Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1. Бактериальная конъюгация 6
1.1.1. Основные закономерности конъюгации на примере F-фактора Е. colt 6
1.1.1.1. Общая характеристика конъюгации 6
1.1.1.2. Этапы конъюгации 7
1.1.1.3. Гены и белки конъюгации 8
1.1.1.4. Регуляция процесса конъюгации 9
1.1.2. Сходство элементов конъюгативного аппарата с компонентами системы секреции IV типа (T4SS) 9
1.1.3. Конъюгативная мобилизация RCR плазмид 12
1.1.4. Ретроконъюгация у бактерий 13
1.1.5. Конъюгативные транспозоны 14
1.1.6. Особенности конъюгации грам-положительных микроорганизмов 17
1.1.7. Конъюгация у бацилл 18
1.1.7.1. Группа Я cereus 18
1.1.7.2. Группа Я subtilis 22
1.2. Плазмиды бацилл 26
1.2.1. Общая характеристика плазмид бацилл 26
1.2.2. Строение крупных плазмид бацилл и свойства, определяемые их генами 27
1.2.3. Механизмы репликации крупных плазмид бацилл 29
1.2.4. Характеристика отдельных крупных конъюгативных плазмид бацилл 35
1.2.4.1. Я subtilis 35
1.2.4.1.1. pLS20 35
1.2.4.1.2. р1387-3 и другие плазмиды из московской коллекции 36
1.2.4.1.3. pBS72, р19 и другие плазмиды из белорусской коллекции 36
1.2.4.2. Я thuhngiensis 38
1.2.4.2.1. рХО 16 38
1.2.4.2.2.pAW63 38
1.2.4.2.3. рВМВ67 41
1.2.4.3. Я anthracis 43
1.2.4.3.1. pXOl 44
1.2.4.3.2. рХ02 46
2. Материалы и методы 49
3. Результаты 60
3.1. Клонирование фрагментов ДНК плазмиды р 19, предположительно несущих гены конъюгации 60
3.2. Определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК плазмиды р19 68
3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей плазмиды р19 77
3.4. Инактивация предполагаемых конъюгативных генов плазмиды р19 95
3.5. Изучение явления ретроконъюгации у Bacillus subtilis 98
4. Обсуждение результатов 102
Выводы 110
Список литературы
- Основные закономерности конъюгации на примере F-фактора Е. colt
- Особенности конъюгации грам-положительных микроорганизмов
- Характеристика отдельных крупных конъюгативных плазмид бацилл
- Клонирование фрагментов ДНК плазмиды р 19, предположительно несущих гены конъюгации
Введение к работе
Bacillus subtilis является наиболее изученным видом среди грам-положительных бактерий и широко применяется как в лабораторной практике в качестве модельного микроорганизма, так и в прикладных исследованиях по биотехнологии. Кроме того, существенным достоинством этой бактерии служит полное отсутствие патогенности. Ее геном был секвенирован одним из первых (Kunst et al., 1997); у В. subtilis уже давно разработаны методы, позволяющие осуществлять обмен генетическим материалом за счет трансформации и трансдукции. Однако до сравнительно недавнего времени у нее не был описан такой, распространенный у других бактерий, способ гибридизации, как конъюгация. Такой пробел объясняется, в основном, тем, что у лабораторного штамма В. subtilis 168 отсутствуют крупные конъюгативные плазмиды. В лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН была разработана система, позволяющая воспроизводить конъюгативный перенос у различных штаммов В. subtilis (в том числе и у В. subtilis 168) и других бацилл с помощью крупной (размером 97 тпн) плазмиды р19, которую несет природный штамм В. subtilis 19, выделенный проф. М.А. Титок (Белорусский гос. университет) из лесных почв Белоруссии. Конъюгативная плазмида р19 оказалась способной к «самопереносу», переносу мелких неконъюгативных плазмид и к конъюгативному переносу хромосомных генов; это делает ее удобным инструментом для различного рода опытов, связанных с переносом генетического материала у бацилл во многих областях генной инженерии и биотехнологии. Однако строение различных областей этой плазмиды, их «генный набор», и принадлежность ее к какой-либо группе других конъюгативных плазмид бактерий до настоящего времени не изучались.
Целью работы являлось изучение строения областей, ответственных за конъюгативный перенос, у крупной конъюгативной плазмиды р19, и исследование некоторых особенностей конъюгации, происходящей с участием этой плазмиды.
В задачи исследования входило:
На основе полученных ранее производных плазмиды р19 провести клонирование и секвенирование генов конъюгации.
Осуществить в базе данных поиск гомологов генов, расположенных на секвенированных плазмидных фрагментах.
Провести функциональный анализ генов, лежащих на секвенированных участках плазмиды р 19.
Провести сравнительный анализ р!9 и других конъюгативных плазмид.
5. Разработать систему, позволяющую обнаружить явление ретроконъюгации у бацилл и изучить это явление на модели плазмиды р19 у Bacillus subtilis. Работа была выполнена в группе генетики плазмид лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН им. Н.И.Вавилова.
Основные закономерности конъюгации на примере F-фактора Е. colt
Первый этап конъюгации - образование mpf-комплекса. Он начинается с установления контакта клеток. Главную роль в контакте клеток грам-отрицательных бактерий играют половые ворсинки, или пили. F-пили - это цилиндрические структуры диаметром 8 нм с диаметром внутреннего канала 2 нм. Длина их составляет около 20 нм, что в несколько раз больше длины клетки. На клетку приходится от 1 до 4 пилей. Пили состоят из 50 одинаковых субъединиц белка- пилина, уложенных винтообразно. Пили являются местом прикрепления так называемых мужских фагов. РНК-фаги (R17, О, MS2,QP) прикрепляются к основанию пиля; фаги с одноцепочечной ДНК (fl, М13, fd) - к кончику пиля. Конец пиля взаимодействует с поверхностью клетки-реципиента; сокращение пиля приводит клетки к тесному контакту. Сокращение пилей происходит без дополнительного источника энергии, за счет их деполимеризации. Далее в месте контакта донора и реципиента образуется пора и канал, пронизывающий оболочки клеток. До сих пор не известно, как именно образуется пора и участвуют ли в ее образовании пили или их компоненты. Описаны пили двух типов. F-пили тонкие и длинные; они осуществляют конъюгацию и в жидкой, и в полужидкой среде (на поверхности агара). Другой тип - пили (например у плазмиды RP4) более толстые и жесткие; они обуславливают контакт клеток преимущественно в полужидкой среде.
Другим этапом конъюгации является образование Dtr (DNA transfer and replication) комплекса, или релаксосомы. Важнейшим ферментом этого комплекса является релаксаза. Она связывается с определенным участком ДНК плазмиды, т.н. oriT, осуществляет в этом участке расплетение спирали ДНК, вызывает одноцепочечный разрыв фосфодиэфирной связи специфического динуклеотида и остается ковалентно связанной с 5 - концом ДНК. Для образования релаксосомы требуется участие ряда белков, как плазмидного, так и хромосомного происхождения. Следующий этап конъюгации - продвижение ДНК, соединенной с релаксазой, через пору и канал в клетку реципиента. Релаксаза вместе с 5 -концом ДНК, вероятно, остается в районе канала; после вхождения в клетку всей плазмидной ДНК она образует фосфодиэфирную связь, замыкая переданную в клетку-реципиент ДНК в однонитевое кольцо. Обычно через конъюгативный канал передается только ДНК плазмиды, но иногда передаются и белки (у плазмид IncI и IncP групп -праймаза, участвующая в синтезе второй нити ДНК в клетке реципиента). Обязательными участниками этого этапа конъюгации являются т.н. СР (Coupling Protein), соединительные белки. Они соединяют релаксосому и mpf- комплекс. У F- фактора это белок TraD.
На заключительном этапе происходит достройка второй нити ДНК. В клетках донора она осуществляется по RC (rolling circle), или сигма-типу. В клетках реципиента синтез второй нити идет с многочисленных праймеров. В обоих случаях достройку второй нити осуществляют ферменты, кодируемые хромосомой. F-фактор может осуществлять конъюгативный перенос мелких неконъюгативных плазмид, , т.н., мобилизацию (см. раздел 1.3); может встраиваться в хромосому Е. coli за счет ТпЮОО (ън. -Нгг-штаммы) и осуществлять перенос генов хромосомы; может выщепляться из хромосомы вместе с отдельными хромосомными генами (F-факторы) и далее переносить их в клетки реципиента. Основные закономерности конъюгативного переноса во всех случаях остаются неизменными.
В tra-районе F-фактора идентифицировано 36 ORF и 9 промоторов. Все гены, кроме одного, транскрибируются в одном направлении. Ген fmO разорван IS3. Ген traA кодирует белок пилин, образующий субъединицы пилей. Пилин подвергается процессингу и N-концевому ацетилированию; конечная величина белка 70 аа (7,2 кДа). Белок TraQ способствует встраиванию пилина во внутреннюю мембрану, где происходит процессинг пилина с помощью сигнальной пептидазы I, и участвует в ацетилировании пилина. В ацетилировании пилина участвует и белок ТгаХ. Частицы пилина имеют 2 трансмембранных домена, N- и С-концы белка расположены в цитоплазме. Обычно большая часть молекул пилина F-фактора связана с внутренней мембраной, меньшая часть - с целым пилем. Кроме трех названых, еще не менее 13 белков F-фактора участвуют в сборе пилей; они преимущественно локализованы в мембранах клетки.
Для установления стабильного контакта клеток необходимы белки TraN и TraG. TraG - бифункциональный белок, его N-конец нужен для образования пилей, а С-конец -для установления контакта клеток.
Релаксаза F-фактора - Tral - имеет две активности, никирующую и хеликазную. В процессе никирования и вытеснения нити ДНК вовлечены белки TraY, TraM и кодируемый хромосомным геном белок IHF (Integration Host Factor), все они присоединяются к ДНК F-фактора в районе oriT. Tral является цитоплазматичесим белком, имеет величину 1756 аа и присутствует в клетке в количестве 600 копий. Хеликазная активность белка связана с С-концом и АТФ-зависима. СР-белок F-фактора raD - имеет величину 717 аа, локализован во внутренней мембране (2 трансмембранных района), способен связывать и гидролизовать АТФ. Функции ряда генов F-фактора не установлены. Возможно, в конъюгации участвуют и белковые продукты генов т.н. лидерного района F-фактора, отличного от tra-района. Эти гены первыми входят в клетку реципиент при конъюгации. Возможно, в конъюгации участвует SSB-белок, чей ген расположен в лидерном районе.
Два гена F-фактора обуславливают т.н. поверхностное исключение (surface exclusion), т.е. резкое снижение частоты конъюгационного переноса в том случае, если клетка-реципиент также содержит F-фактор, т.е. эти гены мешают клетке, содержащей F-фактор, быть реципиентом. Это гены ТгаТ и TraS. Действуют они на разных этапах конъюгации независимо друг от друга. ТгаТ — липопротеин, локализован во внешней мембране, препятствует образованию контакта между донором и реципиентом. TraS, белок внутренней мембраны, препятствует вхождению ДНК донора после образования конъюгационной пары.
Особенности конъюгации грам-положительных микроорганизмов
У грам-положительных микроорганизмов конъюгативные плазмиды описаны у представителей родов Staphilococcus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Lactobacillus, Lactococcus. Описаны самоперенос конъюгативных плазмид, мобилизация неконъюгативных плазмид и даже перенос хромосомных генов. Однако эти плазмиды изучены гораздо хуже, чем конъюгативные плазмиды грам-отрицательных микроорганизмов. По всей видимости, механизмы конъюгативного переноса у грам-отрицательных и грам-положительных бактерий имеют немало сходства. В частности, выявлено сходство процессов образования релаксосомы. У многих конъюгативных плазмид грам-положительных микроорганизмов идентифицированы гены релаксаз, выделены и изучены соответствующие белки. Идентифицированы и районы oriT. Описано также несколько типов белков, гомологичных белкам mpf-комплекса грам-отрицательных микроорганизмов. Это белки-гомологи VirBl, VirB4, VirBll белков и СР-белки. VirBl -трансгликозилаза, вероятно, способствует локальному нарушению целостности клеточной стенки; остальные три белка обеспечивают процесс переноса ДНК энергией. Какие-либо белки, обуславливающие контакт клеток донора и реципиента и образование межклеточного канала, не описаны (Andrup, 1998; Прозоров, 2003; Grohmann et al., 2003). Конъюгативные пили у грам-положительных бактерий не описаны, и предполагается, что контакт клеток осуществляется без их участия, иным, неизвестным путем. Это может быть связано с тем, что клеточная оболочка грам-отрицательных и грам-положительных бактерий имеет разное строение. Долгое время у грам-положительных бактерий пили вообще были не известны. Только надавно они были обнаружены у некоторых видов. Оказалось, что эти пили тонкие, короткие и трудноразличимые (Budzik et al., 2007; Pelicic, 2008).
Имеется еще одна особенность конъюгации у грам-положительных бактерий. По-видимому, только у грам-положительных энтерококков обнаружено, что установление контакта между клетками происходит с помощью феромонов. Клетки будущего реципиента, не несущие плазмид, секретируют феромоны, которые обладают специфичностью к донорам, несущим определенные плазмиды. Феромоны - это термостабильные гидрофобные пептиды, состоящие из 7 - 8 аминокислотных остатков.
Они действуют в очень низких концентрациях: на клетку донора приходится 1-5 молекул феромона. В ответ на присутствие феромона донор синтезирует т.н. фактор агрегации и запускается процесс соединения клеток донора и реципиента. Клетки, получившие конъюгативную плазмиду, синтезируют кодируемый плазмидой пептид - ингибитор соответствующего феромона. При этом продукция феромонов, специфичных для других плазмид, остается неизменной. Наличие феромонов делает процесс конъюгации чрезвычайно эффективным, повышая его частоту на 5 - 6 порядков (Zehner et al., 2000).
Для некоторых конъюгативных плазмид tra-районы полностью или частично секвенированы. Определены гомологи белков конъюгации и расположение соответствующих генов на картах плазмид со сходными tra-районами. Можно выделить две группы конъюгативных плазмид грам-положительньтх микроорганизмов. К первой группе принадлежат плазмиды Streptococcus pIP501, Enterococcus pRE25, Staphilococcus pSK40 и pGOl, Lactococcus pMRCOl (Grohmann et al., 2003). Ко второй группе принадлежат плазмиды В. thuringiensis pAW63 и рВТ9727, В. anthracis рХ02 (Van der Auwera et al., 2005) и, вероятно, pHTbeta (Tomita, Ike, 2005).
У каждого вида и рода бактерий конъюгация имеет свои особенности, это касается и конъюгации у бацилл (Andrap, 1998; Прозоров, 2003; Grohman et al., 2003). Хотя род Bacillus включает в себя значительное количество видов, конъюгация была изучена главным образом у представителей двух групп: В. cereus и В. subtilis.
К данной группе бацилл относятся близкие виды В. cereus, В. thuringiensis и В. anthracis. Они характеризуется GC-составом, равным 34-35%. Наиболее существенным для промышленной микробиологии является В. thuringiensis - продукцент инсектицидного внутриспорового токсина, который убивает гусениц и личинок кровососущих насекомых. Гены токсинообразования зачастую располагаются на плазмидах. В. anthracis имеет значение для медицинской микробиологии, поскольку является возбудителем сибирской язвы, причем гены сибиреязвенного токсина располагаются на крупных плазмидах. Представители В. cereus способны, размножаясь в продуктах питания, вызывать пищевые отравления.
Более полно конъюгативный перенос изучен у В. thuringiensis, впервые он был описан в работах (Gonsalez et al., 1982; Gonsalez, Carlton, 1984). В экспериментах при совместном выращивании клеток донора и реципиента в жидкой среде был обнаружен перенос ряда крупных плазмид размером от 60 до 80 тпн. Первоначально перенос плазмид фиксировался с помощью электрофореза плазмидной ДНК или иммуноферментного анализа (иммунологическая реакция белкового токсина с соответствующими антителами). Частота передачи достигала 75%. Перенос плазмид бьш осуществлен не только в штаммы В. thuringiensis, но и в штаммы других видов, например в штаммы В. cereus.
Подобные работы с В. thuringiensis проводились позднее в лаборатории К. Торна (Массачусетский Университет, США). Был обнаружен ряд крупных плазмид (рХОП -рХ017, размером от 80 до 200 тпн), которые осуществляли мобилизацию мелкой неконъюгативной плазмиды рВСІб (TcR) в штаммы различных видов бацилл, таких, как В. thuringiensis, В. cereus и В. anthracis. Частота передачи рВСІб колебалась от 10 1 до 10", в зависимости от взятого реципиента. Было также замечено, что тетрациклинустойчивые трансконъюганты помимо рВСІб (Тс ) всегда содержали крупную плазми ду и сами при этом становились донорами, что подтверждало наличие конъюгативных свойств у этих плазмид (Battisti et al., 1985; Reddy et al., 1987).
Работы по изучению конъюгативной передачи плазмид у инсектицидных штаммов В. thuringiensis проводили и в России, в лаборатории Р. Р. Азизбекяна (Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва) с целью выявить плазмиды, ответственные за токсинообразование. Для этого в штаммы В. thuringiensis искусственно вводили плазмиду pAMpl, которая способствовала передаче некоторых плазмид с частотой порядка 10"5 - 10"6 (Смирнова и др., 1987; Кузнецова и др., 1995).
Позже работы по изучению конъюгации у В. thuringiensis проводились в лаборатории Л. Андрупа (Национальный институт профессионального здравоохранения, Копенгаген, Дания). Здесь В. thuringiensis изучалась как потенциально опасный агент для рабочих, занятых обработкой оранжерей спорами этого микроорганизма. Была детально исследована конъюгация с участием крупных плазмид рХОІб (200 тпн), pAW63 и рНТ73 (обе плазмиды примерно 75 тпн). В отличие от предыдущих работ, авторы пометили конъюгативные плазмиды рХОІб и pAW63 маркером устойчивости к тетрациклину (TcR) за счет встраивания в них транспозона Тп5401, что упростило обнаружение плазмид при конъюгативной передаче. Частоты конъюгативной передачи рХОІб и pAW63 были очень высокими (до 100% и около 90% соответственно) (Jensen et al., 1996; Wilcks et al., 1998). Эффективность переноса рХОІб зависела от температуры и рН (Thomas et al., 2001).Была также определена частота мобилизации неконъюгативной рВСІб.
Характеристика отдельных крупных конъюгативных плазмид бацилл
Крупная плазмида pLS20 размером около 65тпн является одной из первых плазмид бацилл, для которой были показаны конъюгативные свойства. Первоначально ее обнаружили в штамме В. subtilis IF03335 вместе с RCR плазмидой pLS19 (5,4 тпн) (Tanaka, Koshikava, 1977), которая детерминирует продукцию полиглутамата (Нага et al., 1981; 1982; 1983). Функция pLS20 на тот момент была не определена, но, поскольку в разных штаммах В. subtilis обнаруживались сходные плазмиды, то Тонака и Кошикава предположили, что плазмиды передаются между штаммами с помощью процесса конъюгации, определяемого pLS20. Позже было показано, что pLS20 способна осуществлять конъюгативный самоперенос и перенос мелких неконъюгативных плазмид как на твердой, так и в жидкой среде в штаммы различных бацилл с достаточно большой частотой (см.раздел 1.1.7.2.). Плазмида является криптической. Число копий плазмиды на клетку равно 3 (Kuroki et al., 2007).
Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента pLS20 величиной 3136 пн, способного к автономной репликации. Было показано, что собственно репликацию способен осуществлять более мелкий фрагмент величиной 1,1 тпн (и даже 0,44 тпн). Этот участок ДНК не несет сколь либо крупных (более 85 кодонов) ORF, но имеет 6 инвертированных повторов, АТ-богатые участки, DNA-боксы и прямые повторы. Вероятно, этот район ДНК представляет собой oriA, при этом специфический белок репликации у pLS20 отсутствует.
На секвенированном фрагменте pLS20 обнаружена также ORF А, гомологичная хромосомным генам В.subtilis гарА и гарВ. Возможно, pLS20 несет rap/(phr?) модуль (Mejeretal., 1995).
Кроме того, близ oriA района на плазмиде pLS20 был обнаружен участок в 18 пн, гомологичный Тег-району хромосомы В.subtilis. Тег-район, вместе с белком RTP (replication termination protein), осуществляет терминацию репликации хромосомы. Была определена активность Тег-района pLS20 in vivo. Оказалось, что он способен - при наличии белка RTP - осуществлять остановку репликативной вилки. Сайт активен в обоих направлениях. Возможно, остановка репликации предупреждает образование мультимерной плазмидной ДНК и способствует стабильному сохранению малокопийной плазмиды pLS20 в ряду клеточных поколений. Это первый и единственный Тег-район, обнаруженный на плазмидах грам-положительных бактерий (Mejer et al., 1996).
Плазмиды на основе pLS20 были использованы в генно-инженерных работах для спасения путем конъюгационного переноса клонированных в клетках B.subtilis крупных (до 90 тпн) фрагментов ДНК (Kuroki et al., 2007).
В лабораторной коллекции штаммов В. subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области (Козловский, Прозоров, 1983), довольно часто обнаруживались крупные плазмиды. У 9 из 42 проверенных штаммов обнаружены плазмиды размером более 35 тпн. Величина плазмид колебалась от 35 до более чем 90 тпн. (Федорина, 2006). Четыре плазмиды (р1387-3, р1420, р1440, р1899) были проверены на способность осуществлять мобилизационный перенос мелкой неконъюгативной плазмиды pUBl 10, несущей маркер устойчивости к канамицину. Перенос был показан только для pi387-3 (35,5 тпн); перенос шел с низкой частотой (10"7) (Полуэктова идр., 2000; Незаметдинова и др., 2007). Не известно, отсутствуют ли на других крупных плазмидах из этой коллекции генетические системы конъюгации, или они репрессированы. Способы репликации плазмид также не изучены. Известно только, что ДНК ни одной из плазмид московской коллекции не гибридизуется с минирепликоном р19 из белорусской коллекции, т.е. гер-районы этих плазмид различны (Незаметдинова и др., 2007).
Не так давно в природных почвенных штаммах В. subtilis, выделенных из лесных почв Белоруссии, обнаружен ряд крупных плазмид (Лагодич и др., 2004). Наиболее изучены из них плазмиды р19 (Лотарева и др., 2001, Полуэктова и др., 2005) и pBS72 (Titok et al., 2003).
У плазмиды pBS72 (более 90 тпн) изучены главным образом особенности репликации. Было выяснено, что pBS72 реплицируется по тета-типу, так как не было обнаружено одноцепочечных интермедиатов в ходе ее репликации. Кроме того, репликация плазмиды не зависит от ДНК-полимеразы I, что было экспериментально подтверждено клонированием минирепликона, который стабильно поддерживался в клетках В. subtilispolA (Titok et al., 2003). Репликон плазмиды pBS72 (3080 пн) уникален и не имеет сходства с rep-районами других ранее изученных плазмид. Аналогичный тип репликонов обнаруживался лишь у других крупных плазмид белорусской коллекции. Еще 8 коллекционных штаммов В. subtilis несли плазмиды, сходные по размеру с pBS72 (около 90 тпн). Минирепликон одной из них (pBS57) был секвенирован (2892 пн) и, как оказалось, репликон pBS57 почти на 100% гомологичен минирепликону плазмиды pBS72. Незначительные отличия касались отсутствия у pBS57 участка (529 пн), включающего ORF3 и ORF4, и наличия дополнительной последовательности (340 пн) перед ORF2. Высокая степень сходства rep-районов плазмид pBS72 и pBS57 позволяет предполагать, что репликоны данного типа широко распространены среди природных штаммов В. subtilis на территории Беларуси. Это предположение было подтверждено экспериментами по амплификации тотальной ДНК природных штаммов с праймерами, сконструированными для rep-района pBS72. Из 55 проверенных штаммов коллекции 8 дали специфический продукт амплификации (Лагодич и др., 2004). На основе тета-репликона плазмиды pBS72 были созданы векторы для молекулярного клонирования (Лагодич и др., 2005).
Другая крупная плазмида (р19), обнаруженная в природном штамме В. subtilis 19 белорусской коллекции, имеет размер 95 - 97 тпн. Интерес к этой плазмиде обусловлен выраженными конъюгативными свойствами, поэтому ранние работы по изучению р19 главным образом посвящены ее способности к конъюгативной передаче. р19 а также другие крупные плазмиды из белоруской коллекции, демонстрируют способность к различным формам конъюгативного переноса ДНК с высокой частотой (см. раздел 1.1.7.2).
Не так давно были начаты работы по идентификации генов плазмиды р19. Был секвенирован фрагмент р19 (2949 пн), клонированный на плазмиде рб, большая часть которого имела 100% гомологию с rep-районом плазмиды pBS72. В плазмиду рб был встроен маркер устойчивости к хлорамфениколу и, как оказалось, рекомбинантная плазмида рб Cm реплицировалась и стабильно поддерживалась в клетках В. subtilis, что подтверждает наличие функционального репликона на рб. На секвенированном фрагменте была обнаружена новая рамка считывания (ORF6), предполагаемый продукт которой (115 аа) имеет НТН-мотив, свойственный ДНК-связывающим белкам; его гомологи: регуляторы транскрипции, ДНК-связывающие белки, фаговые репрессоры, а также белки с неизвестными функциями. Возможно, ORF6 вовлечена в конъюгативный перенос р19 (Федорина, 2006).
Клонирование фрагментов ДНК плазмиды р 19, предположительно несущих гены конъюгации
Для того, чтобы клонировать гены р19, обуславливающие конъюгацию, был применен следующий подход. Ранее в нашей лаборатории криптическая плазмида р19 была маркирована геном cat. Источником cotf-гена служила плазмида рЗ, сконструированная на основе плазмиды Е. coli pUC19 с встроенным в полилинкер геном cat из плазмиды рС194. Плазмида рЗ реплицируется только в клетках Е. coli, но не в В. subtilis. В клетках Е. coli экспрессируются гены рЗ cm (устойчивость к хлорамфениколу) и apR (устойчивость к ампицилину). В клетках В. subtilis экспрессируется только ген cmR. Встраивание рЗ в криптическую плазмиду р19 проводилось по iscoRI-сайтам, которых на р19 около 20, в то время как на рЗ всего 1 coRI-сайт. ДНК плазмид рЗ и р19 обрабатывали .EcoRI-рестриктазой, а затем смесь іГсоМ-фрагментов р19 и линейную рЗ смешивали вместе с последующим лигированием и трансформацией клеток В. subtilis 19 (р19), содержащих нативную плазмиду р19. Непосредственное встраивание рЗ происходило за счет гомологичной рекомбинации между р19 и промежуточным интермедиатом рЗ , что могло сопровождаться делецией части генов р19 (рис. 3). Таким образом, рЗ могла встраиваться в различные участки на плазмиде р19, в том числе и в tra-район. Отбор полученных трансформантов проводился по Сгг -фенотипу (рис. 3). В результате было отобрано около 60-ти клонов, которые содержали производные плазмиды р19 со встроенным cat-тенои (pl9cat); 28 из них утратили конъюгативную способность, то есть имели фенотип Cm Tra". По всей видимости, встраивание селективного маркера у этих клонов произошло в участки р19, существенные для конъюгации, и тем самым нарушилась функциональная целостность конъюгативных генов (Федорина, 2006).
Полученные производные В. subtilis 19 (pl9cat) CmR Tra" , неспособные к конъюгации, были использованы нами для клонирования фрагментов ДНК плазмиды р19, прилегающих к вставке рЗ и предположительно несущих конъюгативные гены. Для этого плазмиды pl9cat рестрицировались по С/а1-сайтам (которых на р19 около 17, в то время как на рЗ сайты узнавания данной рестриктазьг отсутствуют), с последующим лигированием и трансформацией клеток Е. coli DH5a. Отбор полученных трансформантов проводился по CmR ApR - фенотипу. В результате мы получили рекомбинантные плазмиды серии рЗ-19, каждая из которых состояла из векторной части рЗ и двух клонированных Clal-EcoKl фрагментов плазмиды р19 (рис. 4). Каждый из двух Clal-EcoRI фрагментов каждой плазмиды серии рЗ-19 представлял собой отдельный фрагмент исходной плазмиды р19. В плазмиде р19 эти два СїаІ-ЕсоШ. фрагмента, скорее всего, не прилегали друг к другу (см. рис. 3). Каждый из СїаІ-ЕсоШ фрагментов мог нести несколько ЕсоШ сайтов. Нам удалось получить в клетках Е. coli 18 плазмид серии рЗ-19. Из них 9 не несли Clal сайта; вероятно он был потерян в результате перестроек плазмид. 9 плазмид, имевших С1а\ сайт, были использованы для дальнейшего анализа. Для этих 9 плазмид были построены рестрикционные карты и определены нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, непосредственно прилегающих к рЗ, с помощью стандартного праймера pUC/M13F и праймера cat, сделанного по известной нуклеотидной последовательности cat гена рЗ (рис. 5, прил. 1). Это позволило определить, что три плазмиды рЗ-19-15, рЗ-19-18 и рЗ-19-19 идентичны; для дальнейшей работы была использована плазмида рЗ-19-18. Остальные плазмиды отличались друг от друга, хотя некоторые из них несли одинаковые фрагменты ДНК р19. Эти 7 плазмид были использованы для определения нуклеотидных последовательностей клонированных на них фрагментов ДНК р19 (рис. 6, табл. 2).
Рисунок 3. Маркирование плазмиды р19 с помощью плазмиды рЗ. A. .EcoRi-рестрикция плазмид р19 и рЗ (на плазмиде р19 находится более 20 ІГсоШ-сайтов, на плазмиде рЗ находится всего 1 сайт узнавания ЕсоШ). Лигирование линейной рЗ с ЕсоШ фрагментами р19, в результате образуется промежуточный интермедиат рЗ ; трансформация клеток В. subtilis\9 (р19) полученной рЗ . Б. Гомологичная рекомбинация рЗ и р19 без делеции ДНК р19 (клоны В. subtilis\9 (pl9caf) отбирали по Стк-фенотипу). B. Гомологичная рекомбинация рЗ и р19 с делецией части ДНК р19 (клоны В. subtilis\9 (pi9caf) отбирали по Стк-фенотипу). Цифрами указаны величины фрагментов в тпн по данным электрофореза в агарозном геле. Одним цветом указаны участки ДНК, принадлежащие непрерывным фрагментам р19. На рисунке А представлены только фрагменты ДНК, клонированные на плазмидах рЗ-19, без векторной части рЗ. На рисунке Б представлены плазмиды рЗ-19 целиком. Фрагмент ЕсоШ-Clal величиной 1,6 тпн плазмиды рЗ-19-32 секвенирован не был.
Для определения нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК р19 мы использовали следующие подходы. Во-первых, секвенировали плазмиды серии рЗ-19 со стандартных праймеров (pUC/M13F и cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков плазмид рЗ-19 (рис. 5). Во-вторых, проводили субклонирование плазмид серии рЗ-19. Для этого либо клонировали на векторе pBluescriptll KS нужные рестриктные фрагменты ДНК, выделенные из агарозного геля (так были получены плазмиды р27-50, р27-13, р40Есо5, p40Ecol, рЗ-12, р27-29-8, pl-1, р27ЕС814, р27-29, р27-13-2.р29ЕН, р5), либо рестрицировали плазмиды рЗ-19 ферментами Bglll, HindlU, Sail, лигировали их «сами на себя» и трансформировали клетки Е. coli DH5a; при этом получали плазмиды, состоявшие из вектора рЗ (или его части) и прилежащих к нему фрагментов ДНК р19 (так были получены плазмиды p40Sal, p40Bgl, p58Hind2, р2-8, р5-5, р4-1, р2-5, р21ЕН) (рис. 7). Некоторые субклоны, полученные из разных плазмид рЗ-19, оказались одинаковыми; это подтвердили данные рестриктного анализа и определение нуклеотидной последовательности. Одинаковыми оказались плазмиды p58Hind2 и р27-13-2; р27-29 и р40Есо5.
