсуляция, репарация повреждений за счет выведения материала гранул и образования на его основе межклеточного вещества. Гранулярные амебоциты встречаются в циркуляторных системах различного типа и представлены у самых разных групп животных, например, у Hydrozoa, Echinodermata, Arthropoda, Ascidiacea. ЭТИМ животным можно противопоставить такие группы, как, например, моллюски, у которых защитные реакции (инкапсуляция инородных тел и репарация поврежденных тканей) осуществляются клетками крови, трансформирующимися в фибробласты и синтезирующими межклеточное вещество - коллаген - in situ (Иотапина, 1978; Старостин и др., 1979; Sminia, 1981).
Дальнейшее изучение этого вопроса показало также, что в типичных случаях животные, обладающие гранулярными амебоцитами, имеют кутикулярный покров сходного строения. Кутикулярная пластинка у них всегда подразделяется на два основных слоя. В основе внутреннего слоя - эндокутикулы - лежит сеть линейных молекул нейтрального полисахарида, погруженная в гликопротеид-ный матрикс. Наружный слой - экзокутикула - имеет преимущественно белковую природу и подвергается дополнительной стабилизации (обычно за счет фенольного дубления). Такая организация кутикулярной пластинки характерна для всех членистоногих, ас-цидий и гидроидных полипов. У многих других беспозвоночных кутикула имеет принципиально иное строение: ее основу составляет система коллагеновых фибрилл, погруженных в гликопроте-идный матрикс, а сама кутикулярная пластинка не имеет дополнительно стабилизированного наружного слоя. Подобная кутикула встречается у аннелид, сипункулид, погонофор и некоторых других животных. У животных с кутикулярной пластинкой этого типа, например, у кольчатых червей, гранулярные амебоциты не найдены .
Еще один существенный момент состоит в том, что гранулярные амебоциты не только выполняют защитные функции, но и принимают участие в формировании кутикулярной пластинки. Так обстоит дело у асцидий ( Barrington, Thorpe, 1968; Чага, 1980, 1983), гидроидных полипов (Knigth, 1970, 1971) и, вероятно, насекомых и ракообразных (см. например, Denneii, 194-7; Vacca, Finserman, 1983; см. также обзоры: Orossley, 1975; Bruaet,
1980).
Как можно заметить, указанное выше сходство в организации кутикулярного эпителия и системы гранулярных амебоцитов проявляется у групп животных, далеко отстоящих друг от друга в филогенетическом отношении. Таким образом, эти примеры демонстрируют определенную закономерность эволюционной динамики кутикулярного покрова и подвижных клеток тканей внутренней среды беспозвоночных. Изучение такого рода закономерностей возможно благодаря применению разработанного в 1925 году А.А.Заварзиньш метода функциональных аналогий, ставшего в настоящее время основой сравнительно-гистологических исследований (обзор: Заварзин, 1981). Применение этого метода основано на изучении тканевой организации неродственных групп животных, что позволяет выявить спектр возможных модификаций строения функционально-аналогичных тканей и закономерные (то есть функционально ооусловленные) сходства между ними.
Дальнейшее исследование системы гранулярных амебоцитов и их связи с кутикулярным эпителием требует, с одной стороны, изучения этих тканевых систем у животных, неродственных упомянутым выше группам, а с другой стороны, более полного исследования их структурно-функциональной организации (см. например, Чага, 1983). В этой связи наше внимание привлекли при-апулиды - группа животных с неясным, но, безусловно, ооособ-ленным систематическим положением.
Строение кутикулы и клеток полостной жидкости у приапу-лид остается до настоящего времени изученным недостаточно. Однако в литературе имеются данные, позволившие предположить, что в полостной жидкости этих животных имеются клетки ("лейкоциты"), аналогичные гранулярным амебоцитам (Mattisson, - б - Pange, 1973) и что кутикула приапулид имеет строение, характерное для животных, обладающих гранулярными амебоцитами (см-. например, Carlisle, 1959; Shapeero, 1962; Moritz, 1972; Заварзин, 1973). Имеются даже указания на миграцию "лейкоцитов" в толщу кутикулярной пластинки (Molcanov, 1908).
Таким образом, задача нашей работы состояла в том, чтобы подробно исследовать кутикулярный эпителий и клетки полостной жидкости приапулид, дать характеристику структурно-химической организации этих тканей, а также выявить проявление характерных функциональных особенностей отдельных тканевых элементов -в экспериментальных условиях и в нормальных гистогенезах (процессах линьки, при обновлении клеток полостной жидкости). Кроме того, перед нами стояла задача сопоставить полученные данные, включая сведения по взаимосвязи кутикулярного эпителия и клеток полостной жидкости, с соответствующими данными в отношении других групп животных (асцидии, насекомые, ракообразные, мечехвосты), неродственных приапулидам, но облатйющих функционально аналогичными подвижными клетками тканей внутренней среды и кутикулярным эпителием.
Для решения поставленной задачи было проведено комплексное изучение покровов и клеток полостной жидкости приапулид Priapulus caudatus и Halicryptus spinulosus С применением светооптических, электронномикроскопических, авторадиографи-ческих, гистохимических и экспериментальных методов исследования.
Полученные данные позволили выяснить строение и химическую организацию кутикулярного эпителия и клеток полостной жидкости у двух видов приапулид. Кутикула этих животных по своей морфо-биохимической организации оказывается сходной с кутикулами членистоногих и асцидий. Кутикулярная пластинка приапулид, так же как у этих животных, подразделяется на два основных слоя - эндокутикулу, содержащую хитин, незначительное количество белков и сульфатированные полисахариды, и экзо-кутикулу, целиком образованную задубленными белками. В участках кутикулярного покрова со значительными механическими нагрузками (например, глоточные зубы) экзокутикула подвергается дополнительному фенольному дублению, что приводит к образованию гистохимически инертной, "сверхзадубленной" кутикулы (эк-зокутикулы II), наличие которой свойственно и для кутикулярного покрова асцидий и членистоногих.
Полостная жидкость приапулид содержит два типа клеток: . эритроциты и гранулоциты. При изучении эритроцитов, наряду с особенностями организации, общими для клеток с респираторной функцией у беспозвоночных, удалось выявить существенные различия в строении этих клеток у двух близких родов* J одного из них увеличение удельной поверхности эритроцитов достигается благодаря уплощенной форме, у другого - при помощи системы инвагинаций плазматической мембраны, совершенно необычной для клеток с респираторной функцией.
Особое внимание в работе было уделено исследованию второго типа клеток полостной жидкости - гранулоцитам. Полученные с помощью разносторонних методических подходов данные показывают, что они являются типичными гранулярными амебоцитами. Цитоплазма гранулоцитов содержит специфические гранулы с характерной для этого типа клеток упаковкой секрета в виде тубуляр-ных структур. С помощью гистохимического анализа показано, что по химической организации материала гранул гранулоциты приапулид существенно отличаются от гранулярных амебоцитов асцидій, насекомых и ракообразных отсутствием в них компонен- . тов фенолоксидазной системы и богатым содержанием дисульфид-ных связей.
Гемопоэтические органы и малодифференцированные клетки у приапулид не найдены, а к пролиферации способны дифференцированные клетки полостной жидкости - эритроциты и гранулоциты, причем данные тимидиновои авторадиографии указывают на возможную периодичность обновления клеток полостной жидкости.
Гранулоциты приапулид, так же как аналогичные клетки ас-цидий и членистоногих, осуществляют целый комплекс защитных реакций: коагуляция полостной жидкости, фагоцитоз и инкапсуляция инородных тел, репарация поврежденных тканей. В основе всех защитных реакций (кроме фагоцитоза) лежит образование межклеточного вещества за счет выведения материала гранул гранулоцитов путем экзоцитоза (до настоящего времени происхождение межклеточного вещества было установлено только для мечехвостов и асцидий).
Сравнение собственных и литературных данных показало специфические черты функционирования системы гранулярных амебоцитов в разных группах животных, касающиеся их взаимодействия с кутикулой в норме и при репарации поврежденных покровов. Отсутствие в гранулоцитах приапулид компонентов фенолоксидазной системы исключает возможность их участия в фенольном дублении кутикулы при ее построении, что характерно для асцидий и большинства членистоногих. Вместе с тем, гранулоциты, как и гранулярные амебоциты у других рассматриваемых групп, участвуют в репаративных процессах при повреждении целостности покровов, причем в механизмах этих процессов у приапулид наблюдаются черты, сближающие их как с асцидиями, так и с членистоногими. Таким образом, гранулоцити приапулид представляют собой своеобразную модификацию гранулярных амебоцитов, обнаруженную до сих пор только у одной из групп членистоногих - мечехвостов (у которых гранулярные амебоциты также не содержат компонентов фенолоксидазнои системы, а белок их гранул богат дисульшидными связями).
Полученные в нашей работе материалы еще раз показывают плодотворность применения в современных исследованиях сравнительно-гистологического анализа по принципу функциональной аналогичности как метода изучения тканей внутренней среды и их взаимодействия с другими тканевыми системами.
Гранулярные клетки в покровном эпителии
Размеры и форма эпителиальных клеток, так же как толщина кутикулярной пластинки, различны в разных отделах тела приапулид и варьируют в зависимости от степени сокращения животного. Так например, у P.caudatus плоские клетки гиподермы туловища при сильном сокращении стенки тела могут становиться кубическими, на хоботе гиподермальные клетки всегда имеют кубическую или слегка призматическую форму , эпителий глоточных зубов представлен сильно вытянутыми призматическими клетками
Под задней кишкой мы понимаем только короткий, выстланный кутикулярным эпителием концевой участок кишечника. В литературе задней кишкой называют иногда расширенный каудальный участок пищеварительного тракта. Однако по гистологическим особенностям он, безусловно, представляет собой часть средней кишки. (рис. 2, А, Б, В, Д, Е, 3).
Цитоплазма эпителиальных клеток дает слабые реакции на общие белки (бромфеноловый синий, прочным зеленый при рН 2,2) и нейтральные полисахариды (ШИК-реакция). Гиподерма туловища и других отделов тела почти не имеет включений, различимых на светооптическом уровне, за исключением эпителиальных клеток глотки, цитоплазма которых содержит большое количество гранул (рис. 2, В; б, В, Г). Гранулы сильно преломляют свет и по большей части имеют бурый или черный цвет. Скоплением таких гранул объясняется темная окраска глоточных зубов у большинства животных. Гранулы в эпителии глотки дают слабые положительные реакции на белки, полисахариды, фенольные соединения (рис. б, Г), железо и, вероятно, имеют пигментную природу.
Покровный эпителий обоих видов приапулид синтезирует кутикулу, которая во всех отделах тела имеет двуслойное строение (рис. I). Внутренний, обычно более толстый слой, мы будем называть эндокутикулой, тонкий наружный - экзокутикулой. Оба слоя хорошо различимы на неокрашенных парафиновых срезах, поскольку более плотная экзокутикула сильно преломляет свет. Различие в химической природе слоев кутикулы выявляется уже при ряде морфологических окрасок, таких как азановыи метод по Гейденгайну, окраска по Маллори, гемалаун - эозин (рис. 4; 5; б, А). Наиболее удобной окраской для изучения структуры кутикулы приапулид оказался азановыи метод, при котором эндо-кутикула окрашивается в голубой, а экзокутикула - в красный цвет.
У P.caudatus кутикулярная пластинка туловища и каудальных отростков представлена в основном эндокутикулой (рис. 2, А; 4, В); экзокутикула очень тонкая (около 0,01 мкм), практически не окрашивается на парашиновых препаратах, но легко выявляется на полутонких срезах и под электронным микроскопом. На электронномикроскопическом уровне экзокутикула представлена гомогенным электронноплотным слоем с ровными границами, эн-докутикула образована слабо-фибриллярным электронносветлым веществом (рис. 7). Полученные нами данные полностью согласуются с опубликованными ранее (Moritz, 1972; Лебский, 1974) и поэтому на ультра структуре кутикулы подробнее молено не останавливаться.
На тангенталъных срезах туловища P.caudatus видно, что эндокутикула образована плотно упакованными шестигранными призмами, стенки которых соответствуют границам эпителиальных клеток. Таким образом, каждая призма ленит над своей клеткой и, вероятно, является результатом ее синтетической деятельности (рис. 4, Г).
По мере перехода туловища в хобот и на хоботе экзокутикула увеличивается в толщину, получая наибольшее развитие в глотке (рис. I, А). Своеобразной модификацией кутикулы являются папиллы хобота и глоточные зубы, покрывающие всю поверхность канала глотки животных (рис. 2, Г, I).
Папиллы хобота, расположенные 25-ю параллельными рядами, образованы высокими столбчатыми эпителиальными клетками (рис. 2, 3). В основании папилл кутикула состоит из обычных двух слоев, но от базального к апикальному концу папиллы относительная толщина экзокутикулы увеличивается, и у вершины папилл она занимает всю толщу кутикулярной пластинки, прилегая непосредственно к эпителиальным клеткам. При этом сама экзокутикула видоизменяется, теряя способность окрашиваться азокарми-ном, и приобретает блестящий желтый цвет ірис. 2, 3; 5, В). Такую сильно преломляющую свет кутикулу, не окрашивающуюся гистологическими красителями, мы будем называть экзокутикулой II - в отличие от азокарминофильной (фуксинофильной) экзоку-тикулы I. Зубы в дистальной части глотки располагаются по окружности ее просвета правильными венцами по пять. Проксимальнее число зубцов в венце увеличивается, а размер их уменьшается, так что задняя часть глотки, приближающаяся к средней кишке, равномерно покрыта очень мелкими, тесно сближенными зубами. Каждый зуб образован центральным шипом, от которого симметрично отходят несколько боковых зубчиков (рис. 2, Г). Строение кутикулы глоточных зубов и папилл хобота P.caudatus сходно, за тем исключением, что папиллы на конце открываются отверстием с неровным краем ірис. 2, і, 3; 4, В), в то время как центральный шип зуба имеет заостренную вершину, целиком образованную экзокутикулой II (рис. 2, Г, Д; 4, Б). В боковые зубчики эпителий практически не заходит, они также целиком состоят из экзокутикулы П. Дистальные зубы глотки имеют более мощное кутикулярное покрытие, чем мелкие проксимальные. Кути-кулярная пластинка последних по мере их приближения к средней кишке заметно истончается, но принцип расположения и соотношение слоев кутикулы остаются прежними (рис. 2, Е; 4, А).
Железистые и чувствительные органы P.caudatus, расположенные на туловище и каудальных отростках, имеют специальное кутикулярное покрытие. Так очень тонкая кутикула чувствительных папилл каудальных отростков и туловища образована, в основном, экзокутикулой I (рис. 2, К).
Обновление клеток полостной жидкости
Результаты гистохимического анализа гранулярных клеток представлены в табл. ІУ. Секрет клеток эозинофилен и окрашивается азокармином в красный цвет. Материал гранул дает положительную реакцию на белки при окрашивании сулемовым раствором бромфенолового синего, прочным зеленым при рН 2,2 и амидочер-ным І0Б; полисахаридов он. не содержит (отрицательный результат ШИК-реакции и окрасок альциановым синим, паральдегидфукси-ном и основным коричневым без окисления). Интенсивная реакция гранул при использовании красителей на сульфатные группы после окисления или тиосульфирования свидетельствует о высоком содержании в них сульфгидрильных групп и дисульфидных связей. При проведении ДДД-реакции гранулы не окрашиваются, однако после обработки срезов 10 меркаптоэтанолом, восстанавливающим s-s--связи до SH -групп, гранулы дают интенсивную ДДД-реакцию и окрашиваются в синий цвет при использовании азанового метода, что указывает на преимущественное содержание именно дисульфидных связей.
Исследование тотальных препаратов стенки тела приапулид обоих видов выявило в составе покровного эпителия отростчатые клетки, субвитально окрашивающиеся метиленовым синим. По крайней мере у H.spinulosus на заднем конце тела они располагаются с заметно большей частотой. Эти клетки часто содержат вакуоли и, так не как гиподермальные, доходят до апикальной поверхности эпителиального пласта (рис, 10, Д). На препаратах хорошо видно, что от базальной части клеток отходят несколько отростков дас. 10, Б), идущих вдоль базальной мембраны эпителия (рис. 10, Д). Значительная часть отростков прослеживается до основания складок между валиками кольцевой мускулатуры, где у приапулид проходят кольцевые нервы. При реакциях на биогенные моноамины и ацетилхолинэстеразу эти клетки невыявляются (Иоффе, Котикова, в печати).
При окрашивании тотальных препаратов стенки тела приапулид паральдегидфуксином или альциановым синим после окисления смесью кмпО и H2so , в покровном эпителии обоих видов приапулид, так же как на срезах, хорошо выявляются гранулярные клетки. При этом в них помимо сильно прокрашивающихся гранул видны светлые вакуоли и хорошо заметные отростки (рис. 9, Д, Е; 10, В, Г, Ж, З, И-). Сходство в форме и количестве клеточных отростков, а также в характере расположения и частоте встречаемости клеток, позволяет утверждать, что окраски нетиле новым синим и паральдегидфуксином после окисления выявляют одни и те же клетки.
На тотальных препаратах, окрашенных паральдегидфуксином, особенно отчетливо прослеживаются различия в строении гранулярных клеток у двух видов приапулид. У P.caudatus клетки имеют лопастную форму, их цитоплазма всегда заполнена мелкими гранулами одинакового размера (от 0,5 до І мкм в диаметре). От клетки обычно отходят 1-2 неветвящихся отростка, которые содержат гранулы (рис. 9, Д). Размеры и форма гранулярных клеток H.spinulosus сильно варьируют (рис. 9, Е; 10, В, И): наряду с небольшими овальными клетками (от 12 до 20 мкм в длину) могут встречаться большие клетки неправильной формы, достигающие размера 40 мкм. В больших клетках размер гранул варьирует от 0,5 до 3 мкм; отдельные гранулы малых клеток нередко достигают 5 мкм. В цитоплазме кроме гранул разных размеров встречаются крупные неокрашивающиеся вакуоли (рис. 9, Е; 10, 3), ни разу не наблюдавшиеся в гранулярных клетках у P.caudatus. Отростки клеток могут ветвиться, в них часто выявляются гранулы (рис. 9, Б; 10, Г). Обычно отросток отходит от клетки в направлении, параллельном кольцевой мускулатуре, однако в своей дистальной части отростки и их разветвления направлены преимущественно перпендикулярно волокнам кольцевых мышц (рис. 10, И).
По целому ряду признаков гранулярные клетки в покровном эпителии приапулид напоминают пептидэргические Гомори-положи-тельные нейросекреторные клетки (см. ниже). В связи с этим представляло интерес провести опыт, в котором животных подвергали стрессовому воздействию (что нередко позволяет активизировать нейросекреторную систему, даже если воздействие не является для нее специфическим; Кулаковский, 1976). Для этого особей H.spinulosus помещали в среду с пониженной соленостью (в морскую воду, разбавленную дистиллированной водой до 16%о) и выдерживали там I, 3 и 12 сут.
На всех сроках фиксации большие гранулярные клетки не демонстрируют изменений, заметных на светооптическом уровне: их цитоплазма всегда содержит большое количество гранул. Морфология малых гранулярных клеток в ходе опыта подвергается существенным изменениям. Для оценки влияния изменения солености на функциональное состояние малых гранулярных клеток последние было удобно разделить на три типа: I) вакуолизированные клетки (почти вся цитоплазма заполнена вакуолями, клетки содержат не более трех мелких гранул); 2) клетки с небольшим количеством гранул (вакуолей не имеют и содержат не менее трех более крупных гранул); 3) клетки, целиком заполненные гранулами.
Подсчет гранулярных клеток разных типов производили на тотальных препаратах. Для контроля аналогичные подсчеты были проведены также и на парафиновых срезах. Результаты подсчетов в обоих случаях оказались сходными (табл. У).
Через сутки почти все малые гранулярные клетки оказываются вакуолизированныыи (I тип). Процент клеток с небольшіш количеством гранул (2-го типа) и полностью заполненных гранулами (3-го типа) на этом сроке очень незначителен (табл. У). На третьи сутки количество клеток 2-го типа возрастает значительно, а клеток 3-го типа - в меньшей степени, в го время как число вакуолизированных клеток резко падает. Через 12 сут ни на срезах, ни на тотальных препаратах клетки 1-го типа не обнаруживаются, количество клеток 2-го типа несколько снижается, а доминирующими оказываются клетки 3-го типа (табл. У).
Коагуляция полостной жидкости
Полостная жидкость приапулид P.caudatus и H.spinulosus имеет обычно розоватую окраску, которая обусловлена содержанием в эритроцитах дыхательного пигмента гемэритрина (Fange, Akesson, 1951). Эритроциты достигают в среднем 15-20 икм в диаметре, обладают постоянной формой и способны образовывать псевдоподии только в аномальных условиях, например, при длительном пребывании in vitro. У P.caudatus эритроциты имеют дисковидную чечевицеобразную форму (рис. 12, А), у H.spinulosus - форму правильной сферы (рис. 12, Б). Цитоплазма живых клеток у обоих видов содержит вакуоли и многочисленные преломляющие свет гранулы (рис. ІЗ, А; 14, А). При использовании интерференционной оптики в вакуолях видны одна или несколько мелких гранул, находящихся в непрерывном движении. В эритроцитах H.spinulosus вакуоли крупнее, чем у P. caudatus,и могут достигать 8-Ю мкм в диаметре. Кроме обычных гранул у некоторых особей H.spinulosus почти все эритроциты содержат большое количество крупных бурых гранул, обусловливающих темный цвет полостной жидкости. При наблюдении с помощью фазово-контрастной оптики выявляется еще одна особенность эритроцитов этого вида приапулид: периферический слой цитоплазмы клеток кажется пронизанным многочисленными тонкими ветвящимися канальцами (рис. I4-, Б).
Цитоплазма и гранулы эритроцитов эозинофильны, интенсивно окрашиваются азокармином и красителями на белки (сулемовый раствор бромшенолового синего, прочный зеленый при рН 2,2, ами-дочерный І0Б). Наиболее удачной для сохранения морфологии эритроцитов оказалась фиксация глутаральдегидом, при которой хорошо сохраняются вакуоли с мелкими гранулами, также дающими интенсивную реакцию на белки. При проведении на эритроцитах реакции Перлса цитоплазматические гранулы дают сильную реакцию на железо, цитоплазма и гранулы в вакуолях при этом тоже окрашиваются, но слабее. Гистохимические реакции на липидные соединения также выявили сходную химическую природу гранул м цитоплазме и в вакуолях: оба типа включений интенсивно окрашиваются су-даном черным Б и приобретают специфический синий цвет при проведении реакции на липофусцины по Шморлю.
На ультраструктурном уровне цитоплазма эритроцитов обоих видов характеризуется высокой электронной плотностью, так что при фиксации глутаральдегидом с последующим осмированием клеточные органеллы эритроцитов практически не различимы (рис. 13, Б, Г; 14, В). Удовлетворительную морфологическую картину строения клеток удается получить только при фиксации 0s04 (рис, 13, В). Вместе с тем, после фиксации с глутаральдегидом в электронноплотной цитоплазме отчетливо видны участки со значительно меньшей электронной плотностью, отличающиеся от окружающей цитоплазмы ташке более редкой и крупной грануляцией (рис. 13, Б, Г; 14, В). Плазматическая мембрана эритроцитов H.spinulosus образует глубокие впячивания, которые иногда ветвятся, формируя целую систему каналов, пронизывающих весь периферический слой цитоплазмы (рис. 14, В, Д, Е, К). Обычно хорошо прослеживается тесным контакт между такими каналами и цистернами гранулярной эндоплазматической сети (рис. 14, Е). Система периферических каналов, очевидно, соответствует многочисленным тонким канальцам, наблюдаемым на нивых клетках с помощью фазового контраста (рис. 14, Б) и глубоким инвагинациям плазматической мембраны, хорошо видимым при исследовании поверхности клеток в сканирующем микроскопе (рис. 14, Г).
Дисковидные эритроциты P.caudatus имеют гладкую поверхность, а под их плазматической мембраной вдоль наружного края диска проходят мощные пучки микротрубочек (рис. 12, А; 13, И, К), отмечавшиеся также Маттиссоном и Фанге ( Mattiseon, Fange, 1973). Б шаровидных эритроцитах H.spinulosus такие пучки микротрубочек отсутствуют.
В остальном ультраструктура эритроцитов P.caudatus и Н. spinulosus оказывается сходной (рис. 12). Цитоплазма этих клеток содержит крупные вытянутые митохондрии, умеренно развитую гранулярную эндоплазматическую сеть и аппарат Гольдки, небольшое количество липидных капель, а также окруженные мембраной вакуоли разных размеров и электронноплотные гранулы, соответствующие вакуолям и гранулам живых клеток (рис. 12; 13, Б, В; 14, В, К).
Большинство вакуолей кажутся пустыми, часть содержит элек-тронноплотное вещество в виде мелких или крупных скоплений (рис. 13, Д, Е; 14, В, К, 3). Электронноплотные гранулы представляют собой вакуоли, целиком заполненные этим веществом (рис. ІЗ; В; 14, В, З, И). В некоторых вакуолях и гранулах наряду с обычным электронноплотным материалом встречаются концентрически закрученные мембраноподобные структуры различных форм и размеров (рис. 13, Б, Д, Е; 14, її, 3, И). Гранулы и вакуоли часто окружены длинными цистернами гранулярной эндоплаз-матической сети, концентрически закрученными вокруг них (рис. 13, Д; 14, її). Электронноплотные гранулы гораздо многочисленнее в эритроцитах H.spintaosus, причем у некоторых особей они достигают очень большой (до 5 мкм) величины, превышая размер ядра и заполняя большую часть цитоплазмы клетки (рис. 14, К). Эти крупные электронноплотные гранулы соответствуют бурым гранулам, найденным в живых эритроцитах некоторых особей H.spinu-losus. В цитоплазме эритроцитов P.caudatus встречается еще один тип включений, характерный только для этого вида, - окруженные мембраной гранулы, в которых правильно чередуются концентрические электронносветлые и электронноплотные слои (рис. 13, Г, К, 3). Количество таких гранул сильно варьирует в разных эритроцитах и у разных животных, в некоторых случаях они могут заполнять почти всю цитоплазму клетки. По виду эти гранулы полностью соответствуют кальциевым включениям в тканях других беспозвоночных (см., например, Hopkin, Fott, 1979; обзор: Brown, 1982). Для гистохимического выявления кальция срезы Р. caudatus зафиксированных глутаральдегидом, окрашивали ализариновым красным. Однако при этом гранулы в эритроцитах окраски не приобретали, что, впрочем, может быть обусловлено малой чувствительностью метода и незначительным содержанием кальция в грануле.
Репаративные процессы в покровах
Количество гранул, как можно видеть на рис. 16, В и Г, варьирует в разных гранулоцитах одного и того же животного. Величина гранул также существенно варьирует. Обычно их размер не превышает 0,5 мкм, но иногда встречаются гранулы диаметром до 3 мкм и более. В дополнение к обычным включениям гранулоциты нередко содержат сильно блестящие гранулы (рис. 16, Д, Ж), которые могут достигать очень больших размеров (до 5 мкм в диаметре), причем цитоплазма клетки иногда бывает целиком заполнена подобными гранулами (рис. 16, S). Такие клетки названы нами крупногранулярными. Они легко разрушаются in vitro и при фиксации животных жидкостью Буэна, сохранить их удается только при фиксации мазков полостной жидкости глутаральдеги-дом. Крупногранулярные клетки встречаются не у всех животных, но если имеются, то составляют заметную долю от общего числа гранулоцитов.
На парафиновых срезах при использовании азанового метода гранулы гранулоцитов окрашиваются анилиновым синим и имеют сродство к азуру при окраске гемалауном-эозином-азуром. Результаты гистохимического анализа гранулоцитов приведены в таблице УІ. Красители на общие белки (сулемовый раствор бромфеноло-вого синего, прочный зеленый при рН 2,2, амидочерный І0Б) окрашивают только отдельные гранулы клеток на фоне общей положительной реакции цитоплазмы. Катионные белки в гранулоцитах не выявляются (отрицательный результат окрашивания прочным зеленым при рН 8,5). Гранулы клеток дают интенсивную ШИК-реакцию, но не окрашиваются альциановым синим, паральдегидфуксином, основным коричневым и толуидиновым синим при рН 4,0, что свидетельствует о наличии в них нейтральных полисахаридов, у -ме-тахромазия гранул, возникающая при окрашивании толуидиновым синим при высоких рН, также указывает на присутствие здесь гликопротеинов. Гранулоциты не содержат фенольных соединений (отрицательные аргентаффиновая и хромаффиновая реакции); фе-нолоксидазная активность (при инкубации в растворе пирокатехина) в этих клетках также не выявляется.
Более сложным оказалось решение вопроса о наличии в материале гранул дисульфидных связей или сульфгидрильных групп. При постановке ДДД-реакции - одной из наиболее специфических для сульфгидрильиых групп - гранулоциты приобретают характерную окраску (красный цвет), при которой гранулы клеток оказываются плохо различимыми (табл. УП). Причем интенсивность окрашивания не превышает таковую в некоторых других тканях, например, в мышцах. После предварительной обработки срезов меркап Неоднозначные результаты ДДД-реакции заставили нас обратиться к другим методам выявления Ш -групп и S-S связей (см. табл. УП). Вторым наиболее распространенным гистохимическим способом выявления этих групп является окрашивание красителями сульфатных групп после обработки срезов окисляющими смесями (надмуравьиная кислота, надуксусная кислота, смесь 0,3% KMnO и 0,3% н о ) или тиосульфирования. Известно, что воздействие окисляющими смесями приводит к превращению s-s связей и HS -групп в сульфатные группы (-SO-H), которые затем выявляются при окрашивании паральдегидфуксином (рН 2,0), альциановым синим (рН 1,0) или основным коричневым (рН 1,0) (Scott, 1952; Scott, Clayton, 1953; Adams,Swetenham, 1958). При тиосульфировании дисульфидные связи и сульф-гидрильные группы превращаются в тиосулъфатные (s-so H), которые выявляются теми же красителями кислых групп ( Swan, 1957; Castino, Bussolati, 1974). й В некоторых случаях эти методы дают лучшие результаты, чем ДДД-реакция. В частности, окрашивание кожи мыши паральдегидфуксином после обработки срезов окисляющей смесью (кмпО и н о ) позволяет выявить керато-гиалиановые гранулы (собственные данные). Гранулы гранулоцитов приапулид также четко выявляются при использовании красителей сульфатных групп после окисления или тиосульфирования (см. табл. УП), причем способность к такому окрашиванию оказалась наиболее специфической чертой этих клеток.
