Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 3
1.1. Актуальность работы.. 7
1.2. Цель и задачи исследования 8
1.3-Положения, выносимые на защиту. 9
1.4-Научная новизна работы 11
1.5. Научно-практическая значимость работы 12
ГЛАВА 2.
СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РОЛИ ЛИПИДОВ В НЕИРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 14
2.1. ХОЛЕСТЕРИН И ЕГО ОБМЕН В ЖИВОТНОМ ОРГАНИЗМЕ 14
2.1.1. Биохимия холестерина 14
2.1.2. Распределение холестерина в животном организме 15
2.2. ХОЛЕСТЕРИН И ФОСФОЛИПИДЫ В СТРУКТУРЕ МЕМБРАН 18
2.2.1. Холестерин и фосфолипиды в строении клеточной мембраны 18
2.2.2. Микродомены в плазматической мембране 22
2.2.2.1.Клатрин-окаймленныеямки 23
2.2.2.2. Кавеолы 25
2.2.3. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В СТРУКТУРЕ МЕМБРАН...28
2.2.3.1. Первичные радикалы 28
2.2.3.2. Активные формы кислорода 29
2.2.3.3. Цепное окисление липидов 31
2.2.3.4. Биологические последствия ПОЛ 34
2.2.3.5. Регуляция ПОЛ 35
2.2.3.6. Водорастворимые антиоксидант 36
2.2.3.7. Липидные антиоксиданты 38
2.3. ГОМЕОСТАЗ ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКЕ 38
2.3.1. Захват холестерина 39
2.3.2. Биосинтез холестерина 41
2.3.3. Регулирование биосинтеза холестерина 43
2.3.4. Транспорт холестерина из клетки 48
2.3.5. Холестерин модулирует внутриклеточный липидный транспорт 53
2.4. ХОЛЕСТЕРИН В ТКАНИ МОЗГА 54
2.4.1. Апо Е, холестерин и нейромышечные болезни 56
2.4.2. Болезнь Нимана Пика тип С, холестерин и нейродегенерация 57
2.4.3. Синдром Дауна и другие наследственные заболевания 59
2.5. ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СРЕЗОВ МОЗГА-
НЕЙРОПЛАСТИЧНОСТЬ И ДОЛГОСРОЧНАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ 59
2.5.1. Анализ нейропластичности: долгосрочная потенциация 59
2.5.2. Почему электрофизиологическая запись в гиппокампе 67
2.6. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ 74
2.6.1. Амилоид бета. Формирование амилоидных бляшек -.75
2.6.2. АР, ПБА, холестерин, и нейромышечные патологии 80
2.6.3. Амилоид р, нормальный функциональный белок организма? 81
2.6.2. Белок тау. Образование нейрофибриллярных клубков 82
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 87
3.1. ИЗУЧЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА И ФОСФОЛИПИДОВ В СРЕЗАХ ГИППОКАМПА КРЫСЫ 87
3.1.1.Животные 87
3.1.2. Реактивы 88
3.1.3. Методы 88
3.1.3.1. Приготовление срезов гиппокампа 88
3.1.3.2. Метаболическое мечение липидов срезов гиппокампа 90
3.1.3.3. Авторская инкубационная камера для срезов 92
3.2. БИОХИМИЧЕКИЙ АНАЛИЗ ЛИПИДОВ МОЗГА 95
3.2.1. Изучение синтеза липидов в ткани гиппокампа 95
3.2.2. Радиоавтографический анализ срезов гиппокампа 96
3.3. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕКИИ АНАЛИЗ СРЕЗОВ ГИППОКАМПА 97
3.4. ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СРЕЗОВ ГИППОКАМПА 99
3.4.1. Регистрация ВПСП, ДП и парного усиления 99
3.4.2. Обработка данных и статистический анализ... ...100
3.4.3. Экспериментальная установка для двухканальной записи 101
3.4.4. Изучение поведения лабораторных крыс 102
3.5. БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ПОЛ 104
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ 105
4.1. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ХОЛЕСТЕРИНА И ФОСФОЛИПИДОВ В
ИЕЙРОПЛАСТИЧНОСТИ НЕЙРОНОВ 105
4.1.1. Биохимический и гистохимический анализ холестерина и фосфолипидов срезов гиппокампа .106
4.1.2. «Острый» дисбаланс холестерина и фосфолипидов вызывает нейро-дегенерацию в гиппокампе 109
4.1.3. Холестерин, фосфолипиды и нейропластичность 113
4.1.3.1. Роль в инициации и поддержании ДП... 113
4.1.3.2. Роль в пресинаптическом компоненте нейротрансмиссии...116
4.1.4. Острая модуляция липидов гиппокампа не влияет на Ар 117
4.2. ИЗУЧЕНИЕ КРЫС СОДЕРЖАЩИХСЯ НА ДИЕТЕ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ХОЛЕСТЕРИНА 118
4.2.1. Хроническое повышение холестерина в пище приводит к отложению амилоида р" в ткани мозга крыс 119
4.2.2. Диета с повышенным холестерином пищи вызывает нарушение поведения лабораторных крыс ...121
4.2.3. Диета с повышенным холестерином вызывает нарушение долгосрочной потенциации в гиппокампе крыс... 123
4.2.4. Пищевой холестерин усиливает синтез собственного холестерина в ткане мозге .124
4.3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ОКСИДАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ И ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ (ПОЛ) НА НЕЙРОПЛАСТИЧНОСТЬ 125
4.3.1, Перекись водорода модулирует нейропластичность 125
4.3.2. ПОЛ модулирует нейропластичность 128
4.4. ВЛИЯНИЕ АМИЛОИДА БЕТА И ИЕЙРОПЛАСТИЧНОСТИ НА
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ 133
4.4.1. Амилоид бета и метаболизм липидов в ткани мозга 133
4.4.2. Влияние иейропластичности на синтез липидов в гиппокампе 135
4.4.3. Амилоид бета, холестерин и нейропластичность 137
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 141
5.1. ЛИПИДЫ И СИНАПТИЧЕСКАЯ НЕЙРОПЛАСТИЧНОСТЬ 141
5.1.1. Экспериментальная система острой модуляции липидов гиппокампа крысы 141
5.1.2. Биохимический анализ динамики холестерина и фосфолипидов в срезах гиппокампа 142
5.1.3. Липиды важны для синаптической пластичности и нейротрансмиссии ...144
5.2. ЛИПИДЫ И ДЕГЕНЕРАЦИЯ ЦИТОСКЕЛЕТА 149
5.3. ЛИПИДЫ, НЕЙРОПЛАСТИЧНОСТЬ, Ар и БА 153
5.3.1. Холестерин и болезнь Альцгеймера 154
5.3.2. «Хроническая» модуляция холестерина вызывает нарушение нейропластичности н нейродегенерацию ...155
5.4. ОКСИДАТИВНЫЕ РЕАКЦИИ, ПОЛ И НЕЙРОПЛАСТИЧНОСТЬ 158
5.4.1, Перекись водорода и нейропластичность 158
5.4.2, Перекисное окисление липидов (ПОЛ) и нейропластичность ...160
5.5. АМИЛОИД БЕТА-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ БЕЛОК? 162
5.5.1. Амилоид бета, нейропластичность и липиды 162
5.5.2. Ар и ПБА - интегрированная система для регулирования холестерина и динамики мембран ейронов 165
5.6. НАРУШЕНИЕ БИОХИМИИ ХОЛЕСТЕРИНА - ПЕРВИЧНАЯ ПРИЧИНА НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ? 166
5.6.1. Холестерин и признаки нейродегенерации 166
5.6.2. Наложение характеристических черт нейродегенерации при разных нейродегенеративных болезнях 170
5.6.3. Какова первичная причина нейродегенерации? .171
5.6.4. Холестерин, нейродегенерация и химическая специфичность нейротрансмиссии 172
ГЛАВА 6.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 174
6.1.0 незаменимой роли липидов в структурной и функциональной неиропластичности нейронов 174
6.2. Нарушение метаболизма холестерина в мозге и болезнь Альцгеймера 177
6.3. Оксидативные механизмы и синаптическая нейропластичность ..179
6.4. О роли амилоида бета и неиропластичности в метаболизме липидов 181
ГЛАВА 7.
ВЫВОДЫ 184
ГЛАВА 8.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 187
Введение к работе
За последние десятилетие в медико-биологической науке существенно возрос интерес к проблеме взаимосвязи биохимии липидов и целого ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА), Синдром Дауна, болезнь Иимана Пика Тип С (НПС), нейромышечные патологии.
Болезнь Альцгеймера относится к группе патологий старческого возраста и является четвертой причиной смертности в большинстве развитых стран после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний. Напротив, Синдром Дауна и болезнь Нимана Пика тип С поражают в детском возрасте. Несмотря на это основные морфобиологические характеристики перечисленных болезней почти идентичны. Это -внеклеточные отложения белка-амилоида бета (Ар) и наличие нейрофибриллярных клубков внутри нейронов, обусловленных избыточным фосфорилированием белка тау, в норме ассоциированого с микротрубочками.
В течение длительного времени в научной литературе существовало мнение, что главной причиной нейродегенарции при болезни Альцгеймера и синдроме Дауна являются отложения в ткани мозга амилоида бета. Считалось, что Ар, состоящий из 39-43 аминокислотных остатков является исключительно патологическим продуктом своего предшественника (ПБА) - трансмембранного гликопротеина, ген которого локализован на 21 хромосоме. Однако, в 1992 году АР был обнаружен в плазме крови и спинномозговой жидкости (СМЖ) здоровых доноров, а также в культуральных средах многих клеточных линий в растворенной, неаггрегированной форме (1-3). Более того, в собственных новаторских исследованиях автора и его коллег (4-11) было показано, что в плазме крови, СМЖ и культуральной среде клеток печени HepG2 Ар ассоциирован с липопротеинами высокой плотности (ЛВП)1. Это было позднее подтверждено другими научными группами (12-!3). Десять лет назад автором было высказано предположение, что, как и многие другие белки липопротеинов (называемые апобелками или аполипопротеинами), Ар имеет функции, связанные с обменом липидов. Некоторые из таких возможных функций были обнаружены автором и его коллегами, в частности, ингибирование этерификации холестерина (ХС) в плазме крови (14-15) и снижение синтеза липидов в культуре клеток печени человека (16-17). Дальнейшее изучение биохимической роли Ар в метаболизме липидов, в частности в переживающих срезах гиппокампа крысы, являлось одним из направлений данной работы. Важно заметить, что причинные факторы изменения биологии Ар и белка тау при болезни Альцгеимера и других патологических состояниях остаются все еще не раскрытыми (4,5). Возможно, что подобные изменения являются компенсаторным ответом на другие, более фундаментальные патологические процессы. Одной из возможных первичных причин нейродегенерации при болезни Альцгеймера и родственных заболеваниях является нарушение специфичности обмена липидов, способное в свою очередь вызвать каскад вторичных компенсаторных изменений, в том числе изменение биохимии амилоида бета, белка тау, и баланса реакций оксидативного стресса. В последующих главах диссертации рассматриваются эти взаимоотношения и предлагается новая оригинальная схема причинно-следственных связей при различных нейродегенеративных заболеваниях. Следует отметить, что новаторские исследования настоящей работы имеют под собой твердый научно-клинический базис. Все больше литературных данных последнего времени свидетельствуют о возможной взаимосвязи между обменом липидов и нейродегенеративными заболеваниями. В начале 90-х было показано, что наличие гомозиготной е4/е4 аллели АпоЕ у больных болезнью Альцгеймера (БА), основного апобелка в транспорте холестерина, является фактором риска БА (18,19). У больных и животных моделях БА обнаружены ряд нарушений, связанные с обменом холестерина. (20-23). Более того, холестерин накапливается в амилоидных бляшках больных БА и амилоидоподобных бляшках трансгенных ПБА мышей (24). Было показано также, что у кроликов и трансгенных мышей, содержащихся на диете с повышенным содержанием холестерина, происходит формирование амилоидоподобных бляшек в мозге (22, 23). Недавние исследования показали, что статины, ингибиторы основного фермента синтеза холестерина, З-гидрокси-3-метилглутарил коэнзим А редуктазы, снижают риск развития деменции и болезни Альцгеймера (25-27). При Синдроме Дауна (также как и при болезни Альцгеймера) имеет место нарушение этерификации холестерина в плазме крови. Трисомия по 21 хромосоме также характеризуется специфическим способом активации печеночного регуляторного белка, так называемого стерол-регулирующего связывающего элемента (SREBP), и стерол-независимым созреванием его молекулы. Более того, эмбрионам с Синдромом Дауна присущ высокий уровень холестерина крови и тканей (28, 29). В работе же Jaworska-Wilczynska и коллег (30) было продемонстрировано, что определенная группа миозитов (заболеваний из группы нейромышечных патологий) характеризуется повышенным накоплением (в очагах поражения мышц) рецепторов для липопротеинов низкой и очень низкой плотности, и ЛРП, белка липопротеинового рецептора.
Одной из задач настоящего исследования было выявление возможных патогенетических причинно-следственных взаимоотношений нарушения гомеостаза холестерина, других липидов и их перекисного окисления с процессами нейродегенерации.
Функции липидов в организме очень разнообразны, однако не все они изучены детально и подробно. Особенно, это касается ткани мозга. Очень многое в нейробиологии липидов еще предстоит выяснить. Так, например, до сих пор не выяснена роль холестерина, фосфолипидов, и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в функции нейронов. Следует подчеркнуть, что мозг содержит почти четверть всего холестерина организма, при этом составляя всего лишь 2 % от всей массы тела. Это подчеркивает исключительную важность холестерина и, очевидно, других мембранных компонентов мембран в работе нейронов. Ранее было показано, что при изменении метаболизма холестерина изменяется внутриклеточный транспорт синаптических везикул (31), активность Na К+ АТФазы (32), аденилатциклазы (33), ацетилхолиновых, никотиновых и родопсиновых рецепторов (34, 35), кальциего гомеостаза (36). Однако функциональная роль холестерина и фосфолипидов (ФЛ) (двух важнейших липидных компонентов мембран) в процессах памяти изучена мало. 1.1. Актуальность работы
В силу вышеизложенного, первоочередной целью настоящего исследования было выяснение роли липидов и их перекисного окисления в передаче нервных импульсов и синаптической пластичности, являющихся важными параметрами процессов памяти. Изучение этого вопроса позволяет решать не только фундаментальные общебиологические задачи, но и открывает перспективы для решения клинической проблемы участия нарушений обмена липидов в нейродегенеративных заболеваниях, в частности, в развитии болезни Альцгеймера. Не менее важным и актуальным является вопрос о взаимосвязи метаболизма липидов и Ар. Выяснение молекулярных основ этой взаимосвязи позволило бы приоткрыть причинно-следственные отношения между нарушениями липидного обмена у больных нейродегенеративными заболеваниями и отложениями Ар, и в связи с этим попытаться разработать патогенетически обоснованную терапию.
1.2. Цель и задачи исследования:
Целью настоящей работы было: 1) выявить роль липидов в: А) синаптическои пластичности нейронов, Б) процессах нейродегенерации; в) и ее взаимосвязи с амилоидом бета. 2) Изучить роль реакций оксидативного стресса и перекисного окисления липидов в синаптическои пластичности нейронов.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1) изучить влияние биохимии нарушений динамики обмена внутриклеточного холестерина и фосфолипидов на электрофизиологические параметры срезов гиппокампа;
2) изучить влияние содержания и внутриклеточной динамики холестерина и фосфолипидов на нейрофиламенты (ответственные за поддержание цитоскелета клетки) и фосфорилирование белка тау;
3) исследовать взаимосвязь холестериновой диеты с развитием основных функциональных и морфологических характеристик нейродегенерации Альцгеймеровского типа, а также поведением животных;
4) изучить синтезы липидов в ткани мозга крыс, находящихся на холестериновой диете;
5) изучить влияние низких и средних доз перекиси водорода на электрофизиологические параметры срезов гиппокампа;
6) изучить влияние ускорения реакций перекисного окисления липидов на синаптическую пластичность нейронов;
7) изучить влияние ингибиторов перекисного окисления липидов на синаптическую пластичность нейронов;
8) исследовать роль амилоида бета в синтезе липидов ткани мозга и захвате-транспорте липидов из внеклеточной среды;
9) изучить синтезы липидов при базовой синаптической пластичности и при активации механизмов нейропластичности (долгосрочной потенциации);
10) выяснить роль амилоида бета в механизмах синаптической пластичности и ее взаимосвязи с метаболизмом холестерина.
1.3. Положения, выносимые на защиту
1. Добавление внешних акцепторов холестерина (липопротеины высокой плотности и метил-Р-циклодектрин) к срезам гиппокампа крысы приводит к уменьшению содержания холестерина и фосфолипидов внутри нейронов и нарушает динамику липидов в ткани мозга.
2. Нарушение обмена холестерина и фосфолипидов в гиппокампе вызывает нарушения синаптической пластичности, нейротрасмиссии, и приводит к дегенеративным нарушению целостности нормального нейронального цитоскелета и гиперфосфорилированию белка тау.
3. Пища с повышенным содержанием холестерина приводит к отложению в ткани мозга крыс амилоидных бляшек, изменению синтеза липидов в ткани мозга и вызывает обратимые нарушения синаптической пластичности и поведенческих реакций животных.
4. Амилоид бета стимулирует синтез холестерина, а также холинсодержащих и холин- несодержащих фосфолипидов в ткани гиппокампа, усиливает захват внеклеточного холестерина (холестерина инкубационной среды) тканью мозга.
5. Перекисное окисление липидов (а также более ранний продукт клеточных оксидативных механизмов: перекись водорода) модулируют синаптическую нейропластичность
6. Амилоид бета активирует липидные синтезы в ткани мозга, и стимулирует захват холестерина среды срезами гиппокампа.
7. Долгосрочная потенциация усиливает топические липидные синтезы в гиппокампе. Напротив, базальная синаптическая активность не сопровождается усилением синтеза липидов в ткани мозга.
8. Амилоид бета восстанавливает долгосрочную потенциацию в срезах, поддерживаемых in vitro в течении более чем 20 часов; ингибитор синтеза холестерина статин мевинолин снимает такой эффект Ар.
9. Ткань мозга обладает стандартным набором компенсаторных механизмов, объясняющим однотипность морфологических признаков различных нейродегенеративных заболеваний, в частности - схожесть нейродегенеративных проявлений при болезни Альцгеймера, синдроме Дауна, болезни Нимана-Пика тип С, и отдельных нейромышечных патологиях.
1.4. Научная новизна работы
В работе представлены экспериментальные доказательства незаменимой роли холестерина и фосфолипидов в синаптической пластичности нейронов. Впервые доказано, что изменение внутриклеточной динамики обмена холестерина и фосфолипидов в ткани гиппокампа путем добавления в инкубационную среду "внешних" акцепторов холестерина изменяет синаптическую пластичность нейронов, составляющую основу механизмов памяти. Снижение уровня холестерина и фосфолипидов в клетках срезов гиппокампа приводило к нарушениям долгосрочной потенциации и пресинаптического компонента проводимости нервных импульсов. Обнаружено, что нарушение динамики и снижение содержания холестерина и фосфолипидов в клетках вызывает нейродегенерацию в гиппокампе. Нейродегенеративные изменения включали гиперфосфорилирование белка тау (в норме ассоциированного с микротрубочками) и изменения нормального нейронального цитоскелета, что было доказано методами иммуногистохимического анализа и флуоресцентной микроскопии.
В работе получены доказательства, что повышенное содержание пищевого холестерина приводит к увеличению синтеза собственного холестерина в ткани мозга и отложению в ткани мозга амилоида бета в виде Альцгеймеровских амилоидных бляшек. У крыс, содержащихся на диете с повышенным содержанием холестерина, отмечалось нарушение поведенческих реакций и синаптической пластичности в гиппокампе, причем возвращение к стандартной пище приводило к нормализации синаптической пластичности. Впервые было обнаружено, что два основных морфологических признака болезни Альцгеймера - избыточное фосфорилирование белка тау и отложение амилода бета в ткани мозга являются следствием нарушения процессов обмена холестерина и таким образом взаимосвязаны между собой.
В работе продемонстрировано, что роль и функции амилоида бета в ткани мозга также связаны с метаболизмом липидов: в срезах гиппокампа АР увеличивал синтез липидов, в частности холестерина и фосфолипидов. Амилоид бета также увеличивал захват холестерина среды переживающими срезами ткани гиппокампа крысы. В электрофизиологических экспериментах амилоид восстанавливал долгосрочную потенциацию, сниженную после долгого поддержания срезов in vitro, в то время как мевинолин, ингибитор синтеза холестерина из группы статинов, вызывал отмену положительного действия Ар на синаптическую пластичность.
В отдельной серии экспериментов настоящей работы было показано, что перекисное окисление липидов (ПОЛ) и предшествующие реакции оксидативного каскада модулируют долгосрочную потенциацию, доказывая существование нескольких механизмов (изменение гомеостаза холестерина и фосфолипидов, модулирование текучести мембран при биохимическом физиологическом модулировании ПОЛ) поддержания нейрональных мембран в функциональном статусе, достаточном для синаптической пластичности нейронов, основе процессов обучения и памяти.
1.5. Научно-практическая значимость работы
Полученные в работе результаты позволяют по новому взглянуть на функции холестерина и фосфолипидов как на важные биомолекулы в процессах передачи нервных импульсов и синаптической пластичности. Системные нарушения липидного метаболизма могут привести к сдвигу существующего равновесия в организме в целом и в ткани мозга, в частности, и, в результате, к развитию процессов нейродегенерации. Два основных морфологических признака нейродегенерации
Альцгеймеровского типа: отложение амилоида бета в виде амилоидных бляшек и гиперфосфорилирование белка тау как следствие нарушений структуры цитоскелета, а также синаптическая пластичность, лежащая в основе механизмов памяти, оказываются, вероятнее всего, вторичными событиями, вызванными нарушениями гомеостаза холестерина и фосфолипидов. Суммированные в работе данные способствуют раскрытию молекулярных механизмов патогенеза различных неиродегенеративных заболеваний, в том числе БА, СД, НПС, и отдельных нейромышечных патологий.
В работе была также разработана оригинальная экспериментальная камера для инкубации срезов мозга и поддержания их жизнеспособности в опытах in vitro.
Обнаруженные в работе причинно-следственные взаимоотношения между холестерином и развитием морфологических и функциональных характеристик болезни Альцгеймера открывают новые перспективные направления для разработки эффективных методов терапии этого заболевания.
