Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1 Эпителий воздухоносных путей. Структура и функции 8
-
Носовая полость 8
-
Гортань 9
-
Трахея 10
-
Бронхи 12
-
Состав и функции секрета воздухоносных путей 14
2 Термические ожоги 18
2.1 Ингаляционные ожоги 19
-
Обструкция дыхательных путей 24
-
Острый респираторный дистресс синдром и бронхиальная циркуляция 26
-
Пневмония 28
3 Окислительный стресс при патологиях дыхательной системы 30
-
Источники активных форм кислорода 30
-
Антиоксидантная защита дыхательной системы 34 Супероксид дисмутазы (SODs) и каталаза (CAT) 35 Глутатион пероксидазы (GPxs) 36 Тиоредоксины (Trxs) 37 Пероксиредоксины 38 Каталитический цикл пероксиредоксинов 39 Пероксиредоксин 6 41 Антиоксидантная функция пероксиредоксина 6 42
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
1 Материалы 47
2 Методы 48
-
Термический ожог верхних дыхательных путей крыс 48
-
Выделение Ргх 6 методом хроматографии Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе 49
-
Приготовление срезов, залитых в эпоксидную смолу 51
-
Приготовление парафиновых срезов 52
-
Получение криосрезов 53
-
Иммуногистохимический анализ 53
-
Получение соскоба респираторного эпителия трахеи крыс 54
-
Определение цитокинов в соскобе трахеи крыс 54
-
Определение пероксиредоксина 6 в соскобе эпителия трахеи 55
-
Мечение пероксиредоксина 6 флуоресцентным красителем 55
-
Инактивация пероксиредоксина 6 гидропероксидом водорода 55
-
Ионнообменнная хромотография 56
-
Электрофорез белков 56
-
Иммуноблоттинг 56
-
Определение антиоксидантной активности пероксиредоксина 6 57
2.16 Определение концентрации белка 58
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 60
1 Разработка экспериментальной модели ожоговой травмы верхних
дыхательных путей 60
-
Общее положение 60
-
Модель термического ожога верхних дыхательных
путей с помощью пара 61
Изменения морфологии эпителия в результате ожога трахеи 64
Лейкоцитарная реакция 68
Динамика развития воспалительного процесса в эпителии 68
Цитокиновый профиль 68
Динамика экспрессии Ргхб в трахее после термического ожога 70
2 Влияние экзогенного Ргхб на состояние эпителиальной ткани
после термического ожога верхних дыхательных путей 73
-
Локализация апплицированного Ргхб в пораженной трахее 75
-
Эффект аппликации Ргхб в пораженные
верхние дыхательные пути 77
-
Определение введенного Ргхб в пораженной трахее 79
-
Влияние экзогенного Ргхб на изменение структуры поврежденной эпителиальной ткани трахеи с течением времени 80
Анализ структуры эпителия обожженной трахеи 81
Анализ структуры гистолгических препаратов, где после
ожога вводили инактивированный Ргхб 85
Анализ структуры гистологических препаратов после
введения активного Ргхб 89
3 Влияние преднизолона на состояние эпителиальной ткани после
термического ожога верхних дыхательных путей. Сравнительная
характеристика преднизолона и Ргхб 92
-
Преднизолон и его функции 92
-
Влияние преднизолона на состояние эпителиальной ткани после термического ожога паром. Анализ гистологических препаратов 93
-
Сравнительный анализ 97
4 Регенерация респираторного эпителия. Образование
респираторно-подобных структур внутри эпителия поврежденной
трахеи 100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ 106
СПИСОК ЛИТРАТУРЫ 107
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АОС - антиоксидантная система
АФК - активные формы кислорода
ИЛ 1 -10 - интерлейкин 1-10
ЛПС - липополисахарид
ОРДС - острый респираторный дистресс синдром
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ФНОа - фактор некроза опухоли
CAT - каталаза
GPx — глутатионпероксидаза
GSH - восстановленный глутатион
GSSG - окисленный глутатион
iPLA2 - Са2+ независимая активность фосфолипазы А2
Ргх - пероксиредоксины
Ргхб - пероксиредоксин 6
SDS - додецилсульфат натрия
SOD - супероксиддисмутаза
Trxs - тиоредоксины
7CGST - глутатион S-трансфераза к
Введение к работе
Термическая травма дыхательных путей или ингаляционный ожог относится к категории наиболее тяжелых заболеваний, которые характеризуются сложной цепью общих и местных нарушений. Ингаляционные ожоги встречаются довольно часто и составляют от 3 до 21% от всех ожоговых больных и являются одной из главных причин летальных исходов. Соответственно, поиск эффективных способов лечения данных патологий является одной из актуальных проблем современной медицины.
В ингаляционном ожоге выделяют три основные составляющие, которые вызывают разные патологии и действуют на разные мишени. Это отравление токсинами, вдыхание твердых частиц продуктов горения и, наконец, собственно термический ожог. Если первым двум факторам уделено большое количество исследований, то исследования по термической составляющей ожога дыхательных путей практически отсутствуют.
Известно, что термический фактор (горячий воздух, пар и т.д.) приводит к массовой гибели клеток респираторного эпителия уже на первой стадии развития патологий, что приводит к развитию мощного окислительного стресса в пораженной ткани [Меньщикова Е.Б. и др. 2008]. В данном случае на первый план выступают собственные антиоксидантные системы защиты, которые должны нейтрализовать избыточную токсичность активных форм кислорода (АФК). Таким образом, исследование функционирования этих антиоксидантных систем является одним из важных моментов в понимании механизмов развития патологических процессов во время термического ожога. Следует отметить, что данная проблема практически не изучена.. Другим аспектом этого вопроса является проблема уменьшения патологических процессов, а именно, возможность влияния на эффективность антиоксидантной системы для уменьшения последствий термического ожога. Таким образом, в случае термической травмы органов дыхания проблема исследования антиоксидантных систем является особо актуальной.
В случае верхних дыхательных путей антиоксидантная система представлена набором антиоксидантных ферментов, основным из которых является пероксиредоксин 6 (Ргхб). Вклад Ргхб в нейтрализацию АФК в трахее составляет 70% [Новоселов В.И. и др. 1999,2003]. Следует особо отметить, что он способен нейтрализовать неорганические и органические гидропероксиды, а также пероксинитриты. Таким образом, будучи основным антиоксидантом в дыхательных путях, Ргхб определяет поведение антиоксидантной системы в целом.
В этом случае, исследования поведения Ргхб в верхних дыхательных путях в процессе развития патологического процесса при термическом ожоге представляет собой особый интерес. Более того, во многих работах показана защитная роль Ргхб при различных патологиях разных эпителиальных тканей [Kumin A. et al., 2006., Fisher А.В. et al., 2004., Kubo E. et al., 2008.], а также его терапевтическая роль при лечении ран кожи. [Новоселов В.И. и др. 2000, 2003.]. Поэтому исследования по влиянию Ргхб на развития патологического процесса при термической травме верхних дыхательных путей является актуальным с медицинской точки зрения.
