Введение к работе
Актуальность темы
Настоящая работа посвящена изучению роли сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis. Изучение генетической регуляции пуринового метаболизма направлено на обнаружение молекулярных механизмов, открывающих новые возможности управления генетическими и метаболическими процессами организмов. Конечные продукты (AMP и GMP), а также их предшественники и производные, являются не только компонентами нуклеиновых кислот и энергетическими переносчиками, но и выполняют не менее важные функции глобальных регуляторов общего метаболизма. Традиционные способы производства пуринов основаны на их микробиологическом синтезе, который осуществляется генетически модифицированными штаммами - продуцентами. Создание нового поколения высокопродуктивных штаммов требует углубленного понимания процессов генетической регуляции пуринового метаболизма, что является одной из задач настоящего исследования. Объектом исследования избран Bacillus subtilis, микроорганизм, который традиционно служит не только моделью для выявления новых механизмов регуляции биосинтеза пуринов, но и основой для конструирования промышленных продуцентов.
Пуриновый оперон В. subtilis purEKBCSQLFMNHD (далее - pw-оперон) кодирует ферменты синтеза de novo инозинмонофосфата, общего предшественника пуриновых нуклеотидов AMP и GMP. Известно, что гены пуринового метаболизма у В. subtilis подвержены множественной регуляции на уровне инициации и терминации транскрипции. В случае двух оперонов: риг-оперона и xpt-pbuX, кодирующего синтез ксантинфосфорибозилтрансферазы, показано, что их экспрессия регулируется как на уровне инициации транскрипции с участием белка-репрессора PurR, так и на уровне терминации транскрипции. На модели этих оперонов был обнаружен необычный метаболит-зависимый механизм аттенуации транскрипции: при добавлении в ростовую среду оснований гипоксантина и гуанина их транскрипция терминируется перед первыми структурными генами, тогда как в их отсутствии транскрибируется полный оперон. Как выяснилось позднее, влияние пуринов на процесс терминации транскрипции осуществляется посредством нового механизма регуляции активности генов с участием так называемых сенсорных РНК, который был впервые обнаружен в лаборатории биохимической генетики ФГУП ГосНИИгенетика на модели рибофлавинового и тиаминового оперонов у В. subtilis. Такие сенсорные РНК, расположенные в лидерной области мРНК бактериальных оперонов, получили наименование «рибопереключателей» (riboswitch), так как в результате прямого взаимодействия со специфическим метаболитом они способны модулировать экспрессию прилегающих генов, включая или выключая их экспрессию на уровне терминации транскрипции или инициации трансляции.
К настоящему моменту выяснилось, что лидерные области ряда генов пуринового метаболизма у В. subtilis, включая риг-оперон, xpt-pbuX-оперон и ген pbuE, кодирующий трансмембранный белок, ответственный за транспорт пуринов из клетки, содержат
консервативную последовательность, получившую наименование G-бокс, которая способна выступать в качестве сенсора пуриновых оснований, а также расположенный за ней классический Rho-независимый терминатор транскрипции. В то же время, детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области рыг-оперона В. subtilis, позволяющего выяснить роль кодируемой этой областью сенсорной РНК в регуляции экспрессии pw-оперона, не проводилось. Кроме того, оставалась неясной роль внутреннего Rho-независимого терминатора транскрипции, расположенного в межгенном участке purF-ригМ pur-оперона, в координации синтеза предшественников пуриновых нуклеотидов.
Изучение механизмов регуляции риг-оперона и других генов, вовлеченных в метаболизм пуринов, имеет и важный практический аспект, поскольку некоторые промежуточные соединения, образующиеся в процессе биосинтеза пуринов, обладают рядом чрезвычайно важных положительных качеств. В частности, 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид или сокращенно - AICAR (также известный как акадезин), который образуется в процессе биосинтеза пуринов de novo у В. subtilis, является активатором аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (АМРК), которая, в свою очередь, является глобальным регулятором метаболических процессов, обеспечивающих энергетический статус эукариотических организмов. В настоящее время проводится ряд клинических исследований препаратов на основе акадезина, результаты которых дают обнадеживающие положительные данные, в области борьбы с хронической лимфоцитарной лейкемией В-клеток, лечения метаболического синдрома и кардиохирургии. В связи с этим, получение высокоактивного штамма-продуцента AICAR на основе генетически модифицированных бактерий с измененной регуляцией генов пуринового метаболизма представляется весьма актуальной практической задачей для разработки процесса дешевого микробиологического синтеза AICAR.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение механизма регуляции метаболизма и транспорта пуринов у В. subtilis с участием сенсорных РНК и создание на этой основе штамма-продуцента AICAR - перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения.
В процессе работы были решены следующие задачи:
-
Проведение детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области риг-оперона В. subtilis и выявление регуляторных элементов, участвующих в контроле экспрессии этого оперона
-
Изучение структурно-функциональной организации лидерной области гена pbuE В. subtilis, кодирующего синтез трансмембранного белка, ответственного за экспорт пуриновых оснований из клетки. Выявление эффекторов, влияющих на экспрессию тетрЬиЕ.
-
Создание штамма-продуцента, накапливающего AICAR в культуральной жидкости в концентрациях, достаточных для дальнейшего промышленного производства.
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области pur-оперона В. subtilis, впервые показано, что регуляция экспрессии этого оперона осуществляется с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффекторами гуанином и гипоксантином. Впервые показано, что уровень экспрессии четырех дистальных генов рш--оперона (purMNHD) подавляется более чем в 2 раза в результате действия Rho-независимого терминатора транскрипции расположенного в межгенном участке purF-purM.
На основании мутационного анализа лидерной области гена pbuE В. subtilis, впервые показано, что присутствие в консервативной области лидера (А-бокс) двух нуклеотидных замен 70U-*C и A100->G приводит к изменению специфичности сенсорной РНК in vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин.
Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция мутшггных вариантов лидерной области /wr-оперона В. subtilis и лидерной области гена pbuE В. subtilis с нуклеотадными заменами в участках лидерной мРНК, которые влияют на формирование вторичной структуры или на связывание мРНК с эффектором. Коллекция может быть использована для дальнейших исследований в этой области, а также для конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов.
Сконструирован высокоактивный штамм-продуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в культуральной жидкости. Полученный штамм может послужить основой для промышленного микробиологического синтеза AICAR - перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения.
Аппобапия работы
Материалы диссертации докладывались на международной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня» (Бреслеровские чтения II), (Санкт-Петербург, 7-8 ноября 2006 г.), Международной школе-конференции по генетике микроорганизмов и биотехнологии, посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика (Москва-Пущино, 20 -24 октября 2008 г), Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-27 июня 2009 г.).
Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 23 мая 2011 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, из них три печатные работы в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.
Структура работы
Диссертация изложена на 'JW страницах печатного текста, включая Л рисунков и _5_ таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы (ХНр наименований).
