Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Плазмиды Bacillus subtilis и других видов бацилл 8
1.1.1. Общая характеристика бациллярных плазмид 8
1.1.2. Свойства, определяемые генами мелких плазмид бацилл 9
1.1.3. Свойства, определяемые генами крупных плазмид бацилл 13
1.1.4. Репликация плазмид 17
1.1.4.1 Репликация по механизму катящегося кольца 17
1.1.4.2. Тета-тип репликации 18
1.2. Бактериальная конъюгация 24
1.2.1. Механизмы конъюгационных процессов у грамотрицательных микроорганизмов на примере F-фактора E.coli 24
1.2.2. Конъюгация у грамположительных микроорганизмов 28
1.2.2.1. Механизмы конъюгации у грамположительных бактерий 28
1.2.2.1.1. Структуры, вовлекаемые в процесс конъюгации 28
1.2.2.1.2. Сходство элементов конъюгативного аппарата с компонентами системы секреции IV типа 31
1.2.2.2. Конъюгативная мобилизация RCR плазмид 35
1.2.2.3. Конъюгативные транспозоны 37
1.2.2.4. Конъюгация у бацилл 39
1.2.2.4.1. Группа В. cereus 39
1.2.2.4.2. Группа В. subtilis 42
1.2.2.5. Конъюгация у других грамположительных микроорганизмов 44
1.2.2.5.1. Конъюгативиый перенос с участием плазмид широкого круга хозяев. Конъюгация у стафилококков, лактококков и других грамположительных микроорганизмов 44
1.2.2.5.2. Феромонзависимая конъюгация у энтерококков 46
1.2.2.5.3. Конъюгация у стрептомицетов 48
2. Материалы и методы 52
3. Результаты 60
3.1. Поиск и характеристика крупных природных плазмид в штаммах Bacillus subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области 60
3.1.1. Поиск крупных плазмид в штаммах B.subtilis .60
3.1.2. Сравнение обнаруженных крупных плазмид с минирепликоном плазмиды р19 из белорусской коллекции B.subtilis 66
3.1.3. Определение способности крупной плазмиды из штамма B.subtilis 1440 к мобилизационному переносу 66
3.2. Изучение конъюгативных способностей крупной плазмиды из почвенного штамма B.subtilis 19 67
3.2.1. Мобилизация мелких неконъюгативных плазмид 67
3.2.1.1. Изучение особенностей мобилизации pUBl 10 67
3.2.1.1.1. Определяющая роль р19 в мобилизации pUBllO 68
3.2.1.1.2. Изучение влияния протеиназы К на мобилизацию pUBllO 69
3.2.1.1.3. Кинетика переноса pUBllO при разных температурах 71
3.2.1.1.4. Мобилизационный перенос pUBllO при использовании различных штаммов B.subtilis 72
3.2.1.1.5. Перенос pUBllO в штаммы разных видов Bacillus 72
3.2.1.2. Мобилизация других неконъюгативных плазмид 73
3.2.1.2.1. Изучение переноса плазмид с сигма-типом репликации (рВСІб,
рС194) 74
3.2.1.2.2. Изучение переноса плазмиды, имеющей тета-репликон 74
3.2.2. Изучение конъюгативного переноса собственно крупной плазмиды р19 78
3.2.2.1. Маркирование крупной криптической плазмиды р19 78
3.2.2.2. Частота конъюгативного переноса плазмиды pl9cat 81
3.2.2.3. Коныогативный перенос pl9cat при разных соотношениях донора и реципиента 83
3.2.2.4. Кинетика конъюгативного переноса pl9cat 83
3.2.2.5. Особенности переноса р19 при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis ...85
3.2.3. Анализ мутантов р19 с нарушенной способностью к конъюгации...87
3.2.3.1. Клонирование в клетках E.coli фрагментов р19, обуславливающих способность плазмиды к конъюгационному переносу 87
3.2.3.2. Идентификация фрагмента ДНК, соответствующего рЗ-102, в клонотеке фрагментов ДНК р19 89
3.2.3.3. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК р19 и ее анализ 91
4. Обсуждение результатов 94
Выводы 102
Список литературы
- Плазмиды Bacillus subtilis и других видов бацилл
- Механизмы конъюгационных процессов у грамотрицательных микроорганизмов на примере F-фактора E.coli
- Поиск и характеристика крупных природных плазмид в штаммах Bacillus subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области
- Особенности переноса р19 при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis
Введение к работе
Изучение организации генома микроорганизмов предполагает комплексное исследование всех генетических детерминант, в том числе и внехромосомных генетических элементов.
Плазмиды часто несут гены, в определенных условиях дающие селективное преимущество содержащим их клеткам. Многие известные свойства бактерий могут определяться плазмидными генами: устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов, ультрафиолетовому облучению, синтез бактериоцинов и антибиотиков, способность к деградации органических и неорганических соединений или фиксации азота; плазмиды могут содержать острова патогенности с генами, определяющими вирулентность и синтез токсинов, или нести гены общего клеточного метаболизма. Плазмиды, несущие новую генетическую информацию, служат неиссякаемым источником изменчивости бактерий, активно участвуя в горизонтальном переносе генов. Роль горизонтального переноса генов в эволюции и экологии микроорганизмов трудно переоценить.
Конъюгация описана у многих видов бактерий и является, по-видимому, основным способом горизонтального переноса генов в природе. Возможен конъюгативный перенос плазмид между бактериями, принадлежащими к разным видам и родам. Конъ-югативная передача плазмид может происходить между представителями разных царств: классический пример - передача Т-ДНК Ті-плазмид Agrobacterium в клетки высших растений, возможен перенос между бактериями E.coli и дрожжами S.cerevisiae (Bates et al., 1998). Описана система, в которой плазмида передавалась в процессе конъюгации от E.coli к клеткам HeLa (Waters, 2001).
Широкое распространение определенных генов в результате горизонтального переноса, безусловно, оказывает заметное влияние и в области практической деятельности человека. Быстрое распространение устойчивости к антибиотикам за счет конъюгации создает серьезные проблемы для медицины, как и распространение генов, обуславливающих вирулентность и продукцию токсинов. С другой стороны, все большее внимание привлекает возможность использования обусловленной плазмидами способности бактерий к биодеградации веществ различного происхождения, а также способности продуцировать биологически активные вещества. Bacillus subtilis является вторым по значимости (после Е.соїї) объектом бактериальной генетики и физиологии и классической моделью при изучении грамположи-тельных микроорганизмов. В настоящее время это наиболее изученный вид грамполо-жительных бактерий. Для B.subtilis 168 была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Kunst et al., 1997). Особенности, выявленные в организации генома Bacillus subtilis, имеют существенное теоретическое и прикладное значение и позволяют рассматривать этот вид в качестве перспективного объекта генетической инженерии, способного конкурировать с классическим объектом E.coli. B.subtilis экологически безопасна: она исходно не патогенна, и организм человека не является для нее постоянным хозяином. Как и другие бациллы, B.subtilis секретирует белки в культуральную среду и служит важным промышленным объектом для получения различных ферментов. Одной из старейших областей применения B.subtilis является ферментация соевых бобов для получения "натто" (соевый сыр или творог) в японской пищевой промышленности. Бациллы применяются и в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных ДНК и продукции в их клетках ряда белков. Что немаловажно, бактерии B.subtilis не требовательны к условиям роста.
Лабораторный штамм B.subtilis 168 плазмид не содержит, до недавнего времени считалось, что основным способом горизонтального переноса генов у B.subtilis является трансформация. Хотя известно, что в природных штаммах B.subtilis встречаются крупные плазмиды, среди которых есть конъюгативные, конъюгация у этого вида микроорганизмов почти не изучена.
Целью работы являлось изучение особенностей конъюгации, осуществляемой крупными плазмидами природных штаммов Bacillus subtilis. В задачи исследования входило:
Поиск крупных плазмид в природных штаммах B.subtilis.
Изучение особенностей конъюгативной мобилизации мелких неконъюгативных плазмид, определяемой крупной плазмидой из природного штамма B.subtilis
Маркирование крупной конъюгативной плазмиды и изучение особенностей ее конъюгативного переноса, т.е. собственно конъюгации
Клонирование и секвенирование фрагментов ДНК конъюгативной плазмиды, содержащих гены, влияющие на процесс конъюгации.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Плазмиды Bacillus subtilis и других видов бацилл 1.1.1. Общая характеристика бациллярных плазмид
Бактерии рода Bacillus - аэробные, образующие эндоспоры, грамположительные палочки. Род Bacillus - это одна из наиболее разнообразных и коммерчески полезных групп микроорганизмов. Представители этого рода широко распространены в природе. Разнообразие метаболических процессов и низкая патогенность видов Bacillus послужили причиной широкого использования представителей этой группы в различных областях промышленности, а также в качестве объектов лабораторных исследований. В штаммах разных видов Bacillus довольно часто встречаются плазмиды. Они были обнаружены при исследовании бацилл многих видов, включая B.brevis (Dobritca et al., 1978), B.cereus (Bernhard et al., 1978; van Elsas, Pereira,1986), B.anthracis (Uchida et al.,1985; Uchida et al., 1986); B.licheniformis (Polak, Novick, 1982; Yoshimura et al., 1983; van Elsas, Pereira,1986; Parini et al., 1991), B.megaterium (Carlton, Helinski, 1969; Carlton, Smith, 1974; Yoshimura et al., 1983; van Tersch, Carlton, 1983), B.pumilus (Lovett, 1973; Lovett Bramucci,1975; Yoshimura et al., 1983), B.sphaericus (Polak, Novick, 1982; Yoshimura et al., 1983), B.stearothermofilus (Bingham et al.1979; Imanaka et al., 1981; Hoshino et al., 1985; de Rossi et al., 1989), B.circulans (Yoshimura et al., 1983), B.thuringiensis (Yoshimura et al., 1983; Baum, Gonzales, 1992; Andrup et al., 1994), B.amyloliquefaciens (Yoshimura et al., 1983), B.subtilis (Bernhard et al., 1978; van Elsas, Pereira,1986; Lovett, Bramucci, 1975; Polak, Novick, 1982; Tanaka, Koshikawa, 1977; Uozumi et al., 1980; Yoshimura et al., 1983; Полуэктова и др., 1996) и др.
В зависимости от вида природные штаммы, несущие плазмиды, могут составлять от 10 до 70%, а у B.thuringiensis почти 100% штаммов содержат плазмиды (Baum, Gonzalez, 1992). У B.subtilis плазмиды несут от 20 до 65% природных штаммов (Незаметдинова и др., 1992; Titok et al., 2003), хотя наиболее известный и изученный лабораторный штамм B.subtilis Marburg (или B.subtilis 168) плазмид не содержит (Kunst et al., 1997).
Плазмиды бацилл заметно различаются по молекулярной массе (от 1,1 МДа до 120 МДа) и размеру (от 1-2 тпн до 300 тпн). Нередко используют условное деление на мелкие плазмиды - до 10 тпн, и крупные - более 30 тпн. Именно такие плазмиды встречаются наиболее часто (Tanaka, Koshikawa, 1977; de Rossi et al., 1989; Parini et al., 1991; Baum, Gonzales, 1992).
Крупные и мелкие плазмиды отличаются по способу репликации. Подавляющее большинство мелких плазмид реплицируются по механизму катящегося кольца (rolling circle replication - RC). Крупные плазмиды используют так называемый тета-тип репликации, характерный и для репликации хромосомной ДНК (см. ниже).
В зависимости от размеров природные плазмиды представлены от 1-2 до 100-200 (рТНТ15 B.stearothermofilus) копий на клетку (Hoshino et al., 1985). Крупные плазмиды обычно представлены в клетке одной копией. Плазмиды до 10 тпн величиной, имеющие у бацилл в среднем 4-10 копий на хромосомный эквивалент, также считаются малокопий-ными. Копийность является важным фактором стабильности плазмиды. Как правило, многокопийные плазмиды гораздо менее стабильны, чем малокопийные.
Некоторые штаммы бацилл одновременно содержат несколько плазмид. У B.subtilis в одном штамме нередко сосуществуют две плазмиды разного размера и типа репликации. Одновременное присутствие в клетке двух мелких или двух крупных плазмид встречается реже. Сложный плазмидпый профиль характерен для B.thuringiensis: у некоторых штаммов на клетку приходится до 17 плазмид разного размера (от 2 до 250 тпн), что составляет 20-25% всей ДНК клетки (Lereclus et al., 1982). Большинство штаммов B.megaterium содержат более четырех разных плазмид (Vary, 1994; Stevenson et al., 1998).
1.1.2. Свойства, определяемые генами мелких плазмид бацилл
Большинство изученных бациллярных плазмид являются криптическими (не определяют заметных свойств бактериальной клетки), однако отдельные плазмиды из природных штаммов бацилл имеют селективные генетические маркеры.
В штаммах В. stearothermofilus были найдены плазмиды, гены которых определяют продукцию бактериоцинов: pSE410 (Stahl, 1991), рРЫО (М.м. 4,4 МДа) (Lovett et al., 1976). Показано, что плазмиды могут влиять на спорообразование клетки-хозяина (Lovett et al., 1973). В другой работе наличие плазмиды рІМІЗ (2,2 тпн) в клетках B.subtilis обеспечивало их нормальную споруляцию при низких и высоких температурах (30 и 40С) (Mahler, Halvorson, 1980).
Некоторые плазмиды несут гены устойчивости к антибиотикам. Несмотря на многочисленные исследования штаммов различных видов бацилл, целью которых был поиск новых плазмид, несущих детерминанты антибиотикоустойчивости, таких плазмид известно немного. Ряд штаммов бацилл, устойчивых к тетрациклину, выделили из почвы Полак и Новик (Polak, Novick, 1982). Резистентность к антибиотику обеспечивалась присутствием плазмид, сходных с рВС16 TcR (B.cereus) и рАВ124 TcR {В. stearothermofilus); размеры найденных плазмид находятся в пределах 4,6 - 5,0 тпн (Bemhard et al., 1978; Bingham et al., 1979). Из клеток термофильных бацилл была выделена TcR плазмида рТВ20 (4,6 тпн) (Imanaka et al., 1981), а также рТНТ15 (4,5 тпн), рТНТ9 (7,7 тпн), рТНТ22 (8,4 тпн) (Hoshino et al., 1985). По данным исследований все TcR плазмиды, выделенные из почвенных штаммов бацилл, несут один и тот же tef-ген с небольшими вариациями.
У двух плазмид термофильных бацилл была обнаружена детерминанта устойчивости к канамицину: рТВ19 (TcR, KmR) (Imanaka et al., 1981), и pTHNl (KmR) (Hoshino et al., 1985). При сравнении нуклеотидной последовательности ш/-генов рТВ19 и pUBHO (S. aureus) была найдена одиночная замена цитозина в pUBHO на аденин в рТВ19, karf-ген pTHNl был идентичен соответствующему гену pUBl 10 (Matsumura et al., 1984).
Единственный пример определяемой плазмидой устойчивости бацилл к эритромицину представляет мультикопийиая плазмида B.subtilis рІМІЗ (Mahler, Halvorson, 1980). ея/-ген рІМІЗ идентичен аналогичным генам стафилококковых плазмид рЕ194 и рЕ5 (Monodetal., 1986).
В последние годы была определена полная нуклеотидная последовательность ряда RC-плазмид бацилл, что позволило обнаружить у них новые гены (Meijer et al., 1998; Thorsted et al, 1999; Гагарина, 2002; Andrup et al., 2003).
У некоторых мелких криптических плазмид бацилл обнаружен ген sip, который может принимать участие в транспорте белков. При анализе нуклеотидной последовательности плазмид рТА1050 и рТА1040, выделенных из японских промышленных штаммов, обнаружены гены, гомологичные хромосомным sip-гепзм B.subtilis. Эти гены были названы sipP (signal peptidase of plasmid) (Meijer et al., 1995a). Перед обоими s/p-генами расположены открытые рамки считывания - т.н. orfl. Белки, кодируемые orfl, содержат предполагаемый сигнальный пептид, имеющий сайты-мишени для сигнальных пептидаз; вероятно, соответствующие белки являются секретируемыми. Однако, белки, кодируемые orfl, не были обнаружены и функции их не известны, orfl и sip-ren считываются как один транскрипт и, вероятно, объединены в один оперон. Плазмидные sipP-гены сходны друг с другом и с хромосомными sip-генами. Гены sipP проявляют функциональную активность, т.е. продуцируют пептидазы, способные отщеплять сигнальные пептиды некоторых белков-предшественников как в клетках B.subtilis, так и в клетках E.coli. Сигнальная пепти- даза SipP1015, кодируемая s/p-геном плазмиды рТА1015, способна быть функциональным эквивалентом хромосомных сигнальных пептидаз SipS и SipT (Bron et al., 1998; Tjalsma et al., 1999).
Ген hsp был найден на плазмиде pi414, выделенной из природного штамма B.subtilis', ген кодирует белок (16,7 кДа), сходный по аминокислотной последовательности с рядом белков микроорганизмов и растений (Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus horikohsii, плазмиды pER341 Streptococcus thermophilus, Arabidopsis thaliana и др.), являющихся белками стрессового ответа (Thorsted et al., 1999).
На плазмидах B.subtilis(natto) рТА1040, рТА1050 и рТАЮбО найдены orf, имеющие гомологию с хромосомными генами rap-семейства. Продукт хромосомного гарА (response regulator aspartat phosphatase protein A) - аспартатфосфатаза, действующая на фосфорили-рованный компонент регулятора ответа фосфотрансляционной системы (SpoOF- Р), задерживает наступление споруляции (Meijer et al., 1998; Perego et al., 1994). Гены, гомологичные хромосомньм rap-генам, были найдены и на крупной плазмиде B.subtilis pLS20 (Meijer et al., 1995; Meijer et al., 1998).
На З'-конце хромосомного гена гарА находится orf, кодирующая белок из 44 аминокислот, транскрибируется эта orf совместно с геном г ар А. Показано, что фосфатазная активность белка RapA негативно контролируется продуктом соответствующего маленького гена, который был назван phr (phosphatase regulator). На З'-концах плазмидных генов rap обнаружены небольшие orf названные по аналогии с хромосомными генами, phr. Плазмидные гены phr содержат участки ДНК, предположительно соответствующие сигнальным пептидам (Meijer et al., 1998). rap/phr, видимо, играют заметную роль в системе генетической регуляции у B.subtilis. Плазмидные rqp-гены, возможно, обеспечивают клетки дополнительным инструментом для контроля экспрессии систем генов и увеличивают адаптивные способности клетки в меняющихся условиях.
При помощи инсерционного мутагенеза было показано, что район par ABC плазмиды рТА1050 оказывает влияние на ее сегрегационную стабильность (Gleave et al., 1990). В этом районе расположены 3 orf предполагаемые продукты которых имеют сигнальные пептиды и, вероятно, являются секретируемыми белками. РагА имеет значительную гомологию с сериновой субтилизин-протеазой, а РагВ имеет трансмембранный домен. Функции этих белков неизвестны. Предполагается, что эти гены могут действовать как хорошо известные у других микроорганизмов постсегрегационные системы-киллеры, направленные против бактерий, лишившихся плазмид. В такой системе плазмида кодирует долгоживущий белок, летальный для клетки, и короткоживущий белок, блокирующий летальное действие первого. Третий белок может быть регуляторным. При потере плаз-миды короткоживущий белок быстро разрушается и долгоживущий вызывает гибель клетки (Meijer et al., 1998).
При исследовании мелких плазмид природных штаммов B.subtilis были обнаружены высокогомологичные гены, встречающиеся у всех (rep) или подавляющего большинства исследованных плазмид (mob, hsp). Универсальность гена mob можно связать с селективной ценностью для плазмид процесса их конъюгативного переноса между бактериальными штаммами (о mob-генах, локализованных на RC-плазмидах бацилл, см. раздел 1.2.2.2.). Ген hsp предположительно кодирует белок, имеющий функции шаперона; этот ген может играть определенную роль в выживании клеток, несущих плазмиду, при резком изменении температуры или других условий среды обитания. Гены rap, phr, sip встречались лишь у некоторых плазмид и имели значительно меньший процент перекрестной гомологии ДНК. Геи par был обнаружен только у рТА1050 (Гагарина, 2002).
Плазмиды имеют модульное (кассетное) строение. Данные о строении изученных на данный момент бациллярных плазмид хорошо укладываются в кассетную схему плазмид-ной организации (Novick, 1989; Thomas, 2000). Известно несколько кодирующих кассет. Кассета с последовательностью, обеспечивающей инициацию и контроль репликации лидирующей цепи, обязательно существует на плазмиде. Другие кассеты - с генами устойчивости к антибиотикам, с Mob/Pre областью ДНК, которая вовлекается в мобилизацию и межплазмидную рекомбинацию, и целым рядом других - могут на плазмиде отсутствовать. Вблизи генов устойчивости к антибиотикам на плазмидах часто расположена симметричная шпилечная структура. Такие структуры обнаружены вблизи капг-гена. на pUBl 10 и tef-гена на рВС16, эти плазмиды идентичны, за исключением маркерных генов устойчивости к антибиотикам. Плазмиды рІМІЗ и рЕ194 несут один и тот же маркерный ген, но сами плазмиды не гомологичны. На концах области гомологии также обнаружены симметричные шпилечные структуры, которые частично гомологичны подобной структуре у pUBl 10. По мнению ряда авторов, такие шпилечные структуры могут играть важную роль в межплазмидном обмене элементами-кассетами (Monod et al., 1986). Было показано, что плазмиды стафилококков состоят из кассет генов, способных к обмену (Projan, Novick, 1988). Как предполагают авторы, обмен кассетами может происходить посредством образования коинтегратов между двумя плазмидами по коротким повторам ДНК, с резольвацией по другим повторам.
1.1.3. Свойства, определяемые генами крупных плазмид бацилл
Крупные плазмиды бацилл изучены значительно хуже мелких. Наиболее изученные из них представлены в таблице 1. Некоторые крупные бациллярные плазмиды полностью секвенированы: pXOl (AF065404) и рХ02 (AF188935) B.anthracis; рВМ400 (AF142677) B.megaterium; рВС 10987 (АЕ017195), pE33L466 (СР000040), pE33L54 (СР000042), рВС218 и pBCXOl (AAEKO 1000000) B.cereus; pBtoxis (AL731825),pBT9727 (CP_000047), pAW63 (DQ025752) B. thuringiensis.
В большинстве случаев селективные маркеры расположены на мелких плазми-дах бацилл. Однако известен ряд крупных плазмид, определяющих важные функции бактериальной клетки.
Большое значение для медицинской и ветеринарной микробиологии имеет Bacillus anthracis, которая является возбудителем сибирской язвы - острого смертельного заболевания человека и животных. В последние годы этот вид бацилл привлекает повышенное внимание из-за возможного использования в качестве биологического оружия. Токсины B.anthracis, в основном, детерминируются плазмидными генами. Клетки этих бактерий содержат две крупные плазмиды, обе они полностью секвенированы (Okinaka et al., 1999а). На плазмиде pXOl (181,65 тпн) находится так называемый остров патогенности размером 44,8 тпн, который несет гены, кодирующие факторы патогенности: суа (фактор отека, edema factor, EF), lef (lethal factor, LF) и pagA (protective antigen, PA), регуляторные гены atxA (anthrax toxin activator) upagR (Leppla, 1982; Pezard et al., 1991; Dai et al., 1995; Okinaka et al., 1999b; Brossier et al., 2000). Также, в этой области был найден gerX оперон (gerXB, gerXA и gerXC) размером 3,6 тпн, необходимый для прорастания спор B.anthracis в клетках альвеолярных макрофагов при заражении (Guidi-Rontani et al.,1999).
Плазмида рХ02 (96,2 тпн) несет гены, необходимые для синтеза полисахарид-ной капсулы и ее деполимеризации (сарВ, сарС, сарА и dep) и регуляторные гены асрА, асрВ (anthrax capsule activator) (Uchida et al., 1993; Okinaka et al., 1999a; Makino et al., 1989). Было обнаружено, что регуляторный ген atxA плазмиды pXOl контролирует не только гены токсинов и синтеза капсулы, но и экспрессию ряда других генов обеих плазмид, а также некоторых хромосомных генов (Bourgogne et al, 2003; Mignot et al., 2003).
Таблица 1. Крупные плазмиды бацилл.
Крупные плазмиды B.anthracis сами не являются конъюгативными, но могут быть мобилизованы конъюгативными плазмидами В. thuringiensis, по крайней мере, между видами бацилл в пределах группы B.cereus (Battisti et al., 1985).
Недавно крупные плазмиды, сходные с pXOl, были обнаружены в штаммах B.cereus (Hoffmaster et al., 2004; Rasko et al, 2004; Pannucci et al., 2002). B.cereus относят к условно патогенным микроорганизмам; бактерии этого вида могут вызывать пищевые отравления, а, попадая в ослабленный организм, ряд довольно тяжелых заболеваний (эндофтальмит, эндокардит, пневмонию и др.). Неожиданно B.cereus была обнаружена в крови больного с симптомами, характерными для сибирской язвы. При исследовании этого изолята (B.cereus G9241) в клетках были обнаружены крупные плазмиды pBCXOl (191,11 тпн) и рВС218 (218,1 тпн). Обе они были секвенироваиы. Плазмида pBCXOl оказалась на 99,6% гомологична вирулентной плазмиде B.anthracis pXOl, включая все гены токсинов. Эта плазмида B.cereus кодирует весь комплекс сибиреязвенных токсинов: РА (по аминокислотному составу 99,7% идентичности), LF (99%), EF (96%), а также, регуляторные белки AtxA (100%) и PagR (98,6%).
Вторая плазмида, рВС218, кодирует 188 возможных ORF, среди которых тоже были обнаружены продукты генов, сходные с токсинами pXOl, например, с регулятором AtxA (76% идентичности по аминокислотному составу), РА (60%), LF (36%), однако генных продуктов, сходных с EF, найдено не было. Эта плазмида несет кластер генов биосинтеза полисахаридной капсулы, но они не гомологичны генам рХ02 (Hoffmaster et al., 2004).
Другой штамм B.cereus содержит крупную плазмиду рВС 10987 (208,4 тпн), сходную по генному составу и организации с pXOl (40% гомологии). Плазмида полностью секвенирована, содержит 242 гена, 65% белков имеют гомологов среди генных продуктов pXOl. Однако рВС 10987 не несет генов, гомологичных генам острова патогенности вирулентной плазмиды B.anthracis (Rasko et al., 2004).
В.thuringiensis широко используется в промышленной микробиологии из-за инсектицидных свойств дельта-эндотоксина, который синтезируется в клетках этого вида. Гены, детерминирующие токсинообразование, расположены, главным образом, на крупных плазмидах. У В. thuringiensis известно не менее 50 разных инсектицидных дельта(б)-эндотоксинов, кодируемых плазмидами от 60 до 300 тпн размером. Токси- ны убивают гусениц, личинок кровососущих двукрылых и личинок жуков, поражая эпителий кишечника. Синтез 6-эндотоксина происходит на ранних стадиях споруля-ции. Токсин образует крупные кристаллы, занимающие около трети объема клетки и может составлять до 30% общего клеточного белка. B.thuringiensis является главным из используемых биопестицидов; препараты спор этой бактерии распыляют в местах скопления вредных насекомых. Некоторые инсектицидные штаммы синтезируют термоустойчивый Р-экзотоксин, обладающий широким спектром активности. В связи с чрезвычайной токсичностью штаммы, продуцирующие р-экзотоксин, в промышленности для получения инсектицидных препаратов не используются (Aronson, 1986; Азизбекян, Смирнова, 1988; Hofte, Whiteley, 1989; Aronson, 1993). Ряд крупных плаз-мид B.thuringiensis обладает конъюгативпыми свойствами. Иногда конъюгативпые плазмиды одновременно несут и гены токсииообразования (рХ012 и рНТ73), но большинство из них не определяют заметных функций кроме способности к переносу (Battisti et al., 1985; Jensen et al., 1996; Reddy et al., 1987; Wilcks et al., 1998).
Один из штаммов B.thuringiensis subsp. israelensis токсичен для личинок комаров. Штамм несет целый ряд плазмид разного размера, в том числе четыре крупные. Одна из них, рХОІб (200 тпн), осуществляет конъюгативный перенос, сопровождаемый агрегацией клеток (определяет Agr+ - фенотип), другая, pBtoxis (128 тпн), кодирует инсектицидный токсин (Andrup et al., 1993; Jensen et al., 1995; Ben-Dov et al., 1999). Недавно pBtoxis была секвенирована; как оказалось, эта плазмида несет гены всех шести продуцируемых штаммом токсинов (Cry4Aa, Cry4Ba, CrylOAa, CryllAa, CytlAa, Cyt2Bd). Кроме того, были обнаружены гены, продукты которых, возможно, влияют на процессы споруляции хозяина, а также гены, предположительно участвующие в синтезе антибиотика. Из 125 возможных белков pBtoxis 17 сходны с предполагаемыми продуктами генов pXOl B.anthracis (Berry et al., 2002; Okinaka et al., 1999b).
Совсем недавно была определена полная нуклеотидная последовательность плазмиды pAW63 из B.thuringiensis kurstaki. Это первая конъюгативная плазмида Bacillus, которая была полностью секвенирована. На плазмиде размером 71,7 тпн было обнаружено 76 кодирующих последовательностей (coding sequence, CDS); 15 CDS, предположительно имеющих отношение к конъюгации, локализованы в области tra размером 42 тпн. На плазмиде обнаружен ряд мобильных элементов, два интрона II группы (B.th.Il, B.th.I2), встроенных в гены, важные для конъюгации (один из них предположительно кодирует релаксазу, второй - возможный coupling protein, см. раз- дел 1.2.2.1). Из 76 CDS pAW63 50 оказались сходны (48,8 -98,7% идентичности по аминокислотному составу) с CDS, найденными на рХ02 B.anthracis, а 49 - с CDS, кодируемыми плазмидой рВТ9727 B.thuringiensis subsp. konkukian (43,8-97,4%) (Van der Auwera et al., 2005).
В штаммах B.megaterium обнаружены плазмиды, определяющие продукцию ме-гацинов - рМВ309 (31 МДа), рМВИЗ (29 Мда) и оксетаноцина, нового антибиотика, активного против цитомегаловирусов (van Tersch, Carlton, 1983; Morita et al., 1999). Продукцию бактериоцина детерминирует и крупная плазмида B.stearothermofilus рВС7 (45 МДа) (Bernhard et al., 1978).
1.1.4. Репликация плазмид 1.1.4.1 Репликация по механизму катящегося кольца
Подавляющее большинство крупных плазмид бацилл криптические, для многих из них единственными известными свойствами до сих пор остаются репликация и способность к конъюгативному переносу ДНК. Потому эти свойства плазмид являются и наиболее изученными.
Известны два основных типа репликации: однонаправленная репликация по механизму катящегося кольца (RC или а-тип), используемая большинством изученных мелких плазмид, и одно- или двунаправленная репликация по тета(0)-механизму, характерная для хромосомной ДНК, известных крупных и некоторых мелких плазмид.
Механизм репликации RC-плазмид описан в нескольких обзорах (Novick, 1989; Gruss, Erlich, 1989; Janniere et al., 1993; del Solar et al., 1993; Khan, 1997; Novick, 1998; Титок, 2004; Khan, 2005). RC-плазмиды были изначально обнаружены у Staphylococcus aureus, а затем были описаны у большого числа других грамположительных (Bacillus subtilis, Clostridium butyricum, Lactococcus lactis, Streptococcus agalactiae и др.,) и гра-мотрицательньгх (Helicobacter pylori, Shigella sonnei.Bacteroides и др.) бактерий (Khan, 1997). RC-плазмиды, реплицирующиеся по т.н. механизму катящегося кольца, несут три основных элемента: ori (+), ген rep, кодирующий белок Rep, и ori (-). ori (+), или DSO (double-stranded origin), - последовательность нуклеотидов на т.н. (+)-цепи ДНК, которая узнается Rep-белком плазмиды, несет сайт инициации и терминации репликации ss-цепи ДНК. ori (-), SSO (single-stranded origin), отличная от оп (+) по структуре и локализации последовательность на (+)-цепи ДНК. ori (-) содержит сайт инициации конверсии ss-ДНК в двунитевую форму (ds-ДНК). В процессе конверсии принимают участие белки клетки-хозяина. Rep-белок кодируется плазмидой, обладает то-поизомеразной и лигазпой активностью, т.е. способен вносить одпопитевые разрывы и лигировать образующиеся свободные концы ДНК. Rep-белок узнает последовательности ori (+) и вносит однонитевой разрыв в строго специфичном сайте, расположенном внутри ori ^-последовательности, запуская процесс репликации. Rep-белок остается ковалентно связанным с 5'-концом разрезанной цепи посредством фосфотиро-зиновой связи, а на свободном З'-ОН-конце начинается синтез лидирующей (+)-цепи плазмидной ДНК.
Наращивающийся конец вытесняет 5'-конец, с которым связан Rep-белок. В вытеснении родительской цепи участвует фермент клетки-хозяина геликаза (Wang et al., 1992). Вытесняемая цепь пропускается через Rep-белок и в тот момент, когда фермент узнает терминирующую последовательность, он вносит второй разрез. Терминирующая последовательность перекрывается с ori ^-последовательностью, поэтому второй разрыв происходит точно в том же месте, что и первый. Затем Rep-белок ли-гирует концы вытесненной ss-ДНК, замыкая ее в мономерную кольцевую молекулу. В результате на данном этапе возникает двунитевая плазмидная молекула со вновь синтезированной (+)-цепыо и кольцевая молекула ss-ДНК. С помощью белковых факторов, кодируемых хромосомной ДНК, на ori (^-последовательности ss-ДНК происходит инициация синтеза запаздывающей нити ДНК, после завершения которого заканчивается один полный раунд репликации (рис.1).
1.1.4.2. Тета-тип репликации
Крупные плазмиды бацилл реплицируются по тета-механизму. Этот тип репликации получил свое название из-за того, что реплицирующаяся ДНК по форме напоминает греческую букву 9 (тета). Основное различие между 0- и RC-моделями репликации состоит в образовании RC-плазмидами промежуточных одноцепочечных ДНК (Janniere et al., 1990). Кроме того, для плазмид с 0-механизмом репликации характерно отсутствие гомологии между репликативными локусами этих плазмид и соответствующими локусами RC-плазмид.
Инициация репликации при использовании 0-типа может осуществляться разными способами. Для элонгации необходима ДНК-полимераза III и ряд других белков клетки-хозяина. Терминация репликации у некоторых плазмид детерминируется специфичным ДНК-белковым комплексом (del Solar et al., 1998).
В зависимости от типа инициации репликации, 0-плазмиды подразделяются на 6 групп (A-F). Эта классификация основана на трех характеристиках: участии в инициации репликации Rep-белка; наличии огіА-подобной структуры; зависимости репликации от ДНК-полимеразы I. Тета-реплицирующиеся плазмиды грамотрицатель-ных микроорганизмов изучены гораздо лучше крупных плазмид грамположительных бактерий; в таблице 2 представлены и те, и другие.
Таблица 2. Классификация тста-репликонов бактериальных плазмид. *- область ori А присутствует, но не является необходимой для репликации.
Класс А включает плазмиды, кодирующие Rep-белок и имеющие характерную организацию сайта инициации репликации (oriA). Обычно oriA содержит инвертированные повторы (IR), узнаваемые Rep-белком, один или несколько DnaA-боксов (участков ДНК, специфически взаимодействующих с DnaA-белком клетки-хозяина) и АТ-богатые районы. ДНК-полимераза I не является необходимой для репликации плазмид этого типа (рис. 2А). В группу А входят некоторые широко известные плазмиды E.coli (F, R6K, Rl), а также группа родственных плазмид из штаммов грамположительных микроорганизмов, например, плазмида Lactococcus lactis pWV02 (3,8 тпн), прототип одноименного семейства.
В недавней работе М.Титок с соавторами (Titok et al., 2003) описаны крупные плазмиды (90тпн) природных штаммов B.subtilis, которые, видимо, образуют новое семейство тета-репликонов группы А. Было показано, что репликация этих плазмид не зависит от ДНК-полимеразы I хозяина, но для инициации репликации необходим Rep-белок. Был секвенирован репликон плазмиды pBS72, обнаружены итероны и dnaA бокс. Гомологии с rep-областями ранее изученных плазмид в базе данных не обнаружено. По данным авторов, все исследованные ими крупные плазмиды из восьми штаммов белорусской коллекции B.subtilis имеют абсолютно идентичные области репликации (Titok et al., 2003; Лагодич и др., 2004).
Репликоны группы В не кодируют ферментов, необходимых для репликации и не имеют типичного огіА. Эти плазмиды используют репликативный аппарат клетки-хозяина. Их репликация инициируется процессингом транскрипта, синтезированного хромосомной РНК-полимеразой. Процессированный транскрипт используется как прай-мер для синтеза лидирующей цепи ДНК. К группе относятся плазмиды E.coli семейства ColEl.
Ряд родственных плазмид E.coli (СоШ2-семейство) представляет группу С. Плазмиды кодируют Rep-белок и нуждаются в хромосомной ДНК-полимеразе I. Как было обнаружено, в этой группе Rep-белки связываются с соответствующим ori, расположенным вниз по ходу транскрипции от rep-гена, и синтезируют уникальный РНК-праймер, который используется для инициации синтеза лидирующей цепи ДНК-полимеразой I.
Группу D образуют плазмиды грамположительных микроорганизмов, относящихся к обширному семейству pAMpi. Это плазмиды широкого круга хозяев, способные реплицироваться и в клетках B.subtilis. Плазмида Streptococcus faecalis pAMpi (26,5 тпн), кодирует Rep-белок и нуждается в ДНК-полимеразе I для инициации репликации. Хотя огіА-подобная структура находится на этой плазмиде недалеко от rep-гена, она не является необходимой для репликации. Праймером при репликации ДНК служит транскрипт, проходящий через ori в направлении репликации. В ходе репликации образуется промежуточная структура в виде D-петли (что характерно для репликации ДНК митохондрий эукариот) (рис.2Б). Кроме pAMpi, к группе относятся известные плазмиды р1Р501 (30 тпн) Str. agalactiae, pAW63 (70тпн) B.thuringiensis, рХ02 (96,2 тпн) B.anthracis и др. (Bru-and, Ehrlich, 1998; Janniere et al., 1993; del Solar et al, 1998; Wilcks et al., 1999; Tinsley et al., 2004).
К группе E относится плазмида pLS20 (55 тпн), выделенная из штамма IF03335 B.subtilis (natto) (Tanaka and Koshikawa, 1977). Плазмида не кодирует Rep-белок и репли- кация ее не нуждается в ДНК-полимеразе I. Область репликации pLS20 содержит элементы, типичные для огіА-подобной структуры: DnaA-боксы и АТ-богатый район с несовершенными повторами. Предположительно в качестве сайта инициации репликации у pLS20 могут служить либо IR4 с прилегающими промотороподобными структурами, либо IR1, расположенный в АТ-богатом районе (он "расплавляется" в первую очередь). И то, и другое имеет аналогию при репликации вирусов и фагов (Meijer et al., 1995b). В группу репликонов Е, кроме pLS20, входит небольшая плазмида B.thuringiensis рНТЮЗО (15 тпн) (Lereclus, Arantes, 1992).
Плазмида B.subtilis(natto) pLS32 (70тпн), выделенная японскими исследователями (Tanaka, Ogura, 1998), несет ген repN, детерминирующий белок инициации репликации, от действия ДНК-полимеразы I ее репликация не зависит. pLS32 относится к семейству pADl (группа F). pADl (60 тпн) - вирулентная конъюгативная плазмида, выделенная из клинического изолята Enterococcus feacalis, кодирует цитолизин, разрушающий эритроциты, один из бактериоцинов. Плазмида полностью секвенирована (Francia et al., 2001).
Вероятно, отдельную группу тета-репликонов образует недавно секвенированная вирулентная плазмида В.anthracis pXOl (181,65 тпн). Гомологии нуклеотидной последовательности pXOl с известными rep-генами или or і репликации крупных плазмид в базе данных обнаружено не было (Okinaka et al., 1999b). Совсем недавно были найдены плаз-миды B.cereus, имеющие высокую степень гомологии с pXOl (Hoffmaster et al., 2004; Rasko et al., 2004).
Плазмида B.stearothermofdus pTB19 (26,5 тпн, TcR, KmR) содержит 3 репликона, 2 из которых относятся к группе RC-плазмид (Imanaka et al., 1984; Oskam et al., 1991). Однако в природном изоляте RC-репликоны не функционируют: repB-ген, функционирующий в pRBHl, спонтанной KmR производной рТВ19, в родительской, природной плазмиде разорван. Другой RC-репликон не совершенен: он обладает лишь частью гер-гспа, поэтому тоже не может обеспечивать репликативную функцию. Третий репликон рТВ19, содержащий repA-ген, реплицируется по тета-механизму (Imanaka et al., 1986).
Два репликона, RC- и 6-типа, обнаружены и у плазмиды Str. agalactiae pIP501. Как и другие представители семейства pAMpi, эта плазмида имеет широкий круг хозяев, в том числе, реплицируется в клетках B.subtilis. RC-репликон рГР501 ингибирован элементами 0-системы репликации (Pujol et al., 1998).
Для терминации репликации хромосомы B.subtilis и E.coli необходимы два компонента: Тег-сайты (непалиндромная последовательность ДНК в 22 пн) и ДНК-связывающий белок (Tus у E.coli; RTP - Replication termination protein - у B.subtilis). У хромосомы E.coli имеется шесть Тег-сайтов. Три останавливают одну вилку, другие три -противоположную. У B.subtilis остановка репликации хромосомы осуществляется участками Тег (I-VI), связывающимися с белком RTP. Нуклеотидные последовательности Тег-сайтов B.subtilis и E.coli различны, RTP и Tus имеют частичную гомологию; у B.subtilis два димера RTP взаимодействуют с каждым Тег, а у E.coli - один.
У некоторых плазмид грамотрицательных микроорганизмов (R6K, Rl, R100, Р307) также были обнаружены Тег-сайты, имеющие гомологию с хромосомными Тег-сайтами и взаимодействующие с хромосомными Tus-белками. При изучении репликона pLS20 был обнаружен район Тег (18пн), частично гомологичный Тег-сайтам хромосомы B.subtilis. В опытах in vitro было показано, что с ним связывается RTP B.subtilis и что репликативная вилка на плазмиде, несущей Тег pLS20, при этом временно останавливается. Таким образом, этот участок ДНК - первый описанный Тег-участок у 0-плазмид грам-положительных микроорганизмов (Meijer et al., 1996).
днк- гираза Pol III ..а - о геликаза, SSB-белки гираза О Pol III p
РНК-пол име-раза
Рисі. Схема репликации по механизму катящегося кольца (RCR) (del Solar et al., 1998). Показаны белки, детерминируемые генами плазмид (Rep - белок) и хромосомы - геликаза, ДНК-полимераза III (Pol III), ДНК-полимераза I (Pol I), SSB-белки, ДНК-гираза, а также сайты инициации репликации ведущей (dso) и запаздывающей (sso) цепей плазмид-ной ДНК. Описание этапов, изображенных на рисунке, приведено в тексте.
денатурация , богатый район инициатор-ный протеин репликатив-ная вилка
РНК-полимерата
Терминатор РІІК-полимераіа С_5 «транскрипции или RepE
Присоединение RepE в области oriV
Формирование открытого комплекса
Транскрипция гер-гена продолжается в области nriV
РНК-полимераза вытесняет белок инициаии из открытого комплекса
5а Терминация транскрипции
56. Прекращение процесса транскрипции. Разрезание мРНК jf" ДІІК-полимерата I
РНКата или RepE "73^
ДНК-полимераіа I
6а. Разрезание мРНК SSB белки
7. Образование D-петли
Сайт остановки ДИК-полимераіьі I SSB белки
66 Временная остановка процесса репликации
Рис 2. Схема механизмов инициации тста-репликации плазмид грамположитель- ных микроорганизмов.
А. Инициация репликации, характерная для представителей группы А (семейство pWV02 Lactococcus) (Marians, 1992).
Б. Модель инициации репликации плазмиды рАМрі. Этапы 5-6 предположительно могут осуществляться двумя возможными механизмами, в результате которых образуется структура в виде D-петли (Le Chatelier et al., 2001)
1.2. Бактериальная конъюгация
1.2.1. Механизмы коныогационных процессов у грамотрицательных микроорганизмов на примере F-фактора E.coli
Бактериальная конъюгация - высокоспецифичный процесс, во время которого ДНК переносится из клеток донора в клетки реципиента с помощью мультипротеино-вого комплекса, называемого конъюгативным аппаратом. Для конъюгативного переноса ДНК необходим тесный контакт клеток-партнеров. Способность к конъюгации, как правило, связана с присутствием в клетке донора крупной конъюгативной плазми-ды или конъюгативного транспозона.
Конъюгация была впервые обнаружена и изучена у E.coli с участием "фактора фертильносте", или F-фактора, - так называемой половой, или конъюгативной, плаз-миды. На этой модели было проведено больше всего исследований. Все последующие работы с конъюгацией у разных бактерий (в том числе и у E.coli, где к конъюгации способны и другие крупные плазмиды) опирались на результаты экспериментов с F-фактором. Поэтому целесообразно кратко описать основные данные о конъюгацион-ном процессе, полученные более чем за полвека работы с E.coli и F-фактором, как базовую модель, чтобы затем сравнивать с ней то, что было значительно позже получено на других объектах, в том числе и на бациллах. Конъюгативный перенос ДНК у E.coli с помощью F-фактора описан в ряде обзоров (Firth et al., 1996; Wilkins, Bates, 1998; Frost et al., 1994; Lanka, Wilkins, 1995; Willets, Skurray, 1980; Zechner et al. 2000; Clewell, 1993). F-фактор - крупная кольцевая плазмида размером 100 тпн, в клетке представлена 1-2 копиями. Плазмида полностью секвенирована. На этой плазмиде различают следующие, наиболее существенные функциональные области: tra-область, занимающую около 34 тпн, гены которой, собранные в единый оперон, определяют конъюгативную функцию (transfer); т.н. лидирующую область, которая при конъюгации первой входит в клетку реципиента; три участка с генами, контролирующими репликацию: repFIA, repFIB, rep FIC; и три мобильных элемента: Тп 1000, IS2, IS3 (последний в двух копиях). Благодаря мобильным элементам, F-фактор может образовывать коинтеграты с другими плазмидами и с бактериальной хромосомой.
У грамотрицательных бактерий клеточная оболочка имеет сложное строение; она состоит из внешней (клеточная стенка) и внутренней (цитоплазматической) мембран,
Плазмиды Bacillus subtilis и других видов бацилл
Бактерии рода Bacillus - аэробные, образующие эндоспоры, грамположительные палочки. Род Bacillus - это одна из наиболее разнообразных и коммерчески полезных групп микроорганизмов. Представители этого рода широко распространены в природе. Разнообразие метаболических процессов и низкая патогенность видов Bacillus послужили причиной широкого использования представителей этой группы в различных областях промышленности, а также в качестве объектов лабораторных исследований. В штаммах разных видов Bacillus довольно часто встречаются плазмиды. Они были обнаружены при исследовании бацилл многих видов, включая B.brevis (Dobritca et al., 1978), B.cereus (Bernhard et al., 1978; van Elsas, Pereira,1986), B.anthracis (Uchida et al.,1985; Uchida et al., 1986); B.licheniformis (Polak, Novick, 1982; Yoshimura et al., 1983; van Elsas, Pereira,1986; Parini et al., 1991), B.megaterium (Carlton, Helinski, 1969; Carlton, Smith, 1974; Yoshimura et al., 1983; van Tersch, Carlton, 1983), B.pumilus (Lovett, 1973; Lovett Bramucci,1975; Yoshimura et al., 1983), B.sphaericus (Polak, Novick, 1982; Yoshimura et al., 1983), B.stearothermofilus (Bingham et al.1979; Imanaka et al., 1981; Hoshino et al., 1985; de Rossi et al., 1989), B.circulans (Yoshimura et al., 1983), B.thuringiensis (Yoshimura et al., 1983; Baum, Gonzales, 1992; Andrup et al., 1994), B.amyloliquefaciens (Yoshimura et al., 1983), B.subtilis (Bernhard et al., 1978; van Elsas, Pereira,1986; Lovett, Bramucci, 1975; Polak, Novick, 1982; Tanaka, Koshikawa, 1977; Uozumi et al., 1980; Yoshimura et al., 1983; Полуэктова и др., 1996) и др.
В зависимости от вида природные штаммы, несущие плазмиды, могут составлять от 10 до 70%, а у B.thuringiensis почти 100% штаммов содержат плазмиды (Baum, Gonzalez, 1992). У B.subtilis плазмиды несут от 20 до 65% природных штаммов (Незаметдинова и др., 1992; Titok et al., 2003), хотя наиболее известный и изученный лабораторный штамм B.subtilis Marburg (или B.subtilis 168) плазмид не содержит (Kunst et al., 1997).
Плазмиды бацилл заметно различаются по молекулярной массе (от 1,1 МДа до 120 МДа) и размеру (от 1-2 тпн до 300 тпн). Нередко используют условное деление на мелкие плазмиды - до 10 тпн, и крупные - более 30 тпн. Именно такие плазмиды встречаются наиболее часто (Tanaka, Koshikawa, 1977; de Rossi et al., 1989; Parini et al., 1991; Baum, Gonzales, 1992).
Крупные и мелкие плазмиды отличаются по способу репликации. Подавляющее большинство мелких плазмид реплицируются по механизму катящегося кольца (rolling circle replication - RC). Крупные плазмиды используют так называемый тета-тип репликации, характерный и для репликации хромосомной ДНК (см. ниже).
В зависимости от размеров природные плазмиды представлены от 1-2 до 100-200 (рТНТ15 B.stearothermofilus) копий на клетку (Hoshino et al., 1985). Крупные плазмиды обычно представлены в клетке одной копией. Плазмиды до 10 тпн величиной, имеющие у бацилл в среднем 4-10 копий на хромосомный эквивалент, также считаются малокопий-ными. Копийность является важным фактором стабильности плазмиды. Как правило, многокопийные плазмиды гораздо менее стабильны, чем малокопийные.
Некоторые штаммы бацилл одновременно содержат несколько плазмид. У B.subtilis в одном штамме нередко сосуществуют две плазмиды разного размера и типа репликации. Одновременное присутствие в клетке двух мелких или двух крупных плазмид встречается реже. Сложный плазмидпый профиль характерен для B.thuringiensis: у некоторых штаммов на клетку приходится до 17 плазмид разного размера (от 2 до 250 тпн), что составляет 20-25% всей ДНК клетки (Lereclus et al., 1982). Большинство штаммов B.megaterium содержат более четырех разных плазмид (Vary, 1994; Stevenson et al., 1998).
Большинство изученных бациллярных плазмид являются криптическими (не определяют заметных свойств бактериальной клетки), однако отдельные плазмиды из природных штаммов бацилл имеют селективные генетические маркеры.
В штаммах В. stearothermofilus были найдены плазмиды, гены которых определяют продукцию бактериоцинов: pSE410 (Stahl, 1991), рРЫО (М.м. 4,4 МДа) (Lovett et al., 1976). Показано, что плазмиды могут влиять на спорообразование клетки-хозяина (Lovett et al., 1973). В другой работе наличие плазмиды рІМІЗ (2,2 тпн) в клетках B.subtilis обеспечивало их нормальную споруляцию при низких и высоких температурах (30 и 40С) (Mahler, Halvorson, 1980).
Некоторые плазмиды несут гены устойчивости к антибиотикам. Несмотря на многочисленные исследования штаммов различных видов бацилл, целью которых был поиск новых плазмид, несущих детерминанты антибиотикоустойчивости, таких плазмид известно немного. Ряд штаммов бацилл, устойчивых к тетрациклину, выделили из почвы Полак и Новик (Polak, Novick, 1982). Резистентность к антибиотику обеспечивалась присутствием плазмид, сходных с рВС16 TcR (B.cereus) и рАВ124 TcR {В. stearothermofilus); размеры найденных плазмид находятся в пределах 4,6 - 5,0 тпн (Bemhard et al., 1978; Bingham et al., 1979). Из клеток термофильных бацилл была выделена TcR плазмида рТВ20 (4,6 тпн) (Imanaka et al., 1981), а также рТНТ15 (4,5 тпн), рТНТ9 (7,7 тпн), рТНТ22 (8,4 тпн) (Hoshino et al., 1985). По данным исследований все TcR плазмиды, выделенные из почвенных штаммов бацилл, несут один и тот же tef-ген с небольшими вариациями.
У двух плазмид термофильных бацилл была обнаружена детерминанта устойчивости к канамицину: рТВ19 (TcR, KmR) (Imanaka et al., 1981), и pTHNl (KmR) (Hoshino et al., 1985). При сравнении нуклеотидной последовательности ш/-генов рТВ19 и pUBHO (S. aureus) была найдена одиночная замена цитозина в pUBHO на аденин в рТВ19, karf-ген pTHNl был идентичен соответствующему гену pUBl 10 (Matsumura et al., 1984).
Единственный пример определяемой плазмидой устойчивости бацилл к эритромицину представляет мультикопийиая плазмида B.subtilis рІМІЗ (Mahler, Halvorson, 1980). ея/-ген рІМІЗ идентичен аналогичным генам стафилококковых плазмид рЕ194 и рЕ5 (Monodetal., 1986).
В последние годы была определена полная нуклеотидная последовательность ряда RC-плазмид бацилл, что позволило обнаружить у них новые гены (Meijer et al., 1998; Thorsted et al, 1999; Гагарина, 2002; Andrup et al., 2003).
У некоторых мелких криптических плазмид бацилл обнаружен ген sip, который может принимать участие в транспорте белков. При анализе нуклеотидной последовательности плазмид рТА1050 и рТА1040, выделенных из японских промышленных штаммов, обнаружены гены, гомологичные хромосомным sip-гепзм B.subtilis. Эти гены были названы sipP (signal peptidase of plasmid) (Meijer et al., 1995a). Перед обоими s/p-генами расположены открытые рамки считывания - т.н. orfl. Белки, кодируемые orfl, содержат предполагаемый сигнальный пептид, имеющий сайты-мишени для сигнальных пептидаз; вероятно, соответствующие белки являются секретируемыми. Однако, белки, кодируемые orfl, не были обнаружены и функции их не известны, orfl и sip-ren считываются как один транскрипт и, вероятно, объединены в один оперон. Плазмидные sipP-гены сходны друг с другом и с хромосомными sip-генами.
Механизмы конъюгационных процессов у грамотрицательных микроорганизмов на примере F-фактора E.coli
Бактериальная конъюгация - высокоспецифичный процесс, во время которого ДНК переносится из клеток донора в клетки реципиента с помощью мультипротеино-вого комплекса, называемого конъюгативным аппаратом. Для конъюгативного переноса ДНК необходим тесный контакт клеток-партнеров. Способность к конъюгации, как правило, связана с присутствием в клетке донора крупной конъюгативной плазми-ды или конъюгативного транспозона.
Конъюгация была впервые обнаружена и изучена у E.coli с участием "фактора фертильносте", или F-фактора, - так называемой половой, или конъюгативной, плаз-миды. На этой модели было проведено больше всего исследований. Все последующие работы с конъюгацией у разных бактерий (в том числе и у E.coli, где к конъюгации способны и другие крупные плазмиды) опирались на результаты экспериментов с F-фактором. Поэтому целесообразно кратко описать основные данные о конъюгацион-ном процессе, полученные более чем за полвека работы с E.coli и F-фактором, как базовую модель, чтобы затем сравнивать с ней то, что было значительно позже получено на других объектах, в том числе и на бациллах. Конъюгативный перенос ДНК у E.coli с помощью F-фактора описан в ряде обзоров (Firth et al., 1996; Wilkins, Bates, 1998; Frost et al., 1994; Lanka, Wilkins, 1995; Willets, Skurray, 1980; Zechner et al. 2000; Clewell, 1993).
F-фактор - крупная кольцевая плазмида размером 100 тпн, в клетке представлена 1-2 копиями. Плазмида полностью секвенирована. На этой плазмиде различают следующие, наиболее существенные функциональные области: tra-область, занимающую около 34 тпн, гены которой, собранные в единый оперон, определяют конъюгативную функцию (transfer); т.н. лидирующую область, которая при конъюгации первой входит в клетку реципиента; три участка с генами, контролирующими репликацию: repFIA, repFIB, rep FIC; и три мобильных элемента: Тп 1000, IS2, IS3 (последний в двух копиях). Благодаря мобильным элементам, F-фактор может образовывать коинтеграты с другими плазмидами и с бактериальной хромосомой.
У грамотрицательных бактерий клеточная оболочка имеет сложное строение; она состоит из внешней (клеточная стенка) и внутренней (цитоплазматической) мембран, разделенных периплазматическим пространством. Чтобы макромолекулы (белок или ДНК) могли преодолеть этот барьер, необходим канал, проходящий сквозь все эти оболочки.
Согласно современной модели, к конъюгативному аппарату относятся два белковых комплекса: релаксосома и mpf-комплекс (mating-pair formation), каждый из которых взаимодействует с так называемым "объединяющим" ("соединительным") белком (coupling protein, СР). Релаксосома - сложный ДНК-белковый комплекс, который образуется в области oriT (участок начала переноса плазмиды). В комплекс входят белки, кодируемые генами как плазмиды, так и хромосомы хозяина. Мультипротеиновый mpf-комплекс ответственен за образование межклеточного контакта, формирование конъюгативного канала и собственно перенос ДНК в клетку реципиента. В его состав входят белки, кодируемые плазмидой.
Конъюгация начинается с взаимодействия клеток донора и реципиента. Для конъюгативного переноса ДНК необходим тесный контакт клеток-партнеров. У гра-мотрицательных микроорганизмов такой контакт обеспечивается с помощью половых ворсинок или половых пилей.
Половые ворсинки, присущие клеткам, несущим F-фактор, - гибкие структуры, имеющие размер около 20 мкм (т.е. в несколько раз длиннее самой клетки). Они представляют собой полый цилиндр (диаметр самого цилиндра - 80 А, диаметр полости -20 А), и состоят из субъединиц белка пилина, уложенных винтообразно. Обычно на клетку приходится 1-2 ворсинки. Длинные и гибкие пили F-фактора обеспечивают контакт конъюгирующих клеток в жидкой среде. Синтез ворсинки определяется генами, расположенными в области tra F-фактора. Из 36 генов tra-области 17 имеют отношение к образованию mpf-комплекса: синтезу пилей и стабилизации контакта клеток-партнеров. Контакт кончика ворсинки с рецепторами поверхности клетки-реципиента является сигналом к сокращению ворсинки и началу остальной цепи событий. Клетки сближаются, образуя комплексы, в которые могут входить от 2 до 50 клеток.
Как многие другие конъюгативные плазмиды, F-фактор несет гены, определяющие явление поверхностного исключения (surface exclusion). Экспрессия этих генов предотвращает контакт с бактериями, несущими ту же или родственную плазмиду, что и клетка донора. Это явление может иметь большое значение, т.к. предотвращает затраты энергии на осуществление конъюгационного процесса между клетками, уже несущими одинаковые плазмиды, и возможную потерю резидентной плазмиды из-за присутствия родственного элемента той же группы несовместимости. В tra-области F фактора есть, по крайней мере, два гена, имеющих отношение к поверхностному исключению. Один из них, tra Т, определяет синтез белка, входящего в состав клеточной стенки; другой, tra S, - белка, находящегося в цитоплазматической мембране. Эти белки имеют отношение к образованию стабильных агрегатов клеток и, возможно, к переносу ДНК при контакте клеток донора и реципиента. При контакте двух клеток, несущих одинаковые плазмиды, они мешают образованию агрегатов; мутации генов tra Т и tra S увеличивают частоту возникновения агрегатов среди таких клеток.
Второй этап конъюгации - образование ДНК-белкового комплекса, т.н. релаксо-сомы, разрыв одной нити ДНК плазмиды и расплетение двойной суперскрученной спирали ДНК. В формировании релаксосомы принимает участие, прежде всего, фермент релаксаза, образование которой у F-фактора детерминирует ген /гаї, а также белки с эндонуклеолитическими свойствами. Релаксаза катализирует разрыв фосфоди-эфирной связи специфичного динуклеотида (nick-сайт), расположенного внутри области oriT. Подобная реакция происходит и при инициации репликации по механизму катящегося кольца, свойственной многим мелким плазмидам грамположительных и гра-мотрицательных микроорганизмов, а также фагам. После внесения разрыва релаксаза ковалентно связывается с 5 -концом разрезанной цепи.
Затем начинается собственно перенос 5 -конца одноцепочечной ДНК плазмиды в клетку реципиента - третий этап конъюгации (рис.3). Процесс переноса осуществляется за счет энергии, освобождаемой при гидролизе АТФ. Считается, что важная роль в продвижении нити ДНК принадлежит белку Tra D (продукту гена tra D), локализованному в цитоплазматической мембране в участке образования поры (эти белки имеют N-терминальный трансмембранный домен и С-терминальный цитоплазматический домен) (Lee et al., 1999). Белки, сходные с Tra D, называют "объединяющими белками" (coupling proteins); предположительно, они являются посредниками между релаксосомой и mpf-комплексом. Их взаимодействие с релаксосомой описано для многих видов бактерий (Szpirer et al., 2000). Недавно было показано взаимодействие СР как с релаксосомой, так и с компонентами mpf-комплекса (Llosa et al., 2003).
Поиск и характеристика крупных природных плазмид в штаммах Bacillus subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области
Начальным этапом исследования был поиск крупных плазмид в природных штаммах B.subtilis. Для этой цели использовалась лабораторная коллекция штаммов B.subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области Ю.Е.Козловским. Критериями отбора штаммов служили способность к спорообразованию, морфология колоний, чувствительность к фагам B.subtilis AR1, AR3, AR9, SPOl, ф105 и способность ДНК штаммов трансформировать компетентные клетки эталонного штамма B.subtilis 168 (Козловский, Прозоров, 1981).
На наличие крупных плазмид было проверено 42 штамма коллекции, в девяти из них были обнаружены плазмиды размером более 35 тпн. Пять штаммов содержали одну крупную плазмиду, другие, кроме крупной, несли также мелкую плазмиду размером 6-8 тпн. (табл. 5; рис.бА, 7А - приведены электрофореграммы плазмидной ДНК московских, ряда белорусских штаммов и штаммов B.subtilis (natto) из японской коллекции).
По сумме длин рестриктпых фрагментов был определен размер крупной плазмиды из штамма 544. Плазмида р544 была обработана эндопуклеазами рестрикции Cla I, Hind IIIи Крп /(рис.8, табл.6). Размер р544 по сумме фрагментов составил 65,1 тпн.
А - результаты электрофореза препаратов плазмидной ДНК; Б - результаты их гибридизации с rep-районом р19. К - крупные плазмиды, М - мелкие плазмиды. 1 - B.subtilis 168 BD170 (лабораторный бесплазмидный штамм); дорожки 2-8 соответствуют штаммам BS15; BS8; BS57; BSN1; BS2; BS4; 19 (штаммы из белорусской коллекции); 9 - 544; 10 - 1899 (штаммы из московской коллекции); 11 - B.subtilis (natto) IAM 1076 (pTA1020L pTA X) (японская коллекция промышленных штаммов). Часто плазмиды существуют в нескольких подформах, которые имеют разную подвижность при электрофорезе, поэтому на электрофореграмме одной плазмиде может соответствовать несколько полос.
Для дальнейшей характеристики изучаемых плазмид проводился поиск возможной гомологии с крупными плазмидами, найденными в почвенных штаммах из белорусской коллекции.
С этой целью была проведена блот-гибридизация по Саузерну, в которой в качестве зонда использовался клонированный мини-репликон - соі?/-фрагмент плазмиды pMTLBS19, содержащий rep-область - крупной плазмиды р19. Данный зонд гибридизо-вался со всеми крупными плазмидами из штаммов B.subtilis белорусской коллекции (Titok, 2003) (рис.6 Б, 7 Б).
Ни одна из проверенных плазмид нашей коллекции или плазмид из японской коллекции промышленных штаммов B.subtilis (natto) (pLS20, крупная плазмида рТА X из штамма B.subtilis (natto) IAM 1076) положительного сигнала с использованным зондом не показала (рис.6 Б, 7 Б).
В природный штамм B.subtilis 1440, несущий крупную плазмиду, вводилась с помощью трансформации протопластов мелкая неконъюгативная плазмида S.aureus pUBHO, имеющая маркер устойчивости к канамицину (рис.9). Полученный таким образом штамм 1440 (р1440 pUBHO) был использован в качестве донора при конъюгации. Реципиентом служил бесплазмидный лабораторный штамм B.subtilis 168 Marburg (BD170 CmR). При скрещивании в жидкой среде трансконъюгантов, устойчивых к обоим антибиотикам, получить не удалось. Таким образом, крупная плазмида р1440 оказалась не способна к конъюгативному переносу pUBHO, по крайней мере, в данных условиях.
Можно констатировать, что в природных штаммах B.subtilis из московской коллекции крупные плазмиды встречаются достаточно часто (крупные плазмиды обнаружены у 21% исследованных штаммов). Области репликации девяти крупных плазмид, обнаруженных в штаммах этой коллекции, не гомологичны, по данным ДНК-ДНК гибридизации, областям репликации крупных плазмид из штаммов белорусской коллекции. До недавнего времени мы не могли связать какие-либо свойства штаммов B.subtilis мое ковской и белорусской коллекций с наличием в их клетках крупных плазмид. Исключением являлась плазмида р19 из белорусской коллекции.
Как было обнаружено в лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен, крупная плазмида из штамма B.subtilis 19 обладает способностью к конъюгативной мобилизации с высокой частотой, как на твердой, так и в жидкой среде, в отличие от других известных плазмид B.subtilis (Лотарева и др., 2001). Эта особенность делает штамм B.subtilis 19 исключительно удобной моделью для исследования процесса конъюгации у данного микроорганизма. Поэтому следующая часть работы была посвящена изучению процессов конъюгации и мобилизации плазмид у штамма B.subtilis 19.
Штамм B.subtilis 19, выделенный из лесной почвы на территории Белоруссии, содержит две природные плазмиды: крупную плазмиду р19 с тета-типом репликации и мелкую pV, реплицирующуюся по сигма-типу (Titok, 2003). Размер р19 по сумме длин рестриктных фрагментов составляет 95 тпн (данные Незаметдиновой), pV - 8,5 тпн (Гагарина, 2002), обе плазмиды криптические. Были получены производные штамма B.subtilis 19, лишенные pV (получен Незаметдиновой спонтанно) или р19 (получен при выращивании штамма на средах, содержащих высокие концентрации канамицина, см. ниже). Получить производные данного штамма, полностью лишенные плазмид, нам не удалось.
Особенности переноса р19 при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis
Как упоминалось выше, pl9cat могла передаваться в ходе конъюгации с частотой до 100% при использовании в качестве партнеров штаммов 19 (pl9cat pV pUBl 10) и 19 (pV) StrR (табл.13, скрещивания 1, 2). Когда же в качестве реципиента использовался лабораторный штамм B.subtilis 168 39-22 StrR, частота переноса pl9cat была более чем на два порядка ниже (табл.13, скрещивание 3). Возможно, у штаммов B.subtilis 19 и 168 различные системы рестрикции-модификации. Чтобы проверить это предположение, были поставлены опыты, где реципиентом был штамм 168 RM 125, лишенный системы рестрикции-модификации RI. Частота конъюгативного переноса pl9cat в таких скрещиваниях достигала 25% (табл.13, скрещивание 4).
Штамм B.subtilis 168, получивший pl9cat, также оказался способен быть донором (табл.13, скрещивание 5), хотя и с невысокой эффективностью. В скрещиваниях, где в качестве реципиента был взят вариант лабораторного штамма ригВб metB5 thr5 EmR, pl9cat передавалась клеткам с частотой около 3x10" .
У ряда бактерий существует феномен поверхностного исключения, которое снижает эффективность конъюгации клеток, содержащих одинаковые крупные плазмиды (Firth et al., 1996; Clewell, 1993; Andrup et al., 1996). Чтобы проверить, есть ли подобное явление у B.subtilis, были поставлены опыты, в которых донором был штамм B.subtilis 19 (p\9cat pV pUBHO), а реципиентом - B.subtilis 19 (pi9). Результаты приведены в таблице 13 (скрещивание 6). Частота переноса pl9cat снижалась в 20 раз по сравнению со скрещиваниями, где реципиент был лишен крупной плазмиды (табл.13, скрещивания 1,2).
Таким образом, частота конъюгативного переноса pl9cat существенно зависит от того, какие штаммы используются в качестве доноров и реципиентов.
Как было упомянуто в разделе 3.2.2.1., мы получили 28 клонов B.subtilis 19 (р19::рЗ), несущих крупную плазмиду со встроенным геном cat, и неспособных быть донорами при конъюгации, (табл. 10). Мы предприняли попытку использовать эти клоны для идентификации генов р19, определяющих способность плазмиды к конъюгаци-онному переносу.
Для этого на первом этапе плазмидная ДНК из клонов B.subtilis 19 (р19::рЗ), не способных к конъюгации, подвергалась обработке ферментом Cla I с последующим ли-гированием и трансформацией клеток E.coli DH5(a) гее А . Селекция велась по маркерам ApR CmR. На плазмиде рЗ нет сайтов узнавания Cla І; р19 содержит 17 таких сайтов (рис.16). Если плазмиды р19::рЗ возникли так, как указано на рис.16 А, то мы ожидали получить в клетках Е.соН гибридные плазмиды, состоящие из рЗ и прилежащего фрагмента ДНК р19. Предполагалось, что клонированные фрагменты р19 должны содержать ген(ы), повреждение которых приводит к неспособности плазмид р19::рЗ осуществлять конъюгацию. Таким образом мы надеялись клонировать в клетках E.coli гены р19, необходимые для конъюгационного процесса.
Такому анализу были подвергнуты 10 клонов B.subtilis 19 (р19::рЗ), неспособных к конъюгации (табл.14). Для трех из них получить трансформанты в клетках E.coli не удалось; причинами этого могут быть либо слишком большой размер Cla I фрагментов плазмиды р19, прилежащих к участкам интеграции рЗ, либо перестройки рЗ в составе р19, приведшие к потере участков, обуславливающих автономную репликацию рЗ. В двух случаях плазмиды, выделенные из клеток E.coli, несли один EcoR I сайт вместо минимум двух предполагаемых. Вероятно, в этих плазмидах произошли перестройки, затронувшие участки соединения рЗ и р19. Эти плазмиды далее не рассматривались. Для четырех клонов B.subtilis 19 (р19::рЗ) мы получили в клетках E.coli плазмиды одинакового типа: размер плазмид составлял 16,8 тпн, при EcoR /рестрикции они давали, кроме вектора рЗ (3,8 тпн), два фрагмента, соответствующие ДНК р19, величиной 7,6 и 5,4 тпн. Эти плазмиды были названы рЗ-13, рЗ-15, рЗ-182, рЗ-19; далее мы работали с одной из них - рЗ-182. Для одного из клонов B.subtilis 19 (р19::рЗ) в клетках E.coli была получена гибридная плазмида величиной 5,8 тпн, которая при EcoR I рестрикции давала два фрагмента: вектор рЗ (3,8 тпн) и фрагмент р19 (2,0 тпн). Плазмида была названа рЗ-102. Гибридные плазмиды 16,8 тпн и 5,8 тпн имели по одному Cla I сайту рестрикции. Анализ клонов B.subtilis 19 (р19::рЗ) CmR был проведен совместно с В.З. Незаметдиновой.
