Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Обмен кислорода при физиологически протекающей беременности и беременности, осложненной гестозом 14
1.1. Распространенность гестозов и наиболее часто сопутствую щая им патология в третьем триместре беременности 14
1.2. Биологическая роль и механизмы генерации и утилизации реактивных оксигенных радикалов в организме человека 21
1.3. Особенности внешнего и тканевого дыхания при беременности и его расстройство при гестозах и другой акушерской патологии ...30
1.4. Биохимическая характеристика ферментов, участвующих в обмене POP в эритроцитах, и их чувствительность к различным факторам внутренней и внешней среды ...39
1.4.1. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 39
1.4.2. Сукцинатдегидрогеназа 40
1.4.3. Глютатионредуктаза... ...42
1.4.4. Супероксиддимутаза 43
1.4.5. Каталаза 47
1.5. Биохимическая характеристика плазменных ферментов, участвующих в обмене POP, и способность сыворотки крови гасить активные формы кислорода 51
1.5.1. Церулоплазмин 51
1.5.2. Оксид азота 53
1.5.3. Хемилюминисценция 58
Глава II. Ретроспективный анализ акушерских пособий и медикаментозной терапии при физиологически протекающей беременности и беременности, осложненной гестозом 63
Экспериментальный раздел
Глава III. Свойство ферментов антиокислительной системы эритроцитов инициировать процессы оксигенации гемоглобина и участвовать в антибактериальной защите организма . 73
3.1. Влияние супероксидного кислорода на уровень оксигемоглобина крови и на активность ферментов, участвующих в его метаболизме 79
3.2. Свойство эритроцитов подавлять рост и размножение патогенных и условнопатогенных микроорганизмов 90
Глава IV. Действие средств анестезиологического обеспечения, антибактериальных средств, ингибиторов секреции соляной кислоты и антиастматических средств на активность ферментов антирадикальной защиты ... 107
4.1. Методы, использованные при изучении ингибирующих свойств лекарственных препаратов на активность ферментов антирадикальной защиты ...107
4.2. Действие средств анестезиологического обеспечения на активность ферментов антирадикальной защиты 110
4.3. Влияние мышечных релаксантов, анестетиков и снотворных веществ на активность ферментов антирадикальной защиты 114
4.4. Влияние ингибиторов секреции соляной кислоты и антацидов на активность ферментов антирадикальной защиты эритроцитов... 119
4.5. Действие антибактериальных средств на активность ферментов антирадикальной защиты эритроцитов 124
4.6. Действие антиастматических препаратов на активность супер-оксиддисмутазы и каталазы эритроцитов и на хемилюминисценцию сыворотки крови 135
Клинический раздел
Глава V. Распределение беременных по группам и методы исследования... 143
5.1.Формирование клинических групп и их характеристика 145
5.1.1. Характеристика женщин контрольной группы ...145
5.1.2. Характеристика беременных и распределение их по группам... 146
5.1.3. Методы биохимических исследований 153
5.1.4. Показатели активности ферментов АРЗ эритроцитов и неферментативных факторов сыворотки крови у испытуемых контрольной группы 155
Глава VI. Состояние системы антирадикальной защиты крови у женщин с физиологически протекавшей беременностью и беременностью, осложненной гестозом 156
6.1. Состояние ферментативной и неферментативной системы антирадикальной защиты крови у женщин с физиологически протекавшей беременностью при родах через естественные пути .158
6.2. Состояние ферментативной и неферментативной системы антирадикальной защиты крови у женщин с беременностью, осложненной гестозом 168
Глава VII. Состояние системы антирадикальной защиты крови при кесаревом сечении у женщин с физиологически протекавшей беременностью и беременностью, осложненной гестозом 176
7.1. Состояние ферментативной и неферментативной системы антирадикальной защиты крови при кесаревом сечении у женщин с физиологически протекавшей беременностью 180
7.2. Состояние ферментативной и неферментативной системы антирадикальной защиты крови при кесаревом сечении у женщин с беременностью, осложненной гестозом 184
Заключение 191
Выводы... 213
Указатель литературы 217
- Распространенность гестозов и наиболее часто сопутствую щая им патология в третьем триместре беременности
- Особенности внешнего и тканевого дыхания при беременности и его расстройство при гестозах и другой акушерской патологии
- Влияние супероксидного кислорода на уровень оксигемоглобина крови и на активность ферментов, участвующих в его метаболизме
- Методы, использованные при изучении ингибирующих свойств лекарственных препаратов на активность ферментов антирадикальной защиты
Введение к работе
Известно, что даже физиологически протекающая беременность сопровождается биохимическими пертурбациями, которые затрагивают все без исключения виды обмена веществ. Перестройка обмена веществ начинается буквально с первых недель беременности, и по мере увеличения её срока нарастают метаболические сдвиги, которые зачастую проходят без каких-либо клинических проявлений. Благоприятное течение беременности возможно только у здоровых женщин с неотягощенной наследственностью, проживающих в экологически благополучной среде, в обстановке здорового психологического климата и получающих полноценное и достаточное питание. Однако беременность не всегда протекает гладко. Часто возникают различные осложнения беременности, в том числе и тяжелые. Среди них лидирующее место занимают гестозы.
По данным В.И.Кулакова, Л.Е. Мурашко (1998) в западном регионе Российской Федерации эта патология встречается в пределах 3-16%, Г.М. Савельевой, Р.Н. Шалиной (1998) - 16-17%, И.С. Сидоровой, Л.С. Калюжиной (1998) - 17%. В регионах с неблагоприятной экологической обстановкой гестозы встречаются чаще. Так, в Самарской области это осложнение достигает 33% (Линева О.И., Гильмиярова Ф.Н., Спиридонова Н.В., 1998), в Дагестане гестозы отмечаются у 43% беременных, к тому же они часто сопровождаются железодефицитной анемией (Омаров С.М.А., Омаров Н.С.М., 2000). На Урале это осложнение колеблется в пределах 68 - 76% от общего числа беременных (Башлыкова Н.В., Медвинский Н.Д., Юрченко Л.Н. и др., 1998).
В 4-ом родильном доме г. Краснодара за период 1997-2002 гг. гестоз диагностирован у 25-29% беременных и рожениц, примерно такой же процент этого осложнения беременности отмечается в эти годы и по данным Краснодарского краевого перинатального центра городской больницы № 2 (Пенжоян Г.А., Гудков Г.В., Сысоева В.В., 2003).
Валленберг К.С.С. (1998) полагает, что только у 8-10% первобере-менных беременность протекает без протеинурии. Причем, у многих из них она сопровождается гипертензией.
Для гестозов характерна триада патогенетических признаков, это: отеки, протеинурия и гипертензивные нарушения (Баранов И.И., Абубаки-рова A.M., Мурашко Л.Е., Бурлев В.А., 1996). При этом осложнении беременности страдает гемостаз (Репина М.А., Корзо Т.М. и соавт., 1998; Комендант Р.И., Палади Г.А. и соавт., 1998), развивается маточно-плацентарная недостаточность (Громыко Г.Ф., 1995; Стрижаков А.Н., Му-саев З.М., Меликова Н.Л., Мельников В.А., 2000). При гестозах развиваются явления гипоксии (Фурсова З.К., Балика Ю.Д., Абубакирова A.M., 1995; Пилявская А.Н., Адиятулин А.И. и соавт. 1997; Мурашко Л.Е., Юсупова Л.Н. и соавт. 1998). На почве расстройства внешнего дыхания при гестозах нарушается и процесс генерации активных форм кислорода фагоцитами в легких (Коган А.Х., Мануйлов Б.М. и со авт., 1999), изменяются физико-химические свойства плазматических мембран эритроцитов (Микаелян Н.П., Максина Н.Г. и соавт., 1997) и отмечается ряд других расстройств.
При беременности, осложненной гестозом, в патологический процесс вовлекаются не только сердечно-сосудистая система, почки, интра-целлюлярный обмен и внешнее дыхание организма, но и клеточное дыхание. При этом генерируется избыточное количество реактивных оксиген-ных радикалов ('Ог, 0{, ОН" и Н2О2), которые вызывают негативные химические процессы, такие как: перекисное окисление липидов (Бурмистрова CO., Дубинина Е.Е., Арутюнян А.В., 1997), в связи с чем увеличивается нагрузка на ферментативное и неферментативное звено системы антирадикальной защиты.
При гестозе нарушается эдогенная детоксикация и углубляются явления дисбаланса окислительно-восстановительных процессов (Пестряева Л.А., Юрченко Л.Н. и соавт., 2000), этому способствуют нарастающие гипертензивные расстройства (Паранич А.В., Лад С.Н. и соавт., 2000).
В настоящее время реактивные оксигенные радикалы в основном рассматриваются как негативные метаболиты, инициирующие процессы перекисного окисления липидов, вызывающие повреждение ДНК и ряд других нежелательных явлений. Однако им принадлежит ряд позитивных функций. Например, они инициируют процессы оксигенации гемоглобина, завершают деление клеток, придают антибактериальные свойства эритроцитам, участвуют в биосинтезе простагландинов и прогестерона, активируют гуанилатциклазу и выполняют ряд других метаболических функций, необходимых для организма (Скулачев В.П., 1998; Пескин А.В., 1998; Калуев А.В., 1998; Кондрашева М.Н., 1999; Сторожук П.Г., Быков И.М., Сторожук А.П., 1997; Сторожук П.Г., 2000; Шепелев А.П., Корниенко И.В. и соавт., 2000).
В связи с этим представляет большой теоретический и практический интерес изучение вопросов, связанных с генерацией и утилизацией активных форм кислорода при гестозах, а также вопросов, касающихся изменения этой важнейшей метаболической функции при действии лекарственных препаратов, применяемых в акушерстве.
Из этого следует, что частота распространения такого грозного осложнения беременности, как гестозы, и тех многообразных метаболических сдвигов, которые наступают при гестозах, с вовлечением в них окислительно-восстановительных процессов, протекающих непосредственно в системе «мать-плацента-плод», делают эту проблему одной из актуальнейших в современном акушерстве. Актуальность этой проблемы возрастает ещё и потому, что терапия женщин с осложненной гестозом беременностью требует применения различных медикаментозных препаратов, как в дородовом периоде, так и во время родов через естественные пути, и особенно при оперативном родоразрешении. Среди лекарственных препаратов, применяемых для этих целей, имеются мощные ингибиторы ферментов прямой и косвенной антирадикальной защиты. Это создает допол- нительную нагрузку на антиоксидантную систему организма, которая требует пристального внимания и изучения.
Целью работы явилось: определение биологической роли и обмена активных форм кислорода при физиологически и патологически протекающей беременности, а также определение действия лекарственных препаратов, применяемых в акушерстве, на активность ферментов, участвующих в метаболизме реактивных оксигенных радикалов.
Задачи: 1) Провести ретроспективный анализ 1000-1100 историй родов (по материалам годовых отчетов 4-го роддома г. Краснодара) для выявления процента беременности, осложненной гестозом, процента беременных и рожениц, подвергшихся оперативному (кесарево сечение) родо-разрешению, и анализ использования некоторых лекарственных препаратов в акушерской практике;
Показать роль ионизированного (супероксидного - 02') кислорода в процессах оксигенации гемоглобина, используя для этих целей специально разработанное «фокусирующее приспособление к ионизатору элек-троэффлювиального типа»;
Показать роль каталазы и метаболитов ЦТК на интенсивность клеточного дыхания и скорость деления дрожжевых клеток, применив для этих целей специальную авторскую «газометрическую» установку;
Показать роль каталазы и Н2Ог в обеспечении вновь выявленного свойства эритроцитов - антибактериальной защиты, используя для этих целей специально разработанную «инкубационно-диффузионную» установку;
Исследовать (in vitro) действие наиболее часто применяемых в акушерстве лекарственных препаратов (антибактериальных средств, средств анестезиологического обеспечения, антиастматических препаратов, ингибиторов соляной кислоты и антацидов) на активность ферментов АРЗ крови;
Изучить изменение активности ферментов антирадикальной защиты крови у женщин в дородовом и послеродовом периодах при физиологически протекавшей беременности и беременности, осложненной гесто-зом;
Изучить динамику плазменных компонентов АРЗ и хемилюми-нисценции в предродовом и послеродовом периодах при физиологически протекавшей беременности и беременности, осложненной гестозом;
Изучить изменение активности ферментов АРЗ крови у женщин в пред- и послеоперационном (кесарево сечение) периодах при физиологически протекавшей беременности и беременности, осложненной гестозом;
Изучить динамику плазменных компонентов АРЗ и ХЛ у женщин в пред- и послеоперационном (кесарево сечение) периодах при физиологически протекавшей беременности и беременности, осложненной гестозом;
10) На основании изучения архивного материала и полученных экс периментальных и клинических данных разработать мероприятия, направ ленные на повышение АРЗ крови при гестозах, и рекомендации для более рационального применения антиоксидантов и выбора более щадящих средств анестезиологического обеспечения и антибактериальных препара тов при кесаревом сечении.
Научная новизна Установлен уровень генерации оксигенных радикалов в сыворотке крови у женщин при физиологически протекавшей беременности в третьем триместре и при беременности, осложненной гестозом. Показана роль ионизированного (супероксидного) кислорода и других АФК в инициации процессов оксигенации гемоглобина. Показана роль эритроцитарных АФК и утилизирующих их ферментов в ранее неизвестных механизмах антибактериальной защиты. Установлено, что антибиотики оказывают влияние на клеточное дыхание, а, следовательно, и на кроветворение. Установлено, что антиастматические и некоторые средства анестезиологического обес- печения оказывают влияние на люминолзависимую люминисценцию сыворотки крови.
На основании клинического и экспериментального материала дано научное обоснование для дозированного применения ионизированного кислорода. Экспериментальным путем определены антибиотики и средства анестезиологического обеспечения более мягкого действия с целью их применения в акушерстве.
Теоретическая значимость работы. Настоящая работа расширяет наши теоретические представления о биологической роли активных форм кислорода и системы ферментов антирадикальной защиты крови в целом, и эритроцитов в частности, применительно к организму человека. В ней подробно рассматривается значение реактивных оксигенных радикалов в организме беременной женщины с физиологически протекающей беременностью и беременностью, осложненной гестозом.
Теоретическое значение работы состоит еще в том, что в ней показаны естественные пути генерации (V в эритроцитах и поступления его с атмосферным воздухом, и пути утилизации POP, в которых участвуют ферменты прямой (супероксиддисмутаза и каталаза) и косвенной (глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа и глютатионредуктаза) антирадикальной защиты. В результате этих реакций образуется Н2О2, которая разлагается каталазой, образуется вода и молекулярный кислород. Ог получает от каталазы ускорение и тем самым инициирует процесс ок-сигенации гемоглобина. Эта же единая система активных форм кислорода и ферментов участвует в процессах деления клеток и придает эритроцитам антибактериальные свойства.
Практическая значимость работы. Она состоит в том, что установленные новые научные факты о роли активных форм кислорода в механизмах оксигенации гемоглобина, в делении клеток и обеспечении антибактериальных свойств у эритроцитов, заставляют пересмотреть отношение к POP и к ферментам АРЗ в различных областях практической меди- цины. Это в первую очередь касается анестезиологии, акушерства, хирургии, терапии, пульмонологии, гематологии, педиатрии, иммунологии и др. медицинских специальностей.
Экспериментально установлено, что многие лекарственные средства (антибиотики, средства анестезиологического обеспечения, ингибиторы секреции соляной кислоты и антациды), используемые в акушерстве, обладают способностью понижать активность ферментов АРЗ. Это позволяет выбирать более щадящие препараты (в случаях крайней необходимости) для беременных женщин, для рожениц, у которых роды идут естественным путем и для женщин, подвергающихся операции кесарева сечения.
Установлено, что у рожениц с беременностью, осложненной гесто-зом, более выражены сдвиги метаболизма активных форм кислорода, чем у женщин с физиологически протекавшей беременностью. Это должно учитываться при терапии гестоза, ведении родов и оперативном родоразре-шении.
Исследования действия антиастматических средств на активность ферментов АРЗ и действия дозированного ионизированного кислорода на оксигенацию гемоглобина выполнены на перспективу их применения во время родоразрешения, в послеродовом и послеоперационном периодах, т.е. в то время, когда больше всего выражена гипоксия.
Основные положения, выносимые на защиту
Установлено, что активные формы кислорода и ферменты прямой и ' косвенной антирадикальной защиты, образующие единую систему «АФК-ФАРЗ», инициируют процессы оксигенации гемоглобина.
Выявлено ранее неизвестное свойство эритроцитов антибактериальной защиты организма, которое обеспечивается за счет ферментов АРЗ, где ведущая роль принадлежит каталазе.
Экспериментально установлено, что многие средства анестезиологического обеспечения, антибиотики, ингибиторы секреции соляной кислоты и антиастматические средства обладают ингибирующими свойствами. В их присутствии снижается активность как ферментов прямой антирадикальной защиты (супероксиддисмутазы и каталазы), так и косвенной АРЗ (сук-цинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глютатионредук-тазы).
Установлено, что у рожениц с нормально протекавшей беременностью и беременностью, осложненной гестозом, имеются существенные сдвиги в метаболизме факторов антирадикальной защиты крови, которые практически остаются такими же и в раннем послеродовом периоде.
Выявлено, что после вводного наркоза (при кесаревом сечении) отклонения показателей АРЗ крови женщин выражены больше, чем у родо-разрешившихся через естественные пути. В раннем послеоперационном периоде эти отклонения еще больше увеличиваются.
Установлено впервые, что плазма пуповинной крови имеет крайне низкую активность церулоплазмина.
Распространенность гестозов и наиболее часто сопутствую щая им патология в третьем триместре беременности
Гестоз по-прежнему является актуальной проблемой современного акушерства и занимает ведущее место в структуре материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. Частота гестозов в центральном регионе России достигает 2-17% , а перинатальная смертность составляет 10-30% (Кулаков В.И., Мурашко Л.Е., 1998; Савельева Г.М., Шалина Р.И, 1998; Сидорова И.С, 1998), такая же смертность от этого осложнения приводится и по США (Токова 3.3., Фролова О.Г., 1998). В Самарской области беременность, осложненная гестозом, наблюдается у 33% беременных (Линева О.И., Гильмиярова Ф.Н., Спиридонова Н.В., 1998), а по данным Уральского НИИ ОММ, этот показатель в регионе в отдельные годы составляет 68-76% (Ба широва Н.В., Медвинский И.Д., Юрченко Л.Н. и соавт., 1998). Особенно часто беременность осложняется поздним токсикозом (46%), если она развивается на фоне даже легкой формы гипертонической болезни (Беккер СМ., 1975). У 75-80% беременных женщин, страдающих гестозом, хорошая реакция на терапию и беременность заканчивается благоприятно. У остальных 20-25% гестоз носит упорный характер и грозит тяжелыми осложнениями для матери и плода, в таких случаях необходимо решать вопрос о прекращении беременности (Серов В.Н., Маркин С.А., 1988). В последнее время было установлено, что явления вазоконстрикции, развившиеся в период беременности, продолжительное время остаются и после родов (Мазурская Н.М., Федорова М.В. и соавт., 2001).
Высокий процент беременности, осложненной гестозом, и в развитых и экологически благополучных странах. Так, Дж.К.Гланц (2001) приводит статистику по беременности, осложненной гестозом, и по кесаревому сечению в США. Это осложнение составляло 21,9% из 6798 беременных женщин. При этом он отмечает, что кесарево сечение чаще производилось при беременности, осложненной гестозом. Валленберг К.С.С. (1998) считает, что в Нидерландах только у 8-10% первородящих беременность протекает без каких-либо первичных признаков гестоза.
В 4-ом родильном доме г. Краснодара за период 1997-1999 гг. гестоз диагностирован у 25-29% рожениц. Примерно на таком же уровне % гестоза остается и в последние три года (2001-2003 гг..).
Известно, что для гестоза характерна триада основных патогенетиче ских признаков, таких как: гипертензия, отеки и наличие белка в моче. Неко торые авторы считают, что гипертензию при гестозе следует рассматривать как приспособительную реакцию организма, которая направлена на обеспе чение перфузии тканей (Мирович Д.Ю., Чернова Т.К., Мирович Е.Д., 1988). Но иногда повышенное давление трудно диагностируется. Поэтому в по следнее время прибегают к исследованию мониторинга суточного артери ального давления и частоты сердечных сокращений (Гурьева В.М., Логутова Л.С. и соав., 2003), который свидетельствует о нарушении регуляторной функции ангиотензин-кининовой системы, водно-электролитного обмена и фильтрационно-абсорбционной способности почек. По мнению
Г.М.Савельевой и Р.И.Шалиной (1998) причинами для развития гестоза являются: 1. Торможение миграции трофобластов и отсутствие трансформации мышечного слоя спиральных артерий по мере прогрессирования беременности предрасполагает к их спазму и к снижению межворсиночного кровотока и гипоксии. Снижение маточного кровоснабжения в ранние сроки беременности (8-12 недель) способствует развитию гестоза. 2. Гипоперфузия тканей, гипоксические и гипоишемические изменения. Гипервязкость крови, гиперагрегация эритроцитов, снижение заряда эритроцитов, снижение полиено-вых жирных кислот в биомембранах форменных элементах крови и актива ция процессов ПОЛ. 3. Развивающаяся почечная и печеночная недостаточность.
В рамки этих патологических отклонений укладываются данные и других авторов, которые отмечают анемию у 15-80% беременных (Мурашко Л.В., Юсупова Л.Н. и соавт., 1998), причем особенно часто гестоз развивается на фоне железодефицитной анемии, которая в некоторых регионах России достигает 43-90% (Омаров С.М.А., Омаров Н.С.М., 2000), или при анемии у многорожавших женщин (Абу Насар М.А., Омаров С.М.А., Абу Насар З.М., 2001).
При гестозах не менее часто развивается гиповолемический синдром (Заварзина О.О., Дюгеев А.Н., 1999) и нарушение гемостаза (Репина М.А., Корзо Т.М., Папаян Л.В. и соавт., 1998; Комендант Р.И., Палади Г.А., Годо-рожа С.А., 1998). При этом у беременных женщин изменяются структурно-функциональные свойства плазматических мембран эритроцитов. Происходит увеличение микровязкости эритроцитов и снижение параметров их гид-рофильности. Особенно отчетливо эти изменения проявляются к концу срока беременности. В это время усиливается перекисное окисление липидов (ПОЛ) на фоне снижения антиоксидантной активности крови (Танина А.П.Г 1985). Изменения, происходящие в мембране эритроцитов, следует рассматривать как положительные, так как они повышают проницаемость мембран для кислорода (Микаелян Н.П., Максина А.Г., Князев Ю.А., Микаелян А.В, 1997).
Многие исследователи полагают, что 1/3 беременных женщин относится к группе с высокой степенью риска (Терамо К., 1984), причем у большинства из них она сопровождается явлениями гипоксии (Гребенщиков Е.П., Макиша Ф.С., 1974; Демидов В.Н., Саакян С.С., 1975; Баранников В.В. и соавт., 1976), на фоне которой развивается гестоз (Червакова Т.В., Иванов И.П., Твердохлебова Е.Я., 1989).
Особенности внешнего и тканевого дыхания при беременности и его расстройство при гестозах и другой акушерской патологии
Свободные радикалы инициируют цепные реакции окисления различных субстратов, среди которых наиболее изученными являются липиды. Под действием свободных радикалов из них вначале образуются жирно-кислотные радикалы, а затем перекисные радикалы. Вслед за реакциями разветвления следуют реакции обрыва цепи, которые наступают либо вследствие образования конечных продуктов (альдегидов, эпоксидов, кетонов), либо вследствие взаимодействия с антиоксидантами. Цепь реакций перекисного окисления липидов может оборваться на стадии их инициации (с помощью ферментных и неферментных антиоксидантов) и на стадии образования гидроперекисей липидов с помощью глутатионпероксидазы, которая восстанавливает их до соответствующих оксикислот (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).
В тех случаях, когда не происходит размыкание цепи ПОЛ, развиваются реакции с образованием вторичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов, малонового диальдегида и др., которые идут ферментативно и неферментатив-но (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Лукьянова Д.Л., Баллуханов Б.С., Уголев А.Г., 1982). POP помимо негативного действия на полиеновые жирные кислоты (действуют только на жирные кислоты с тремя и более двойными связями) липидов плазматических мембран оказывают неблагоприятное влияние и на другие биомолекулы. Существует мнение, что все АФК являются сильными мутагенами, тератогенами и канцерогенами. Они повреждают азотистые основания, инициируют разрывы одно- и двухнитевых молекул нуклеиновых кислот, снимают действие белка репрессора ДНК и др. (Калуев А.В., 1998; ПескинАБ., 1997).
Активные формы кислорода образуются в тканях постоянно в результате функционирования окислительно-восстановительных систем и находятся в организме в определенных постоянных концентрациях. Возникающие изменения внутренней среды организма во время болезни и различные внешние воздействия повышают уровень АФК в клетке, а это опасно для жизни (Пес-кин А.В., 1998).
В организме АФК выполняют разнообразные позитивные функции, в том числе и поддерживают на необходимом уровне ПОЛ. При помощи ПОЛ возможно обновление состава липидов в плазматических мембранах и мембранах субклеточных структур. АФК участвуют в энергетических процессах, в клеточном делении и синтезе биологически активных биомолекул (Гусев В.А., Брусов О.С., Панченко Л.Ф.,1980; Кондрашева М.Н., 1999; Fridovich I., 1978). Диеновые конъюгаты, образующиеся при ПОЛ, облегчают процесс самообновления мембранных структур и увеличивают проницаемость плазматических мембран (Гусев В.А., Панченко Л.Ф., 1982; Бышевский А.Ш., Терсенов О.А., 1994). С помощью реакций ПОЛ осуществляется синтез простагланди-нов, лейкотриенов (среди которых и тромбоксан В2), прогестерона, гидрокси-лирование стерольного кольца в холестерине и активация гуанилатциклазы (Гусев В.А., Панченко Л.Ф., 1982; Berezov Т.Т., Korovkin B.F., 1992). Кроме того, показано участие активных форм кислорода в инициации процессов ок-сигенации гемоглобина и в защите от бактериальной (Сторожук П.Г., Сторо-жук А.П., 1999; Сторожук П.Г., 2000) и вирусной инфекции (Скулачев В.П., 1998). При вирусной инфекции активируется ксантиноксидаза, превращая ксантин в гипоксантин с образованием не Н20, а 02 и Н202. Вероятен и второй путь генерации 02 - за счет активации НАДФН- оксидазы (Скулачев В.П., 1998).
Одним из многочисленных механизмов образования АФК в крови является реакция освобождения гипохлорита (ОСГ) из хлорноватистой кислоты (НОСІ), которая синтезируется миелопероксидазой фагоцитов. А в реакции ОСГ + Н2О2 02 + С Г + Н20 образуется синглетный кислород, который является эффективным инициатором перекисного окисления липидов (Пана-сенко О.М., Арихольд Ю., Шиллер Ю., 1997; Панасенко О.М., Панасенко О.О., Бривиба К., Сие Г., 1997).
Однако реактивные оксигенные радикалы при нарушении стационарного равновесия оказывают негативное действие. Эти частицы, имеющие не спаренные электроны и разнонаправленные спины электронов, легко вступают во взаимодействие с различными биомолекулами, нарушая их структуру и функции.
Поскольку в настоящей работе речь идет о метаболизме кислорода в эритроцитах, то мы систематизировали имеющиеся в литературе сведения по этому вопросу (Мецлер Д.Е., 1980; Страйер А., 1985; Сторожук П.Г., 2000; Murry R.K., Granner D.K. et al.. 1995) и отразили основные ферментативные и неферментативные механизмы и пути генерации и утилизации реактивных оксигенных радикалов (рисЛ .2.2).
Из приведенного рисунка видно, что метаболические пути, существующие в эритроцитах, обеспечивают процессы генерация 0{, из которого в присутствии НАДФ- и ФАД-зависимых дегидрогеназ образуются АФК. В этих процессах участвуют и неферментативные механизмы, к ним относятся гемоглобин и свободное железо. В процессах генерации и утилизации АФК также участвуют спонтанные реакции Фентона и Хабер-Вейса, протекающие в присутствии Fe2+ и Fe3+.
Влияние супероксидного кислорода на уровень оксигемоглобина крови и на активность ферментов, участвующих в его метаболизме
В работах П.Г.Сторожука и В.А.Скляра (1988) моделировались реакционные смеси, в состав которых включались в различных комбинациях: гемоглобин, каталаза, супероксиддисмутаза, восстановленные НАД и НАДФ, рас твор Н202, а затем через эти системы продувался воздух или кислород. Этими экспериментами было доказано, что под влиянием выше указанных ферментов и доноров Н в МРС повышается уровень оксигемоглобина. А несколько позже (Сторожук П.Г.и соавт., 1997) в экспериментах с добавлением к МРС ингибитора каталазы - NaCN показали, что уровень оксигемоглобина не изменяется.
Целью настоящего раздела явилось изучение влияния ионизированного (супероксидного Ог) кислорода на активность ферментов супероксиддисму-тазы, каталазы и глютатионредктазы, а также на процесс оксигенации гемоглобина.
Методы исследования
Для определения степени насыщаемости гемоглобина кислородом были использованы эритроциты свежей гепаринизированной донорской крови, из которой готовили гемолизаты путем добавления равных объемов дистиллированной воды. Полученный гемолизат центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин., а из супернатанта готовили рабочий раствор гемоглобина из такого рас-чета, чтобы его концентрация при спектрофотометрии на СФ-16 при X = 405 нм была в пределах 0,600-0,700 экстинкций, к которому предварительно добавляли калий-фосфатный буфер 0,1М с рН -7,4 (в соотношении 10:2). Буферный раствор обеспечивал оптимальное значение рН среды для действия собственных эритроцитарных ферментов, участвующих в реакции оксигенации гемоглобина.
Пробирки с содержимым вначале прогревали в водяном термостате при 35С и определяли исходную величину гемолизата при X, = 405-414 нм (дезок-си-Hb), при 540-548 нм (окси-Hb) и при 578 нм (мет-Hb). Затем через раствор гемолизата, пробирки с которым находились в водяном термостате, в течение 3-х минут пропускали струю СОг и вновь производили спектрофотомет-рию. Насыщение гемолизата СОг необходимо для более полного освобождения молекул гемоглобина от 02, известного в литературе, как эффект Кристиана Бора (Страйер Л., 1984).
После обработки гемолизата С02 его делили на две равные порции. Через содержимое первой пробирки пропускали струю воздуха, содержащего атмосферный кислород, а через гемолизат второй пробирки - воздух, содержащий ионизированный (супероксидный - 02 ) кислород. Эти опыты выполнялись в том же временном и температурном режиме, что и опыты с С02. В опытах с отрицательно заряженными аэроионами кислорода было использовано специально нами сконструированное: «Фокусирующее приспособление к ионизатору электроэффлювиального типа» Свид. на п/м РФ, № 16452, 2001,
с формулой: «Фокусирующее приспособление к ионизатору элекроэффлюви-алъного типа, содержащее генератор, излучатель ионов кислорода отрицательной полярности, отличающийся тем, что излучатель лампы заключен в камеру, причем камера имеет с противоположных сторон патрубки для обеспечения направленного движения ионов кислорода компрессором».
Это устройство позволяет собирать аэроионы, излучаемые от комнатного аэроионизатора Чижевского «Эльбрус-2», и направлять их в виде струи в пробирку с рабочим раствором (рис. 3.1.1).
Методы, использованные при изучении ингибирующих свойств лекарственных препаратов на активность ферментов антирадикальной защиты
Для проведения экспериментов по исследованию ингибирующих свойств медицинских препаратов, которые наиболее часто применяются для терапии беременных женщин с различными осложнениями, была использована гепаринизированная донорская кровь. Вначале путем центрифугирования отделяли плазму от эритроцитов (Эр), которые дважды отмывали в охлажденном изотоническом растворе. В полученной взвеси эритроцитов (ВЭр) определяли их количество при помощи микроколориметра МКМФ-1 (Сторо-жук П.Г., Сторожук А.П., 1991). Из взвеси Эр (с известным количеством) готовили гемолизаты на фосфатном буфере, которые затем были использованы для изучения ингибирующего действия лекарственных препаратов на активность ферментов, участвующих в генерации и утилизации АФК ( 02, (V, ОН" и Нг02). В настоящем разделе работы основное внимание уделено ферментам прямой антирадикальной защиты (супероксиддисмутазе, каталазе) и ферментам косвенной антирадикальной защиты, которые являются донорами водорода (НАД-, НАДФ- и ФАД-зависимым дегидрогеназам), необходимых для превращения POP в молекулярный кислород и воду. Для этих целей были выбраны следующие ферменты: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, сукцинат-дегидрогеназа, глютатионредуктаза, супероксиддисмутаза и каталаза.
Активность Г-6-ФДГ (1.1.1.49) определяли методом Motulsky A.G., Campbbell J.M.(1969). Принцип метода основан на определении количества восстановленного НАДФ, образующегося при окислении глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконолактон. По мере образования НАДФН, измеряемого на спектрофотометре при Я, = 340 или 366 нм, величина экстинкций возрастает. Активность фермента выражали в мкМ НАДФН/1х109Эр/мин.
Активность СДГ (1.3.99.1) определяли методом Кип Е., Abood G. (1949) в нашей модификации (Сторожук П.Г., Сторожук А.П., 1990). Метод основан на восстановлении нитротетразолия синего хлорида за счет сукцината натрия и превращения его в диформазан, количество которого определяли фотометрически на микроколориметре МКМФ-1 при X = 458 нм. Активность фермента выражали в мкМ диформазана на 1хЮ9Эр/мин.
Определение активности ГлР (1.6.4.2) производили методом, описанным Юсуповой Л.Б.(1989), который основан на способности фермента восстанавливать глютатион за счет окисления НАДФН. Уменьшение концентрации НАДФН в реакционной системе регистрировали на спектрофотометре СФ-16 при А, = 340 нм. Активность фермента выражали в мкМ НАДФ/1хЮ9Эр/мин.
Для определения активности СОД (1.15.1.1) была использована методика Nishkimi N. et all. (1972) в нашей модификации (Сторожук П.Г., Сторожук А.П., 1998). Метод основан на способности фермента конкурировать с нитро-синим тетразолем (НСТ) за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия НАДН и феназинметасульфата (ФМС). При этой реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразинтетразолия, ко-торй регистрируется на МКМФ-1 при Х.= 540 нм. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается. Активность фермента выражали в мкМ НСТ/1х109 Эр/мин.
Активность КА (1.11.1.6) определяли методом С.И.Крайнева (1966). Метод основан на способности фермента разлагать пероксид водорода на молекулярный кислород и воду. Остаток неразложившегося пероксида водорода определяют путем титрования 0,1 н. раствором КМп04, по которому судят об активности фермента. Об активности КА судили по количеству разложившихся мМ Н2О2-ІХІО9 Эр/мин. Преимуществом этого метода над другими методами является то, что он позволяет определять активность фермента не только в гемолизатах, но и в интактных эритроцитах, т.е. активность каталазы, локализованной в плазматических мембранах эритроцитов.
Для анестезиологического обеспечения в акушерстве используются обезболивающие и снотворные средства и мышечные релаксанты, действие которых на активность ферментов антирадикальной защиты изучено недостаточно. Поскольку мы считаем, что POP участвуют в инициации процессов оксигенации гемоглобина (Сторожук П.Г., Сторожук А.П., Быков И.М.,1997), то изучение этого вопроса имеет большое значение для практического здравоохранения, и, прежде всего, для акушерства. При оперативных способах родоразрешения действие этих препаратов отражается на газотранспортной функции эритроцитов не только матери, но и плода.
