Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Нейробластома как модель для изучения механизмов регуляции дифференцировки нервных клеток в культуре 9
1.1.1. Происхождение и краткая характеристика клеточных линий нейробластом 9
1.1.2. Получение и характеристика клеточных линий нейробластом 11
1.2. Дифференцировка нейробластомы в культуре 13
1.2.1. Экспрессия дифференцировки 13
1.2.2. Морфологическая дифференцировка 14
1.2.3. Биохимическая дифференцировка 15
1.2.4. Электрофизиологическая дифференцировка 15
1.2.5. Регуляция экспрессии признаков дифференцировки 15
1.3. Методы экспериментальной регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки в культуре 18
1.3.1. Неспецифические индукторы клеточной дифференцировки 18
1.3.2. Ионная регуляция дифференцировки и регенерации клеток 20
1.3.3. Экспериментальные методы регуляции внутриклеточной концентрации кальция и рН 24
1.3.4. Ионная регуляция метаболизма и морфологической дифференцировки изолированных нейронов моллюсков 28
1.3.5. Влияние сывороточных компонентов на пролиферацию и дифференцировку клеток 32
1.3.6. Морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы, индуцированная диметилсульфоксидом 34
1.4. Авермектины: их свойства и характеристика 35
1.5. Хемотропизм и аутокринная регуляция 36
1.6. Взаимоотношение между пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом в развивающейся нервной системе
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 43
2.1. Условия культивирования клеток неиробластомы N1E-115 43
2.2. Критерии оценки морфологической дифференцировки клеток неиробластомы методом световой микроскопии 46
2.3. Условия культивирования нейронов моллюсков 46
2.4. Критерии оценки морфологической дифференцировки нейронов моллюсков методом световой микроскопии 47
2.5. Оценка морфологической дифференцировки неиробластомы методом электронной микроскопии 47
2.6. Электрофизиологические исследования на бислойных липидных мембранах (БЛМ) 48
2.7. ДСН-электрофорез 48
2.8. Методы оценки ошибок измерений 49
ГЛАВА 3. Результаты исследований 51
3.1. Морфологический анализ процессов пролиферации и дифференцировки методом световой микроскопии 51
3.2. Морфологический анализ дифференцировки нейронов моллюска 53
3.3. Морфологический анализ процессов пролиферации и дифференцировки методом электронной микроскопии 54
3.4. Анализ необратимой морфологической дифференцировки неиробластомы 57
3.5. Влияние рН среды на дифференцировку клеток неиробластомы 57
3.6. Влияние ионного состава среды на дифференцировку клеток неиробластомы 59
3.7. Влияние осмотичности среды на дифференцировку клеток неиробластомы 64
3.8. Влияние аминокислот, витаминов и углеводов на дифференцировку клеток нейробластомы. 65
3.9. Влияние сыворотки на дифференцировку клеток нейробластомы 67
3.10. Влияние на дифференцировку клеток нейробластомы различных фармакологических препаратов 69
3.11. Определение продуктов метаболизма, обладающих мембранной активностью 71
Обсуждение результатов 74
Заключение 86
Выводы 89
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Происхождение и краткая характеристика клеточных линий нейробластом
- Критерии оценки морфологической дифференцировки клеток неиробластомы методом световой микроскопии
- Морфологический анализ дифференцировки нейронов моллюска
- Влияние сыворотки на дифференцировку клеток нейробластомы
Введение к работе
Клеточные механизмы морфогенеза, регенерации и канцерогенеза волнуют исследователей уже более 100 лет. Однако, только в последние десятилетия многочисленные исследования позволили поставить на повестку дня проблемы переключения генетических программ пролиферации, дифференцировки и апоптоза (Giorgio et al, 2007; Levin, 2007).
Для решения этих задач несомненный интерес вызывает культура клеток нейробластомы. Нейробластома представляет собой удобный и распространенный объект как для онкологов, так и нейробиологов (Prasad, 1991) по следующим причинам:
Нейробластома является типичным представителем эмбриональных злокачественных опухолей нервной системы, однако она способна к спонтанной регрессии;
Нейробластома способна при определенных условиях следовать программе дифференцировки нейрона, демонстрирует синтез нейромедиаторов и специфических ферментов, наличие электрической и химической возбудимости поверхностной мембраны (Amano et al, 1972), однако дифференцировка может быть обратимой.
Известно, что переход клеток нейробластомы от пролиферации к дифференцировке и обратно может совершаться под воздействием множества неспецифических индукторов (Prasad, 1975; Kruman et al, 1993; Fernandes et al, 2007).
При этом существует корреляция между уровнем мембранных потенциалов, зарегистрированных у различных видов клеток, и их способностью к пролиферации (Binggeli and Weinstein, 1986). Пролиферируют эмбриональные, недифференцированные и опухолевые клетки. Все эти клетки обладают низким мембранным потенциалом. По мере дифференцировки пролиферирующие клетки как in vivo, так и in vitro
гиперполяризуются (Trachtenberg et al, 1972, 2002). Предполагается важная роль мембранного потенциала и потоков неорганических ионов в переключении основных режимов функционирования клетки, таких как пролиферация, дифференцировка и программируемая гибель (Levin, 2003). В других исследованиях выявлена важная роль перекиси водорода и окиси азота в процессах контроля роста и морфогенеза (Giorgio et al, 2007). Перекись водорода функционирует как сигнальная молекула, вовлеченная в энергетический обмен и ответы на стресс или сигналы роста.
В последние десятилетия интенсивно изучались взаимоотношение между пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом в развивающейся нервной системе. Программируемая гибель нейронов наблюдалась не только в клеточной культуре, но и при многочисленных патологиях и старении (Giorgio et al, 2007). Однако механизм нейрональной гибели все еще не ясен.
Поиски универсальных механизмов, осуществляющих разнообразные переключения клеточных программ, также к успеху не привели.
Для решения фундаментальной проблемы дифференцировки нервной ткани, также как и для последующей реализации онкологических задач, необходимо выявить роль отдельных компонентов сложных культуральных сред в процессах переключения генетических программ клетки в условиях, неблагоприятных для пролиферации. Остается неясно, в какой степени дифференцировка клеток в неблагоприятных для пролиферации условиях предшествует гибели клеток и соответственно может рассматриваться адаптационным механизмом.
Цель и задачи исследования. Целью работы является сравнительное исследование кинетики дифференцировки и гибели клеток нейробластомы в условиях неблагоприятных для пролиферации in vitro. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние неблагоприятных для пролиферации значений рН среды на кинетику дифференцировки и гибели клеток.
Исследовать влияние неблагоприятных для пролиферации концентраций ионов Na+, К+ и Са2+ культуральных сред на кинетику дифференцировки и гибели клеток.
Исследовать кинетику дифференцировки и гибели клеток в гипо- и гиперосмотических средах, неблагоприятных для пролиферации.
Исследовать влияние углеводов, аминокислот и витаминов на кинетику дифференцировки и гибели клеток нейробластомы в бессывороточных средах.
Исследовать возможность дифференцировки клеток нейробластомы под действием фармакологических препаратов, способных вызвать клеточныую гибель.
Исследовать обратимость дифференцировки клеток нейробластомы, вызванной неблагоприятными для роста факторами культуральной среды.
Научная новизна.
Минимальная скорость дифференцировки и максимальная скорость последующей гибели дифференцированных клеток регистрировались при рН 7,5.
Времена дифференцировки и гибели дифференцированных клеток коррелировали с содержанием ионов Na+ и осмотичностью для всех сред, кроме среды с высоким содержанием аминокислот.
Скорости дифференцировки клеток нейробластомы в зависимости от содержания аминокислот и углеводов в среде имели выраженный минимум, однако времена гибели клеток были прямо пропорциональны содержанию метаболитов.
4. Зависимость времени гибели клеток от времени дифференцировки имела
- максимуме диапазоне 15-20 часов.
Практическая ценность.
Установлены количественные параметры компонентов питательных сред, оптимизирующих дифференцировку клеток нейробластомы.
Установлены количественные значения компонентов сред, способствующих длительному выживанию дифференцированных клеток.
Предложены пути оптимизации культуральных сред, которые в будущем могут быть использованы для коррекции опухолевого микроокружения in vivo.
Апробация работы. Основные материалы исследований докладывались на 5-й (Москва, 1997) и 8-й (Казань, 2006) Восточно-Европейских конференциях Международного общества нейробиологов «Simple nervous systems", II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), XVI рабочем совещании «Консервация генетических ресурсов» (Пущино, 2000), XVIII Съезде физиологов России (Казань, 2001), научной конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001), .на конкурсе ежегодных научных работ ИБК РАН (Пущино, 2001), IV и VI Международных конференциях по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (Санкт-Петербург, 2002, 2006), IX международной школе конференции молодых ученых (Пущино, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 31 работа, из них 12 статей в отечественной и зарубежной печати, 18 тезисов и 1 авторское свидетельство.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка работ, опубликованных по теме диссертации и списка использованной литературы. Работа изложена на 115 страницах, материал
иллюстрирован 23 рисунками и _5_ таблицами. Библиография включает 265 ссылок.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
МД - морфологическая дифференцировка
DMEM - Среда Игла в модификации Дульбекко
L - 15 - среда Лейбовитца
ЭБС - эмбриональная бычья сыворотка
ДМСО - диметилсульфоксид
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
д-цАМФ - дибутирил циклический аденозинмонофосфат
цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат
АХЭ - ацетилхолинэстераза
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
ИГК - ионный гомеостаз клетки
Ав - авермектины
АБ - абамектин
АВ - аверсектин С
НБ - нейробластома
БЛМ - бислойные липидные мембраны
ДСН - додецил сульфат натрия
Происхождение и краткая характеристика клеточных линий нейробластом
В последние годы в связи с ростом онкологических заболеваний проблема ракового перерождения клеток и поиска противоопухолевых препаратов встает на одно из первых мест. Злокачественный процесс -результат нарушения равновесия между процессами пролиферации и дифференцировки клеток. Опухолевые клетки теряют способность к окончательной дифференцировке и характеризуются неконтролируемым размножением.
Среди различных подходов, используемых для решения проблем злокачественного перерождения клеток, важное значение имеет изучение дифференцировки клеток в культуре. Под дифференцировкой при этом имеется в виду экспрессия in vitro функциональных особенностей исходной ткани. В качестве объекта используют как первичные клеточные культуры, так и постоянные клеточные линии, способные к неограниченному размножению in vitro (Пол, 1963; Никольский и др., 1984; Prasad, 1975, 1991; Seeger et al, 1977; Scarpa et al, 1996).
Нейробластома относится к числу наиболее часто встречающихся форм злокачественных новообразований у детей. Считается, что нейробластома у разных видов возникает из полипотентных клеток нервного гребня. В пользу этого свидетельствует ее способность дифференцироваться in vitro не только в различные типы нервных клеток, но и в другие клеточные типы, например мышечные (Brandt et al., 1976). Нейробластома - самая загадочная опухоль детского возраста, как с клинической, так и с биологической точек зрения. В структуре всей онкологической заболеваемости нейробластома составляет 7-11% от общего числа злокачественных опухолей у детей, занимая четвертое место после острых лейкозов,- опухолей цнс и злокачественных лимфом (Evans, 1979; Pizzo et al., 2003). Нейробластома относится к числу редких форм раковых опухолей человека, способных к спонтанной регрессии. Кроме того, она может частично или полностью превращаться в доброкачественную опухоль типа ганглионейромы в результате терапевтического воздействия. Первое клиническое наблюдение "созревания" симпатогониомы в доброкачественную ганглионейрому через 10 лет после установления диагноза и без какого-либо лечения описано еще в 1927 году (Cushing and Wolbach, 1927). Предполагается, что эти особенности поведения нейробластомы in situ обусловлены ее происхождением: не мутационным, а в результате нарушения регуляции нормального процесса дифференцировки. Основные особенности нейробластомы у разных видов животных совпадают.
Название "нейробластома" предложено J.Wright, который в 1910 году показал, что ряд опухолей забрюшинного пространства и заднего средостения имеют четкое морфологическое сходство с тканью развивающейся симпатической нервной системы (Pizzo et al., 2003). Источником опухолевого роста при нейробластоме являются элементы симпатической нервной системы, поэтому теоретически нейробластома может возникнуть практически в любом месте организма, где присутствуют симпатические ганглии или параганглии.
Нейробластома - типичный представитель эмбриональных опухолей, поэтому преимущественно она диагностируется у детей раннего возраста (средний возраст к моменту диагностики составляет 2 года). 90% случаев диагностируется до 5-летнего возраста. Однако эта опухоль может возникать и у подростков и даже у взрослых, хотя и крайне редко. Преобладание опухолей симпатической нервной системы у малышей обусловлено особенностями развития этой системы у человека, поскольку формирование симпатических ганглиев не заканчивается во внутриутробном периоде и клеточное строение их становится таким же, как у взрослых, только к 5 годам жизни ребенка. Естественно, что при большой интенсивности и напряженности процессов роста и развития симпатической нервной системы создаются условия для возникновения опухолевой пролиферации.
В клинической практике хорошо известны примеры, когда у грудных детей с классической картиной нейробластомы 4S стадии (как правило, с массивным поражением печени) наблюдается инволюция злокачественного процесса примерно с 4-месячного возраста. Лишь очень небольшая часть таких больных нуждается в минимальной химиотерапии или лучевой терапии для "индукции" процесса регрессии. До сих пор неизвестен никакой маркер, который определяет перелом в течение заболевания от прогрессии к регрессии. Не определены также и факторы, вызывающие этот процесс у групп больных нейробластомой, не принадлежащих к категории 4S стадии.
Еще одно удивительное свойство опухолевых клеток нейробластомы было замечено при экспериментальном ее исследовании: культура клеток, взятых из агрессивно растущей опухоли, в процессе культивирования приобретала черты дифференцирующейся нервной ткани. Различные агенты способны индуцировать этот процесс in vitro: ретиновая кислота, нервный ростовой фактор, некоторые цитостатики, пептиды, папаверин, форсколин (Шпаков и др., 2006; Agarwal et al., 1983; Seamon et al., 1984; Amnion et al., 1985; Castle et al., 1992; Price et al., 1995; Perez-Juste et al, 1999; Pijuanhompson V., 1999; Yasui et al., 2001; Ilvain et al, 2006; Fernandes et al, 2007). Однако до сегодняшнего дня не было сообщений об успешной индукции процесса дифференцировки in vivo.
Критерии оценки морфологической дифференцировки клеток неиробластомы методом световой микроскопии
В разных экспериментах за дифференцировкой клеток нейробластомы следует апоптоз. Даже после летальной у-радиации клетки первоначально дифференцируются и только затем погибают. Таким образом, эти два процесса, по-видимому, тесно взаимосвязаны. Данные, полученные на некоторых других видах клеток, предполагают это (Golstein et al., 1991; Kure et al., 1991). С другой стороны, эксперименты с ДМСО указывают на то, что дифференцировка и апоптоз не вызываются одними и теми же сигналами. Присутствие ДМСО в свежей ростовой среде, добавленной к дифференцированным клеткам, не вызывает их гибель. Можно заключить, что клетки нейробластомы могут погибать по типу апоптоза только после дифференцировки, но причиной их гибели является дефицит некоторых факторов, которые необходимы для выживания клеток в этом состоянии.
Среди нейротрофических факторов, способных к "поддержанию жизни" дифференцированных нейрональных клеток нервный ростовой фактор (НРФ) является наиболее изученным. Его удаление приводит к нейрональной гибели in vivo и in vitro. Тем не менее, в работах Круман и др. (1993) было показано, что в экспериментах другие факторы играли поддерживающую роль выживания, поскольку рецепторы, специфические к НРФ, в клетках нейробластомы N1E115 не обнаружены (Nyllie et al., 1980).
После того, как клетки переходят на этап необратимой дифференцировки, некоторые вещества, например транс-ретиноевая кислота, могут вызывать апоптоз (запрограммированную гибель) созревающих клеток. Эта клиническая модель дифференцирующей терапии вызвала огромный интерес к "физиологическому" подходу в лечении онкологических заболеваний.
Апоптоз - наиболее широко распространенный способ гибели клетки. Это, по-видимому, активный ответ клеток на многочисленные физиологические или повреждающие сигналы. Ультраструктурно апоптоз определяется конденсацией хроматина, сморщиванием клетки, образованием пузырьков и ядерной фрагментацией, что связано с образованием так называемых апоптозных тел, которые в конечном итоге фагоцитируются соседними клетками.
В работах Круман и др. (1993) к 8-му дню инкубации клеток в присутствии ДМСО наблюдали изменения в морфологии клеток. Необычные структуры были обнаружены в клетках, сохраняющих дифференцированный фенотип. Некоторые из них были соединены с клетками, а другие были расположены за пределами. Эти образования были окрашены ДНК-специфической флюоресцентной краской Hoechst 33258, которая указывала, что они содержали ДНК. Тела, расположенные вне клеток, по-видимому, были окружены мембранами, поскольку они были не проницаемыми к этидиум бромиду без фиксации. Эти образования не были обнаружены ни в растущих, ни в дифференцированных культурах нейробластомы N1E-115. В то же самое время гибель клеток нейробластомы отличалась от классического апоптоза тем, что было образовано множество ДНК-содержащих частиц, хотя обычно характерно было появление нескольких фрагментов. Позже клетки округлялись и дегенерировали более глубоко, что было сопровождено проницаемостью плазматической мембраны. Затем округленные клетки отделялись и переходили в суспензию.
Растущие и дифференцированные клетки нейробластомы показывали нормальную ультраструктуру. Они содержали большое ядро с активными ядрышками, цитоплазма была заполнена многочисленными митохондриями, полиоомами как отдельными, так и связанными с развитым эндоплазматическим ретикулумом. Изменения ультраструктуры в культуре, подлежавшей обработке ДМСО, происходили на 8-й день после добавления агента. Повреждения тела клетки включали образование пузырьков на поверхности клетки, появление хроматиновых частиц в цитоплазматическом отделе клетки. Электрофоретический анализ ДНК, изолированной из клеток N1E-115, обработанных в течение 9 дней в ростовой среде с ДМСО показал, что генетический материал деградировал в нуклеосомы и их олигомеры, что характерно для апоптоза.
В итоге, можно предположить, что клетки на определенном этапе дифференцировки становятся зависимыми от специфических факторов и их отсутствие ведет к гибели по типу апоптоза. Вполне аналогичные выводы были сделаны анализом взаимозависимости между дифференцировкой и гибелью клеток в лимфоидной системе (Fesus et al., 1991; Golstein et al., 1991). Также кажется вероятным, что в таких клеточных линиях, как клетки нейробластомы, способность к дифференцировке делает их компетентными для изучения апоптозных путей.
Морфологический анализ дифференцировки нейронов моллюска
Под действием всех использованных индукторов пролиферирующие клетки нейробластомы NIE-115 претерпевали морфологическую дифференцировку (Рис, 4 Б.), картина которой полностью соответствовала описанной в литературе (Prasad, 1972-1991) и не зависела от природы индуцирующего агента. При длительном культивировании в индуцирующих условиях без смены среды дифференцированные клетки гибли по типу апоптоза (Krumanetal, 1993).
Замена индуцирующей среды через 1 -3 суток на ростовую (среду № 2) приводила к ингибированию дифференцировки и возврату пролиферации. После смены индуцирующей среды через 4-5 суток на ростовую среду ДМЕМ с 10% сыворотки пролиферация обычно отсутствовала, клетки после пересева округлялись, но быстро восстанавливали мультиполярную форму. Это состояние клеток было названо необратимой морфологической дифференцировкой. Меняя среду № 2 каждые 4-5 суток можно было длительно (до 3,5 месяцев) поддерживать жизнеспособность дифференцированных нейронов.
При длительном культивировании необратимо дифференцированных клеток (более 3-4 недель) в культурах появлялись очень крупные нейроны, около 70 - 100 мкм в диаметре (Рис. 4 В.). Такие нейроны были единичны. Выяснить их происхождение и экспериментально увеличить количество не удалось. Культивирование в среде с добавлением авермектинов, ДМСО и форсколина вызывало аналогичную морфологическую дифференцировку, представленной на рис. 4. , r& Морфологический анализ дифференцировки нейронов моллюска.
В экспериментах на культуре нейронов моллюсков Lymnaea stagnalis (Табл. № 5) была показана существенная зависимость образования и роста отростков от ряда веществ таких, как циклические нуклеотиды и продукты полифосфоинозитидов [10]. Образование отростков нейронов моллюска Таблица № 5 №№ Вещества и концентрации, М Количество нейронов, изменивших морфологию, % сут культивирования 5 сут. культивирования
В исследованиях на одиночных изолированных нейронах (Рис. 5) установлено, что нейроны активно формируют отростки и при отсутствии хемоаттрактантов и каких-либо клеток-мишеней [10, 13]. Несмотря на то, что нейроны, по одиночке помещенные в камеры, живут в солевом растворе не более 6 суток, их морфологическая дифференцировка идет очень активно. В такой системе «одиночного заключения» в качестве ростового фактора (формально) можно рассматривать только твердый субстрат - в данном случае стекло, в качестве же растворимого фактора могут выступать только ионы. Простой солевой раствор действует в данной системе как хемоаттрактант. Рис. 5. Морфологически дифференцированный одиночный нейрон моллюска через 3 дня культивирования, (а)- среда с д-цАМФ, (с) - солевой раствор.
Морфологический анализ процессов пролиферации и дифференцировки нейробластомы методом электронной микроскопии.
Электронно-микроскопические исследования дифференцированных клеток нейробластомы показали нормальную ультраструктуру (Рис. 6). Они содержали большое ядро с активными ядрышками, цитоплазма была заполнена многочисленными митохондриями, полисомами как отдельными, так и связанными с развитым эндоплазматическим ретикулумом.
Ц - цитоплазма тела клетки с высоким содержанием рибосом, ЦКО — цитоплазма клеточного отростка, ЭС — эндоплазматическая сеть ЛГ — липофусциновые гранулы, Я — ядро, Яд — ядрышко, СП — секретируюшие пузырьки, ПП — пресинаптические пузырьки с нейромедиатором. Стрелками обозначены конусы роста. Рис. 7. Ультраструктурная организация отростков клеток неиробластомы NIE-115. А - конусы роста; Б - межклеточные контакты 1 - 3 -терминали, образовавшие межклеточные контакты, напоминающие синапсы. Мф - микрофиламенты Мт - микротрубочки ПП -пресинаптические пузырьки. Стрелками указаны конусы роста.
Электронно-микроскопические исследования, проведенные после 1 месяца культивирования необратимо морфологически дифференцированных нейронов, показали высокую степень дифференцировки клеток нейробластомы: нормальное развитие нейропиля (Рис. 7 А) и межклеточных контактов (Рис. 7 Б), высокий уровень развития белок-синтезирующих структур.
Влияние сыворотки на дифференцировку клеток нейробластомы
Сопоставление защитных и сенсибилизирующих эффектов различных медицинских препаратов на млекопитающих и клеточных моделях выявило высокую корреляцию результатов оценки этими методами [4, 5, 6]. Кроме того, при помощи клеточной модели удавалось обнаружить потенциальные защитные свойства препаратов, маскируемых их токсическим действием на животных. Преимуществом применяемого метода клеточного тестирования препаратов является и быстрая оценка (1-2 сут.) токсических, инертных и стимулирующих концентраций испытуемых фармакологических препаратов [6, 7, 8].
В этой серии экспериментов были исследованы процессы пролиферации и морфологической дифференцировки клеток нейробластомы под действием авермектинов (16-членных макролидов, продуцируемых актиномицетом Streptomyces avermitilis) 2-х видов - аверсектина С (АВ) и абамектина (АБ), диметилсульфоксида (ДМСО) и форсколина [21, 30,31] (Рис, 19).
Показано, что после добавления аверсектина С в концентрации 10 -10" М на третьи сутки культивирования происходило появление большого количества клеток с длинными ветвящимися отростками (некоторые клетки были увеличены в диаметре до 70-100 мкм), число которых достигало максимума через 5 дней культивирования. Периодической сменой среды через 3-4 дня удавалось поддерживать клетки в дифференцированном состоянии в течение 3 - 4 и более недель. Добавление в культуру абамектина в концентрации 10"5-10"6 М не вызывало каких-либо изменений пролиферации клеток. Увеличение же концентрации абамектина до 10"3-10"4 М являлооь токсичным и приводило к гибели клеток.
Использование в качестве индуктора морфологической дифференцировки ДМСО и форсколина также позволяло получать хорошо дифференцированные длительно живущие нейроны, часть которых имела крупные размеры (70-100 мкм) с сильно развитыми отростками [15, 18, 25]. Криопротекторы, в частности ДМСО, могут оказывать существенное влияние на морфологические [25, 30, 31] и электрические параметры клеток нейробластомы (Сафронова и др., 1992).
На клетках нейробластомы NIE-115 показано не только цитостатическое, но и цитотоксическое действие синюхи голубой Polemonium coeruleum L. [12]. Аналогичные результаты получены по влиянию строфантина G и дигоксина на лимфоидные опухолевые клетки Raj і [9]. Более того, концентрации, токсичные для опухолевых клеток, не оказывали влияние на эмбриональные фибробласты человека.
Очевидно, что все вещества в сублетальных концентрациях являются сильными стрессирующими факторами. Именно эти концентрации всех исследованных веществ, кроме абамектина, вызывали полноценную морфологическую дифференцировку у клеток нейробластомы.
Окислительный стресс для исследованных веществ приводил к запуску механизмов клеточной дифференцировки. Более высокие концентрации всех исследованных веществ приводили к апоптозу. Возможно, что абамектин тоже вызывает дифференцировку, но только в более узком диапазоне концентраций. В этих представлениях дифференцировка является некоторым переходным состоянием от пролиферации к клеточной гибели (Рис. 20). Определение продуктов метаболизма, обладающих мембранной активностью. В данной серии экспериментов мы исследовали продукты метаболизма, выделяемые в среду в процессе дифференцировки клеток нейробластомы. Было обнаружено, что культуральная среда, омывающая дифференцирующиеся клетки нейробластомы (Рис.21), обладала ярко выраженной мембранной активностью и была способна формировать одиночные катионные каналы в липидном бислое [20, 22, 23]. Среды без клеток или с пролиферирующими клетками таким свойством не обладали. v v ty 5 0 p A
Регистрация одиночных каналов при действии кондиционной среды. Среда: 10 тМ Трис НС1,100 mM КС1, рН 7,4, 20 мг/мл азолектина в гептане. Подаваемое напряжение 50 мВ. Добавка модификатора - 200 мкл с одной стороны.
Исследования проводили в биионной системе, когда с одной стороны липидного бислоя находились ионы калия, а с другой - ионы натрия в эквимолярных концентрациях. Отношение коэффициентов проницаемостей, вычисленное согласно уравнению Гольдмана-Ходжкина-Каца составило №+/Рк+ = 2,18 + 0,20. Этот результат указывает на сильное деполяризующее влияние дифференцирующего фактора на плазматические мембраны клеток.
Изучение вольт-амперных характеристик показало, что каналы являются потенциалзависимыми [22,23,27].
В среде с дифференцирующимися клетками методом ДСН-электрофореза был выявлен белковый фактор с молекулярной массой 8 ± 2 Ша (Рис. 22).
