Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
1.1. Мутагенное действие УФ-света и ионизирующей радиации на клетки E.coli 8
1.1.1. Повреждения ДНК, вызванные УФ-светом и ионизирующей радиацией 8
1.1.2. Радиационный мутагенез у E.coli 10
1.2. sos -система репарации E.coli и некоторые ее проявления 13
1.2.1. Модель регуляции sos -репаративных функций. 13
1.2.2. sos -система и УФ-мутагенез 16
1.2.3. w -реактивация и w -мутагенез 17
1.2.4. Ингибирование клеточного деления и филамен-тация клеток 19
1.2.5. Индукция профагов 20
1.3. Основные системы репарации ДБК у Bac.subtilis . 21
1.4. Мутагенное действие УФ-света и ионизирующей радиации на клетки Бас.subtilis 24
1.5. Проявлеіше активности индуцибельной sos -системы репарации у Bac.subtilis 27
1.6. Генетическая трансформация у Вас.subtilis и ее особенности 32
1.6.1. Компетентное состояние 33
1.6.2. Связывание и поглощение ДНК 35
1.6.3. Рекомбинация 36
1.6.4. Коррекция ошибочно спаренных оснований 37
1.6.5. Мутагенное действие излучений на трансформирующую ДНК 38
1.7. Дефектные по рекомбинации мутанты гее 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
ГЛАВА 3. Экспериментальные результаты 65
3.1. Обнаружение эффектов w -реактивации и w -мутагенеза у УФ-облученного фага 65
3.2. Субстратная спеціїфичность w -реактивации и w -мутагенеза у фага ^105 74
3.3. V-реактивация и w -мутагенез у УФ-облученного фага /dl05 в мутантах гее 87
3.3.1. Влияние мутаций гее на выживаемость УФ-облученных клеток и фага ^105 89
3.3.2. Влияние мутаций гее на w -реактивацию и w -мутагенез 93
3.4. Мутагенное действие УФ-света на мутанты гее 99
3.5. Взаимоотношения между мутациями гее и температу-рочувствительной мутацией tsi-23 107
3.6. Влияние гиперрадиорезистентной мутации Gamr9 на радиационный мутагенез у фага 122
3.7. w -мутагенез при трансформации Вас.subtilis с помощью ДНК, модифицированной различными агентами... 128
3.7.1. Влияние эксцизионной репарации на мутагенное действие УФ-света на трансформирующую ДНК 130
3.7.2. Мутагенное действие УФ-света на разделенные нити трансформирующей ДНК 133
3.7.3. Мутагенное действие ft-квантов на трансформирующую ДНК 138
3.7.4. w -мутагенез трансформирующей ДНК в УФ-об- лученных реципиентных клетках 145
3.8. w -мутагенез при трансфекции компетентных клеток УФ-облученной профаговой ДНК 149
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов и выводы 160
СПИСОК ЛИТЕРАТУШ 170
- Повреждения ДНК, вызванные УФ-светом и ионизирующей радиацией
- Материалы и методы
- Обнаружение эффектов w -реактивации и w -мутагенеза у УФ-облученного фага
- Обсуждение результатов и выводы
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема радиационного мутагенеза является одной из центральных в современной молекулярной генетике. Механизм мутагенного действия УФ-света и ионизирующей радиации на бактерии и фаги интенсивно изучается в последние десятилетия. Эти исследования привели к разработке концепции склонной к ошибкам, индуцибельной системы sos -репарации, ответственной за мутагенное действие ЭТИХ агентов на клетки Escherichia coli /146,242/. Согласно этой концепции первичные повреждения, возникающие в ДНК под действием излучений, являются лишь потенциально мутагенными, а их превращение в фенотипическн регистрируемые мутации зависит от индуцируемой нарушениями репликации ДБК сложной биохимической репаративной системы, находящейся под контролем регуляторних генов гесА+ и 1ехА+ . Так как фиксация индуцированных УФ-светом и ионизирующей радиацией мутаций у е.coli сопряжена с работой одной из репаративных систем клетки, то принято говорить, что она происходит по механизму ошибок репарации.
Особенность предмутационных повреждений, индуцированных эти> ми агентами, состоит в том, что они полностью нарушают способность оснований ДБК к комплементарному спариванию и блокируют репликацию ДНК. Термин "ошибки репарации" условен, так как и на неспариваемых повреждениях мутации появляются, скорее всего, как ошибки синтеза ДБК. Он лишь подчеркивает участие в преодолении неспариваемых повреждений ДНК каких-то индуцибельных клеточных компонентов, входящих в состав sos -системы. Конкретная роль этих компонентов, например продуктов локуса umuDC , до сих пор не выяснена и может состоять, возможно, в ослаблении матричной специфичности ДНК-полимераз /96/.
Наибольшие успехи в изучении роли sos-системы в мутагенезе были достигнуты лишь у одного вида бактерий - E.coli . Между тем эти результаты часто экстраполируются для объяснения молекулярных механизмов мутагенеза и в других биологических системах, даже для клеток млекопитающих (см. обзор /185/). Опасность такой экстраполяции очевидна. Известно, что многие виды бактерий: Proteus /124/, Haemophilus /139/, Deinococcus radiodurans/168/, Streptococcus /80/, Methylococcus И Methylobacter (цитируется no /237/) - не мутируют под действием УФ-света или ионизирующих излучений. Следовательно, эти виды либо лишены склонной к ошибкам мутагенной системы sos-репарации в целом, либо дефектны по какому-либо из ее компонентов, например, по локусу umuDC /237/. Отсюда вытекает необходимость изучения индуцибельных мутагенных систем репарации у различных организмов и прежде всего у бактерий, филогенетически не родственных кишечной группе бактерий.
Одним из наиболее интересных в этом отношении объектов является грамположительная бактерия Bacillus suhtilis , занимающая после Е.соїівторое место по частоте использования в моле-кулярно-генетических исследованиях. Генетика и молекулярная бИОЛОГИЯ Bacsubtilis Изучены ДОСТаТОЧНО ХОРОШО. Bacsubtilis, обладая естественной способностью к генетической трансформации, позволяет расширить и детализировать (в экспериментах с изолированной ДНК) наши представления о процессах репарации и мутагенеза. У сенной палочки выделено большое количество мутантов, дефектных по рекомбинации и репарации. Однако, до настоящего времени систематическое изучение роли индуцибельных систем репарации в радиационном мутагенезе у Bacsubtilis и ее фагов не проводилось.
Основные задачи исследований. Основная цель настоящего исследования состояла в обнаружении у Bacsubtilis системы sos- репарации ДБК, индуцируемой УФ-облучением бактериальных клеток, в анализе участия продуктов различных генов гее в этой системе и в сопоставлении этой системы с хорошо изученной системой sos-репарации E.coii . Б соответствии с этим были поставлены следующие основные задачи:
Разработать систему для обнаружения эффектов w -реактивации и w -мутагенеза у умеренного фага *$Ю5 Bac.subtiiis.
Изучить в этой системе субстратную специфичность w -мутагенеза и зависимость от гес-генов клетки-хозяина.
Проанализировать влияние мутаций гее на индукцию различных мутаций в хромосоме Bac.subtiiis под действием УФ-света и ^-квантов и на фенотип мутанта tsi-23, у которого sos -функции индуцируются при повышенной температуре /250/.
Изучить особенности мутагенного действия УФ-света и y-излучения на трансформирующую ДНК.
Проанализировать состояние sos -системы репарации в компетентных клетках, изучив возможность w -мутагенеза для УФ-об-лученных трансформирующей ДНК и трансфицирующей ДНК профага #05.
Научная новизна полученных результатов. Впервые у Bac.subtiiis обнаружен эффект w -мутагенеза фага #05, выражающийся в повышении частоты мутаций у фага, поврежденного вне клеток УФ-светом, ft-квантами и азотистой кислотой, в клетках, предварительно облученных умеренной дозой УФ-света. Показано, что большинство мутаций гее клетки-хозяина блокирует w -мутагенез у УФ-облученного фага и УФ-индукцию профага #05. Почти все мутации гее устраняют или сильно понижают мутагенное действие УФ-света на клетки Bac.subtiiis . Мутации гее , не являясь су-прессорами температурочувствительности мутанта tsi-23 » устра- няют у него термоиндукцию профага j[05, но не филаментообразо-вание. Впервые обнаружено мутагенное действие ^-квантов на трансформирующую ДЕК Bac.subtiiis и усиление УФ-мутагенеза трансформирующей ДНК в реципиентных клетках, дефектных по эксцизион-ной репарации. Найдено, что w-реактивация УФ-облученной трансформирующей ДНК в облученных компетентных клетках сопровождается заметным w-мутагенезом. Таким образом, показано, что w-му-тагенез наблюдается и в хромосоме бактериальной клетки. Установлено, что в компетентных клетках не происходит спонтанной индукции мутагенной системы sos-репарации, необходимой для мутагенеза в однонитевой трансфицирующей ДНК профага ^105.
Практическое значение работы. Полученные данные углубляют и расширяют знания о радиационном мутагенезе у бактерий и являются основой экстраполяции на Bac.subtiiis гипотезы ин-дуцибельной, склонной к ошибкам системы sos-репарации, разработанной для E.coli. Такая экстраполяция приобретает особое значение в связи с широким использованием Bac.subtiiisB генетической инженерии и промышленной микробиологии /71/. Эффект W-мутагенеза на трансформирующей ДЖ может быть использован для увеличения мутагенного действия реларативных мутагенов на клонированные гены в гибридных плазрадах.
Повреждения ДНК, вызванные УФ-светом и ионизирующей радиацией
Главной мишенью для действия коротковолнового УФ-света на клетки бактерий и фаги является ДНК, в которой повреждаются преимущественно пиримидины /180/. С наибольшими квантовыми выходами (10 -ТО"3) происходит сшивание стоящих рядом в одной нити пиримидиновых звеньев с образованием циклобутановых пири-мидиновых димеров (БД) в результате реакции между 5,6-связями смежных оснований. ПД наиболее часто образуются в последовательностях ТТ, с равной вероятностью в сайтах ТЦ и ЦТ и очень редко в сайтах ЦЦ /115/. Б хромосоме Е.СОІІ на I Дж/м2 света с X = 254 нм возникает 36-60 ЦЦ /208/.
С эффективностью, составляющей около 10$ от эффективности возникновения БД, в УФ-облученной ДНК появляются щелочелабиль-ше (6-4)-фотолродукты /39/. Они образуются в результате реакции 5,6-двойной связи б -тимидина с 4-экзациклической грушіой 3»-пиримидина (амино- или кето-грушіами цитозина или тимина), приводящей к образованию стабильной связи между 6-ым положением б -лиримидина и 4-ым положением 3 -пиримидина /39/. При УФ-облу-чении ДНК образуются также фотогидраты цитозина (6-окси-5,6-ди-гидроцитозин), выход которых при больших дозах УФ-света может достигать 30$ от выхода ЦЦ /180/. Фотогидраты цитозина нестабильны и спонтанно превращаются в цитозин или урацил.
В ДНК бактериальных спор ЦЦ не индуцируются УФ-светом. Вместо них появляется "споровый фотопродукт": 5-тимидил-5,6-ди-гидротимин /180/. С очень небольшими квантовыми выходами УФ-свет вызывает также сшивки нитей ДНК, сшивки ДНК-белок и продукты фо-толиза аденина, в том числе аденин-тиминовые фотоаддукты /38/.
Еще более разнообразными являются продукты повреждения ДНК под действием ионизирующей радиации, спектр которых сильно зависит от условий облучения и может быть неодинаковым для внутриклеточной и изолированной ДНК. Ионизирующие излучения вызывают повреждения оснований ДНК, преимущественно пиримидинов /66/. Главным классом у-индуцированных повреждений пиримидинов являются продукты типа t , т.е. 5,6-диокси-дигидротиминового типа, а также соответствующие гидроперокси-производные. Насыщение 5,6-двойной связи в пиримидинах уменьшает стабильность кольца и и-гликозидной связи и приводит к образованию продуктов раскрытого кольца, апиримидиновых сайтов и освобождению оснований /87/. С меньшей вероятностью в ДНК повреждаются пуриновые основания, в которых происходит насыщение имидазольного кольца (образование кетопроизводных) или его фрагментация (образование 2,4-диамино-5-формамидо-6-оксипиримидина из гуанина) /66/.
Материалы и методы
Минимальной средой для Bac.subtilis служила среда Спицай-зена /221/ следующего состава (на I л): НРО - 18,3 г, KHgPO -6 г, (NH4)2S04 - 2 г, Жа3 -цитрат-5,5Н20 - 1,2 г, MgS04 7H2o-0,2 г, глюкоза - 5 г, рН 7,0. При выращивании ауксотрофов по аминокислотным маркерам в минимальную среду добавляли необходимые аминокислоты в концентрации 50 мкг/мл. Соответствующие твердые среды содержали 15 г/л агара. Минеральная среда Спицайзена служила основой для ряда обогащенных сред: а) трансформационная среда I: минимальная среда - 100 мл, кислотный гидролизат казеина Difco- 0,02 г, необходимые аминокислоты - 5 мкг; б) трансформационная среда П: минимальная среда - 100 мл, кислотный гидролизат казеина Difco- 0,01 г, необходимые аминокислоты - 0,5 мкг; в) min -СН среда: минимальная среда - 100 мл, кислотный гидролизат казеина - 0,05 г, МпС12 - 10 М; г) "среда с ограниченным обогащением" по Филиппову /17/: минимальная среда - 100 мл, кислотный гидролизат казеина Difco - 10 мкг, дрожжевой экстракт Difco - 5 мкг, необходимые аминокислоты -5 мкг.
Практически во всех опытах ночную культуру нужных штаммов выращивали на косом Tryptoso-Biood-Base агаре (ТВАВ) Difco , на котором Bac.subtilis не дает кожистой пленки. Клетки, смытые с ТВАВ-косяка, дают равномерную суспензию в жидкой среде.
Так как используемые нами штаммы Bac.subtilis имеют R или s фенотип (т.е. дают кожистые или гладіше колонии на максимальной питательной среде), то при титровании на них фага j[05 использовали два вида сред. Б первом случае максимальной служила ТУ-ере да, содержащая (на 100 мл): бактотрштона Difco - 0,1 г, дрожжевого экстракта Difco - 0,5 г, NaCl - I г, МпС12 - 10""%. Твердая ТУ-среда содержала 1,3$ агара в нижнем слое и 0,6$ -в верхнем. Во втором случае, когда клетки имели s-фенотип, максимальной средой служил обычный 30%-ный (разбавленный физиологическим раствором) аминопептид Леямясокомбината.
Обнаружение эффектов w -реактивации и w -мутагенеза у УФ-облученного фага
УЕ.СОІІ наиболее убедительные доказательства существования индуцибельной, склонной к ошибкам системы SOS -репарации были получены при использовании в качестве зонда на появление в поврежденных клетках повышенной способности к индукции УФ-му таций УФ-облученного фага Л . Когда в 1974 г. мы приступили к поискам аналогичной системы sos-репарации у Вас.subtilis , уже было известно о существовании эффекта w-реактивации у УФ-облученных фагов AR3 /2/, SP-50, AR1 и AR9 /I/. Однако, попытка установить, не сопровождается ли этот эффект стимуляцией мутагенеза у УФ-облученного фага АЕЗ » оказалась неудачной /2/. Возможно, этот отрицательный результат был связан с неудачным выбором в качестве зонда фага AR3 , У которого аномально высо-ка частота спонтанных с-мутантов (« 10 ). Б силу этого удалось только зарегистрировать увеличение в 2 раза уровня мутагенеза при УФ-облучении внеклеточного фага, но не удалось обнаружить w-мутагенез в условиях заметной f-реактивации. Б качестве объекта мы решили выбрать другой умеренный фаг Вас.subtilis - j&05, о существовании у которого редких спонтанных с-мутантов уже было известно /196/.
Обсуждение результатов и выводы
С использованием умеренного фага 105 мы впервые показали существование у Bac.subtilis склонной к ошибкам, мутагенной, зависящей от ряда гее -генов sos -репаративной системы, индукция которой при УФ-облучении клеток или тепловой обработке мутанта tsi-23 приводит к увеличению уровня УФ-мутагенеза у фага. Эта система оказалась сравнительно неспецифичной, так как она стимулирует мутагенное действие на внеклеточный фаг "репаратив-ных" мутагенов: if -излучения и азотистой кислоты. В то же время она не активна в отношении фиксации мутаций, индуцированных "репликативными" мутагенами (О-метилгидроксиламином, гидроксил-амином и бисульфитом іта ). Используя трансформирующую ДНК, мы обнаружили также, что эта мутагенная система действует не только на внехромосомную ДНК фага 105, но и участвует в фиксации УФ- и -индуцированных мутаций в самой бактериальной хромосоме, в которую предмутационные повреждения попали при интеграции поврежденной in vitro до норной ДНК.
Мутагенная sos -система Bac.subtilis напоминает соответствующую ветвь sos-системы репарации E.coli , но является, по-видимому, менее мощной, так как максимальный уровень с-мутаций у фага 105, облученного УФ-светом, У-лучами и обработанного нщ несколько ниже, чем у инактивированного этими же агентами фага X . Кроме того, у Bac.subtilis в УФ-облученных клетках uvr+ эта система появляется и исчезает быстрее, чем у E.coli . Возможно, именно более преходящий характер УФ-индукции этой системы у Bac.subtilis и объясняет антимутагенный эффект предварительного УФ-облучения клеток сенной палочки /8/, в то время как у E.coli предварительное УФ или -облучение заметно увеличивают потенциал для фиксации мутаций, вызванных реферативными мутагенами /183/. Несмотря на эти различия, мы можем утверждать, что гипотеза Сикара об отсутствии мутагенных sos-систем у трансформируемых видов бактерий /215/ является неправильной.
Трансформируемые производные штамма 168 у Bac.subtilis в полной мере обладают этой системой.
Анализ собственных и литературных данных приводит к выводу, что индуцибельная sos-система Bac.subtilis не менее сложна, чем хорошо изученная sos-система Е.coil . К ее проявлени-ям относятся w-реактивация и w-мутагенез фага JE05 И трансформирующей ДНК, индукция различных профагов и филаментация клеток, индукция синтеза специфических белков в облученных или компетентных клетках. Частичное разобщение эффектов w-реактивации и w -мутагенеза у мутантов гее показывает, что в sos -системе Bac.subtilis имеются две ветви: склонная к ошибкам, мутагенная ветвь, отсутствующая у большинства мутантов rec , и безошибочная ветвь, в той или иной степени сохраняющаяся у этих мутантов.
