Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Перспективы и современные подходы к разработке биопрепаратов на основе живых микроорганизмов 9
1.1. Взаимосвязь нормальной микрофлоры и антиинфекционной резистентности организма 9
1.2. Пробиотики: оценка возможности использования живых микроорганизмов для создания лечебно - профилактических препаратов...20
1.3. Представители бактерий рода Bacillus как арсенал для конструирования эффективных биопрепаратов 35
1.4. Эффективность применения пробиотиков в медицине и сельском хозяйстве: состояние и перспективы 43
Заключение 55
2. Материалы и методы 57
3. Результаты исследований 63
3.1. Конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105 для разработки нового пробиотического препарата 63
3.2. Создание консорциума генетически модифицированных штаммов Bacillus для препарата субалин-форте 75
3.3. Технология получения препарата субалин-форте 84
3.4. Эффективность пробиотика субалин-форте в птицеводстве 95
Обсуждение результатов 105
Выводы 115
Список литературы 116
Приложения 138
- Перспективы и современные подходы к разработке биопрепаратов на основе живых микроорганизмов
- Материалы и методы
- Конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105 для разработки нового пробиотического препарата
Введение к работе
Актуальность темы Основной проблемой последних лет является увеличение числа резистентных к антибиотикам инфекций и снижение эффективности ряда антибиотиков. Распространение бактерий, устойчивых к антибиотикам, влечет за собой массовую аллергизацию больных и развитие дисбактериозов, частота которых быстро растет /Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997, 2000; Митрохин С.Д., 2004/.
В последние годы появились новые подходы к лечению дисбактериозов, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании активных биологических продуктов. Одним из аспектов такого подхода является нормализация измененного микробного пейзажа организма при помощи бактерийных препаратов /Мирошник О.А., 1997; Бондаренко В.М. и др., 1998; Янковский Д.С. и др., 2004/.
В настоящее время в клинической практике в качестве средств лечения и профилактики острых кишечных инфекций, дисбактериозов различной этиологии и стресса широко используются биопрепараты из живых микробных культур - пробиотики. В отличие от антибиотиков, они не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для применения. Основой пробиотиков являются либо микроорганизмы, представляющие нормальную микрофлору, либо не характерные для нормофлоры сапрофиты, способные вытеснять патогенные микроорганизмы из просвета кишечника. Пробиотические штаммы бацилл являются неадгезивными транзисторными представителями микрофлоры кишечника. Некоторые полезные свойства делают их важным арсеналом совершенствования биопрепаратов. Прежде всего, это высокая ферментативная активность, позволяющая им существенно регулировать и стимулировать пищеварение, а также способность оказывать противоаллергенное, антитоксическое действие и повышать неспецифическую резистентность макроорганизма /Сорокулова И.Б., 1998;
Oggioni M.R. et al., 2003; Ouwehand AC. et al., 2003/. Антагонизм в отношении широкого круга патогенных и условнопатогенных микроорганизмов и самостоятельная элиминация из желудочно-кишечного тракта, делает конструирование лечебно-профилактических препаратов из пробиотических бацилл особенно перспективным.
Среди существующих в настоящее время пробиотиков нет высокоэффективных средств, характеризующихся выраженной антивирусной активностью. В то же время известно, что заболевания вирусной и вирусно-бактериальной этиологии составляют значительную часть инфекционной патологии человека и животных. Вирусные инфекции, как правило, осложняются бактериальными и наоборот. Поэтому представляется весьма актуальной проблема разработки средств, характеризующихся одновременно антибактериальными и антивирусными свойствами. Для ее решения пробиотики используют в сочетании с различными иммуностимуляторами, антивирусными веществами и цитокинами, среди которых наиболее широко представлены препараты интерферона. Однако этот подход усложняет технологию производства и повышает цену, что часто делает такие комплексные препараты нерентабельными, поэтому в реальной практике они имеют ограниченное применение.
Альтернативой такому подходу является одно из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов - непосредственная модификация пробиотических штаммов путем клонирования генов антивирусных белков. Это направление в течение ряда лет широко разрабатывается в ГНЦ ВБ «Вектор», где были созданы штаммы микроорганизмов, продуцирующие цитокины, в частности Bacillus subtilis 2335/рВМВ 105, продуцирующий альфа 2 -интерферон /Патент РФ № 1839459/. Созданный на его основе пробиотик Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью обладает антивирусными свойствами /Чудновская Н.В. и др., 1995; Белявская В.А. и др., 2002/. Следует отметить, что штамм В.subtilis ,.: составляющий основу препарата субалин, является
строгим аэробом. А как известно, внутренние полости организма значительно различаются по уровню аэрации и имеют протяженные анаэробные участки. Эту проблему можно решить путем составления микробного консорциума из штаммов, дополняющих свойства друг друга. Поэтому разработка препаратов на основе генетически модифицированных микроорганизмов, способных осуществлять доставку в организм терапевтических белков при оральном введении является весьма перспективной и актуальной задачей.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis, продуцирующего альфа 2 - интерферон для потенциальной его доставки в организм при оральном введении и создание консорциума из рекомбинантных штаммов Bacillus для нового пробиотического препарата. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие ф задачи:
Сконструировать генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis, продуцирующий ИФН-а2 и изучить возможность его использования в качестве вектора доставки целевого белка в организм.
- Сконструировать на его основе микробный консорциум, включив дополнительно ранее созданный штамм B.subtilis для разработки пробиотического препарата с улучшенными свойствами.
- Разработать технологию изготовления препарата и получить опытные партии для проведения испытании.
- Провести испытания эффективности опытных партий препарата в птицеводстве. Научная новизна Впервые сконструирован и подробно исследован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105, кодирующий ген интерферона. Исследован консорциум рекомбинантных штаммов Bacillus и показана перспективность его использования для разработки нового пробиотического препарата с улучшенными свойствами. Разработан пробиотик субалин-форте и исследована его эффективность для повышения хозяйственно-экономических показателей при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк».
По результатам проведенных исследований получены патенты РФ: «Штамм бактерий Bacillus licheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью» (№2172343, 1998) и «Пробиотический препарат комплексного действия» (№2159625, 1999).
Практическая значимость Предложен новый пробиотик субалин-форте для повышения хозяйственно-экономических показателей птицеводства. Сконструирован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105, продуцирующий интерферон, который может быть использован для разработки новых пробиотических препаратов. На основе материалов диссертации разработаны технические условия получения препарата субалин-форте.
Основные положения, выносимые на защиту
- рекомбинантный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ 105, способный к стабильному поддержанию плазмиды, обеспечивающей экспрессию целевого белка с антивирусными свойствами (рекомбинантного интерферона) в условиях in vitro и in vivo;
- генетическая модификация - трансформация плазмидой рВМВ 105 с клонированным геном альфа 2 -интерферона не изменяет полезных свойств реципиентного штамма: антагонистичекой активности против широкого круга патогенных микроорганизмов и безвредности для теплокровных;
- разработана технология поверхностного культивирования рекомбинантных штаммов Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, которая обеспечивает получение опытных партий препарата субалин-форте со стабильными характеристиками; применение препарата субалин-форте повышает хозяйственно-экономические показатели птицеводства.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: VIII международной конференции «Новые направления биотехнологии» (Москва, апрель 1998 г.); VIII международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии (Гурзуф, 2000); международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, май 2000 г.); I международной конференции "Актуальные проблемы производства и переработки продуктов животноводства и птицеводства" (г.Уфа, 2000); международной научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (Краснообск, февраль 2001 г.); 2-м московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г.).
Публикация результатов исследований По теме диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, 1 статья в международном сборнике, 11 работ в материалах российских и международных конференций. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 141 странице. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 205 источников, в том числе 128 иностранной литературы.
Искреннюю благодарность за помощь и поддержку в выполнении данной работы автор приносит д.б.н. Белявской В.А., д.б.н. Масычевой В.И., своим коллегам, принимавшим участие в работе: Ромашевой Н.Г., Алексеевой М.В., а также к.б.н. Лебедеву Л.Р. и д.б.н. Аликину Ю.С. за консультативную помощь и ценные советы при написании данной работы. Автор выражает благодарность к.в.н. Хрусталевой Н.С. за помощь и поддержку в проведении экспериментов по исследованию эффективности препарата субалин-форте в птицеводстве.
Перспективы и современные подходы к разработке биопрепаратов на основе живых микроорганизмов
На заре XX столетия знаменитый русский биолог И.И.Мечников впервые выдвинул идею о ведущей роли микроорганизмов, обитающих в организме человека и животных, в поддержании гомеостаза и в возникновении болезней. Он сформулировал основные положения о наличии связи между продолжительностью жизни, иммунитетом и аутофлорой организма-хозяина, которые остаются актуальными и в наше время /Митрохин С.Д., 2004/. Тесная связь, существующая между нормальной микрофлорой организма и функционированием всех его органов и систем, очевидна. Весь физиологический статус организма теснейшим образом связан с его нормальной микрофлорой.
Нормальная микрофлора организма - совокупность множества микробиоценозов, которые характеризуются определенным составом и занимают определенную экологическую нишу (биотоп) в макроорганизме.
Наиболее сложные микробиоценозы у млекопитающих - микрофлора толстой кишки, рта, носоглотки, более простые - микрофлора поверхности кожи, носовых ходов и гениталий.
Согласно современным воззрениям нормальная микрофлора человека представляет собой некий «экстракорпоративный орган», состоящий из огромного числа микроорганизмов, объединенных в единую экологическую систему. Количество микробных клеток, присутствующих на коже и слизистых оболочках макроорганизма, контактирующих с внешней средой, превышает число клеток всех его органов и тканей вместе взятых. Микробные ассоциации (микробиоценозы), занимающие ту или иную экологическую нишу в организме хозяина, характеризуются сложной иерархической структурой, различными межвидовыми отношениями и многоступенчатыми метаболическими процессами, конечным результатом которых являются биологически активные соединения — микробные метаболиты, которые вносят значительный вклад в физиологию организма хозяина/Бондаренко В.М., 1997; Митрохин С.Д., 2004/.
Нормальная микрофлора человека имеет большое значение не только для поддержания на оптимальном уровне метаболических процессов, протекающих в макроорганизме, но и для создания высокой колонизационной резистентности организма-хозяина по отношению к патогенным микробам /Воробьев А.А. и др., 1997/. Кроме того, нормофлора играет важную роль в обеспечении иммуностимулирующей, витаминобразующей и ферментативной функций организма, снижении содержания холестерина в крови, а также антимутагенном, антиканцерогенном действии и т.д. Однако основная функция нормальной микрофлоры - защитная, так как бактерии-симбионты человека обладают выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным и оппортунистическим микроорганизмам. Она направлена, прежде всего, на подавление колонизации открытых полостей макроорганизма возбудителями и ингибирование транслокации микробов во внутренние органы и ткани хозяина.
Материалы и методы
При создании модельных инфекций были использованы вирусы: герпеса 2-го типа (ВПГ2, гениталий), штамм MS (Государственная коллекция вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г.Москва).
Всего в работе использовали 25 морских свинок, 40 мышей и 31984 цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк». Все манипуляции с животными проводили с (щ применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.
Определение чувствительности к антибиотикам штаммов бацилл проводили диско-диффузным методом и оценивали по зоне подавления роста /БиргерМ.О., 1982/.
Эксперименты по молекулярному клонированию в бациллах проводили согласно /Гловер Д., 1988/. Выделение плазмид из пробиотических штаммов . бацилл проводили, используя стандартный метод щелочного лизиса /Гловер Д., 1988/ с собственными модификациями. Изменения были внесены в параметры (время, температура) инкубации с лизирующими агентами, связанные со структурными особенностями клеточной стенки пробиотических штаммов. На основании проведенных экспериментов была предложена следующая методика выделения плазмид из пробиотических штаммов бацилл:
- выращивали культуру в 5 мл L-бульона в течение 18-20 ч., центрифугировали для осаждения клеток при 5000 об/мин в течение 10 мин; - осадок замораживали (при - 20С) и оттаивали при комнатной температуре не менее трех раз, после чего ресуспендировали в 300 мкл буфера 1 (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис НС1, рН=8,0), содержащего 10 мкг/мл лизоцима и выдерживали во льду до появления вязкости 30-90 мин при периодическом плавном перемешивании;
- при появлении вязкости к раствору добавляли 600 мкл буфера 2 (0,2 М NaOH, 1% SDS) и оставляли при комнатной температуре на 5-10 мин;
- добавляли 450 мкл буфера З (З М ацетат натрия, рН=4,8) и помещали на 10-20 мин в лед;
- после центрифугирования при 12000 об/мин в течение 5 мин супернатант переносили в чистые пробирки и прибавляли этанол в объемном соотношении 1 : 2,5 или равное количество изопропанола, выдерживали при - 20С не менее 30 мин для формирования осадка;
- центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин, осадок растворяли в 50-100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис НС1,1 мМ ЭДТА, рН=8,0);
- добавляли равный объем 5 М хлористого лития, выдерживали 10 мин во льду;
- центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин;
- супернатант переносили в чистые пробирки, добавляли 0,1 объема З М ацетата натрия (рН=4,8) и предварительно охлажденный этанол в объемном соотношении 1 : 2,5 и оставляли не менее, чем на 30 мин (или на ночь) при температуре -20С;
- центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин, осадок подсушивали, промывали 70% этанолом, повторно центрифугировали, промывали 96% этанолом, центрифугировали, подсушивали и растворяли в ТЕ-буфере;
- анализировали с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле.
Определение уровня синтеза интерферона клетками трансформированных бацилл проводили двумя методами: по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита (ЕМК) с использованием культуры клеток диплоидных фибробластов человека (ДФЧ-ДК-58) и иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием коммерческих наборов «ProCon IF2 plus», (г.Санкт-Петербург). Образцы лизатов культуральной жидкости для определения внеклеточного интерферона готовили по схемам, разработанным с учетом известных методик по изучению продукции интерферона и других рекомбинантных белков клетками бацилл /Palva I. et al., 1983/. Определение антивирусной активности интерферона по ингибированию цитопатического действия вируса проводили на монослое клеточной культуры. Суспензию клеточной культуры доводили до концентрации 2x10 кл/мл ростовой средой. В каждую лунку вносили по 100 мкл суспензии клеток и инкубировали в СОг - термостате до формирования монослоя клеток. Затем ростовую среду удаляли и в первую лунку вносили 20 мкл титруемого образца и 180 мкл поддерживающей среды. После осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносили во вторую, смешивали со 100 мкл поддерживающей среды и т.д. Клетки выдерживали при 37С в течение 24 ч. В каждую лунку с обработанным монослоем вносили 100 ТЦПД (тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение в половине проб вируса) и выдерживали при 37 С в течение 24-48 ч. Через 24 ч. Проводили первый учет результатов, через 48 ч. -второй. Расчет титра интерферона производили с поправкой на результаты стандартного препарата - реаферона.
Стабильность плазмид в клетках бацилл изучали в экспериментах in vitro (при пассировании на культуральных средах) и in vivo (путем пассирования через организм мышей) и оценивали по доле клеток, сохранивших исходную плазмиду. После пассажей проводили рассев культуры для получения изолированных клонов на агаризованной среде без антибиотиков. У 100-200 случайно отобранных клонов определяли сохранность фенотипа, детерминируемого наличием плазмиды (Kmr, INF+), для чего с помощью стерильной микробиологической иглы их переносили на агаризованную питательную среду с добавлением антибиотика. После культивирования в течение 24 ч определяли соотношение клонов, сохранивших и утративших устойчивость к антибиотику. Сохранность встройки гена интерферона (структурную стабильность) определяли рестрикционным (по появлению рестрикционного PstI -EcoRI фрагмента длиной 700 н.п.), гибридизационным и ПЦР анализами. Для определения структурной стабильности плазмиды после культивирования, пассирования в условиях in vitro и in vivo проводили гибридизационный анализ на сохранность гена интерферона. В качестве гибридизируемого меченного фрагмента был взят Slal - Hindlll фрагмент ДНК плазмиды рВМВ105, содержащий часть гена интерферона. Вся процедура гибридизации была стандартной /Маниатис Т. и др., 1984/. Стабильность рекомбинантных плазмид в трансформированных штаммах оценивали при пассировании на жидкой питательной среде LB без антибиотика. Для этого 5 мкл ночной культуры исследуемых штаммов вносили в 5 мл свежей питательной среды и оставляли при 37С в термостате до утра. Одно суточное выращивание (пассаж) соответствует примерно 12-14 клеточным генерациям /Denich К. et al., 1993/. Операцию повторяли десятикратно. Через I, 3, 5, 10 пассажей проводили высевы культуры на твердую питательную среду и определяли процентное количество бактерий, сохранивших плазмиду.
Конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105 для разработки нового пробиотического препарата
Плазмида рВМВ 105. В работе была использована плазмида рВМВ105 (рисунок 1), содержащая химико-синтетический аналог гена интерферона человека типа альфа 2 /Колосов В.Н. и др., 1984/. Эта плазмида была сконструирована в ГНЦ ВБ «Вектор» /Красных В.Н. и др., 1984; Щелкунов С. Н., 1986/ и использована при создании штамма и препарата Субалин /Патенты РФ № 1839459, 2035185/.
Структура плазмиды представлена на рисунке 1. Плазмида рВМВ105, сконструированная на основе репликона известной плазмиды pUB ПО /Гловер Д., 1988/, несет маркер устойчивости к антибиотику канамицину (Km) и обеспечивает экспрессию ИФН-а 2 человека.
Рисунок 1. Рестрикционная и генетическая карта плазмиды рВМВ 105 Примечание: Ра - промотор гена альфа-амилазы; SDa - область Шайна-Дальгарно (Shine-Dalgarno); HuIFa2 - ген интерферона альфа 2 человека; KmR - ген устойчивости к канамицину. В качестве бактериального вектора доставки интерферона в организм был выбран пробиотический штамм Bacillus licheniformis 2336. Данный штамм широко применяется в медицине и ветеринарии в составе пробиотических препаратов (биоспорин и бактерин-SL), хорошо изучен и характеризуется полной безвредностью для человека и теплокровных животных, а также окружающей среды /Смирнов В.В., 1993/.
Трансформация штамма Bacillus licheniformis 2336. Для оценки принципиальной возможности использования выбранного нами пробиотического штамма в качестве генно-инженерного реципиента были исследованы его фенотипические свойства, определяющие устойчивость к канамицину. Для этого проводили выращивание на средах, содержащих канамицин и другие антибиотики, которые обычно используются в генной инженерии.
Было показано, что штамм Bacillus licheniformis 2336 чувствителен ко всем исследованным антибиотикам - канамицину, тетрациклину, ампициллину, хлорамфинеколу. Для доказательства отсутствия каких-либо резидентных плазмид были использованы различные методы выделения и анализа /Marmur J., 1961; Клонирование ДНК. Методы, 1988/, позволяющие выявить наличие внехромосомной ДНК с любым молекулярным весом. Полученные данные свидетельствовали об отсутствии резидентных плазмид в штамме В. licheniformis 2336.
