Введение к работе
Актуальность темы. Анализ содержащихся в современной литературе сведений о регуляции метаболических процессов у различных организмов показал, что в настоящее время уделяется значительное внимание воздействию на ферменты таких природных биологически активных веществ, как аминокислоты. Аминокислоты способны проникать практически во все структуры живых клеток и осуществлять регуляцию активности ферментов на уровне транскрипции, трансляции, посттрансляционной модификации и метаболизма (Eisenstein, 1995; Tipper, Kaufman, 1992; Rishikof et al., 1998; Xu et al., 1998; Kuwahata et al., 1998; Deboer et al., 1998). Аминокислоты могут модулировать действие и стимулировать секрецию гомонов (Macdonald et al., 1991; Dongryul et al., 1997; Ushida et al., 1998). Большинство работ по влиянию аминокислот на ферменты выполнено в системе in vitro и посвящено, в основном, аллостерической регуляции их активности. Наиболее изучены в этом плане ферменты аминокислотного и белкового обмена, причем преимущественно у растений (Тюльпанова, Еременко, 1976; Евстигнеева и др., 1985; Расулов, 1990; Lee et al., 1998). Проводятся работы по исследованию воздействия аминокислот in vivo на разнообразные обменные процессы у животных и человека (Кричевская и др., 1983; Massillon et al., 1996; Bergamini et al., 1995). Имеются данные, хотя и весьма немногочисленные, о воздействии аминокислот на активность дегидрогеназ у разных объектов (Rosen-brough, 1996; Malik, Ahluwalia, 1994). С помощью аминокислот пытаются лечить некоторые нарушения обмена веществ у человека и животных (Dekoning et al., 1998; Lemosquet et al., 1997).
Исследования по влиянию аминокислот на ферменты насекомых крайне немногочисленны. Изучению подвергались в основном ферменты аминокислотного и белкового обмена, и соответствующие исследования проводились преимущественно in vitro (Горленко, Грошева, 1984; Агад-жанян, Арутюнян, 1974). В то же время известно, что концентрация свободных аминокислот в организме насекомых достигает значительно более высоких значений, чем у других животных (Филиппович и др., 1992), поэтому пул свободных аминокислот, несомненно, играет важную роль в адаптационных процессах у насекомых (Band, Band, 1987). Вполне естественным выглядит предположение о дифференцированном влиянии аминокислот на активность отдельных форм ферментов насекомых, однако работ, посвященных регуляции множественных форм ферментов при участии аминокислот, очень мало (Пиункова и др., 1999).
Исходя из выше изложенного, исследование воздействия аминокислот на активность и множественные формы дегидрогеназ, непосредственно не связанных с аминокислотным обменом, представляется весьма интересным с точки зрения расшифровки значения аминокислот в регуляции разнообразных метаболических процессов у хозяйственно ценных видов насекомых и насекомых-вредителей. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение роли протеиногённых аминокислот в регуляции активности а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и ма-латдегидрогеназы и их множественных форм в тканях и органах тутового шелкопряда и у гусениц большой вощинной моли, а также расшифровка возможных механизмов этой регуляции.
Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:
-
Исследовать влияние аминокислот на активность и множественные формы а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы и малатдешдрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда in vivo и in vitro.
-
Сопоставить влияние аминокислот на активность и множественные формы дегидрогеназ у тутового шелкопряда и одного из видов насекомых-вредителей - большой вощинной моли.
-
Изучить возможность воздействия аминокислот на транскрипцию и трансляцию отдельных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда с использованием соответствующих ингибиторов указанных процессов.
-
Выделить в индивидуальном состоянии и сопоставить физико-химические свойства присутствующей в норме (контрольной) формы одной из дегидрогеназ со свойствами форм, появляющихся в ответ на введение аминокислот, и проанализировать возможные механизмы их возникновения.
-
Исходя из сопоставления полученных данных, обсудить возможность регуляции метаболизма у насекомых аминокислотами. Научная новизна. Впервые исследовано влияние протеиногенных аш-нокислот на активность и множественные формы дегидрогеназ гусениц тутового шелкопряда и большой вощинной моли в опытах in vivo и in vitro. Показано, что воздействие аминокислот на эти ферменты видо- и тканеспецифично и зависит от времени экспозиции.
Установлена возможность воздействия отдельных аминокислот на процессы транскрипции и трансляции малатдешдрогеназы жирового тела тутового шелкопряда.
Разработана принципиально новая схема выделения и очистки НАД+-зависимой малатдегидрогеназы из жирового тела тутового шелкопряда, позволяющая достаточно быстро получить отдельные формы фермента в практически гомогенном состоянии.
Впервые охарактеризована одна из форм малатдегидрогеназы, появляющаяся в жировом теле тутового шелкопряда после инъекции аминокислот, выявлены различия в ее физико-химических параметрах по сравнению с формой, присутствующей в этой ткани в норме. Предложен возможный механизм образования высокоподвижной формы малатдегидрогеназы в результате ограниченного протеолиза исходной формы. Практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах регуляции ферментов липидного и углеводного обменов у насекомых. Анализ полученных данных показывает, что аминокислоты играют важную роль в регуляции окислительно-восстановительных процессов в различных тканях и органах насекомых, и экстремально высокий уровень их концентрации имеет большое адаптационное значение для представителей этого класса животных.
Установлено, что аминокислоты способны существенно влиять на процессы транскрипции и трансляции, уменьшать действие антибиотиков и оказывать антистрессовое воздействие на организм насекомых. Показана способность аминокислот осуществлять контроль экспрессии отдельных форм малатдегидрогеназы в жировом теле тутового шелкопряда.
Полученные данные о влиянии аминокислот на метаболизм насекомых позволяют рассматривать их в качестве возможных регуляторов жизнедеятельности хозяйственно ценного вида насекомых - тутового шелкопряда, а также насекомых-вредителей.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на 2-ом съезде биохимического общества РАН (Москва, май 1997 г.), IX съезде Русского энтомологического общества РАН «Проблемы энтомологии в России» (С.-Петербург, 1998), на конференции по итогам научно-исследовательской работы МПГУ (1997 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и тезисов научных сообщений.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о роли аминокислот в регуляции активности ферментов, описания материалов и методов исследования, результатов эксперимента и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 42 таблицы, 32 рисунка. Список цитируемой литературы включает 225 названий.
