Содержание к диссертации
Введение
1. ДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОНОВ И ЭМИ КВЧ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11
1.1 Основные методы управления метаболизмом 11
1.2 Особенности применения комплексонов для регуляции метаболизма микроорганизмов... 19
1.2.1 Строение, свойства и области применения комплексонов 19
1.2.2 Биологическое действие комплексоіiob 22
1.2.3 Действие комплексонов на микроорганизмы.. 28
1.2.4 Особенности строения и свойства гидрооксиэтилидендифосфоновой кислоты.... 30
1.3 Действие электромагнитного излучения крайне высокой частоты (эми квч) биологические об'ьектбі 32
1.3.1 Общие закономерности и гипотезы о сущности острорезонансного влияния эми па организмы 34
1.3.2 Механизмы генерации клетками когерентных воли 39
1.3.3 Воздействие миллиметровых волн на биологические объекты 43
1.3.4 Воздействие миллиметровых волн на микрооргаі1измбі 49
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57
2.1 Микробиологические объект исследований 57
2.2 Условия поддержания
и хранения микробных кулбтур 58
2.3 Методы и условия культивироваііия 58
2.4 Состав и способ приготовлнііия питательных сред и рабочих растворов 60
2.5 Методы анализа 63
3. Обсуждение результатов 65
3.1 Исследование влияния комплексона на рост микроных культур 65
3.1.1 Действие комплексона ОЭДФ
на бактериальную культуру Bacillus subtllis 65
З.1.1 Введение комплексона на стадии приготовления питательной среды 65
З.1.1.2 Влияние присутствия комплексона в питательной среде на рост бактериальной культуры 70
3.1.1.3 Введение комплексона в готовую питательную среду и его влияние на роет Bacillus suhtilis 71
3.1.2 Действие комплексона ОЭДФ на дрожжевую культуру Sacchuromyces cerevislac 75
3.1.3 Обобщение результатов влияния ОЭДФ на культуру бактерий Bacillus suhtilis D26
и дрожжи Sacchuromyces cercvislae 509 19
3.2 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭМИ МИЛЛИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА НА РОСТ МИКРОБНЫХ КУЛЬТУР 82
3.2.1 Влияние ЭМИ КВЧ в диапазоне частот 53,77-54,57 ГГц на рост Bacillus subtllis 82
3.2.2 Влияние ЭМИ в диапазоне частот 53,77-54,57 1'Гц па дрожжи Sacchuromyces ccrevisiae 87
3.2.3 Влияние ЭМИ КВЧ в диапазоне частот 61,0-63,0 ГГц на бактерии Bacillus subtllis 93
3.2.4 Влияние ЭМИ КВЧ в диапазоне частот 61,0-63,0 ГГц на рост дрожжей Sacchuromyces ccrevisiae 97
4 3.2.5 Обобщение результатов воздействия ЭМИ КВЧ на культуры бактерий Bacillus subtilis 26
и дрожжей Saccharomyces cerevisiae509 100
ОПЫТНО-ПРОМЫШЛЕННЫЕ ИСПЫТАНИЯ 107
ВЫВОДЫ по
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
ПРИЛОЖЕНИЯ 135
- Основные методы управления метаболизмом
- Микробиологические объект исследований
- Исследование влияния комплексона на рост микроных культур
Введение к работе
Актуальності. работы: Микроорганизмы являются неотъемлемой частью производственных процессов, используемых в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве и в биотехнологии. Поэтому стимуляция их роста, улучшение технологических показателей, а также оптимизация процессов культивирования этих микроорганизмов на сегодняшний день представляются актуальными задачами. Решение этих задач имеет огромное практическое значение.
Одним из возможных путей стимуляции роста микроорганизмов является введение в среду хелатируюших агентов. Известна интенсификация процессов метаболизма у микробов при использовании комплексных соединений металлов с биологически активными комплсксонами. Среди многих комплексопов особый интерес представляют бифосфоповые кислоты - структурные аналоги пирофосфата, являющегося природным регулятором кальциевого обмена.
В настоящее время большой интерес представляет комплексом гидрооксиэтилидендифосфоновая кислота (ОЭДФ). Этот комплексен обладает высокой специфичностью взаимодействия с рядом важных катионов, содержит две фосфоновые группы и окспэтильную группу, способные к комплексообразовапию. Кроме того, ОЭДФ разрешена к применению в пищевой промышленности.
Наряду с применением биохимических агентов, актуальным является использование физических фа кто рои для воздействия на росі' и физиологическую активность микроорганизмов, применяющихся в промышленности.
Пристальное внимание в последнее время уделяется рассмотрению возможности использования электромагнитного излучения крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ) миллиметрового
6 диапазона как средства стимуляции биологических процессов. Этот вид излучении может оказывать значительное действие на различные биологические объекты, в том числе и па микроорганизмы. Причем, последние в )том аспекте наименее изучены. При правильном подборе параметров излучения, его применение позволяет существенно расширить возможности регулирования процессами метаболизма у микробных культур. Применение ЭМИ ІСВЧ мм диапазона не оказывает отрицательного действия на окружающую среду, не оставляет токсичных отходов, оно безопасно для жизнедеятельности человека.
Объектами исследований в данной работе явились бактерии Bacillus subtilis и дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Выбор именно этих объектов обусловлен несколькими причинами. Эти микроорганизмы находят широкое применение во многих областях народного хозяйства. Бактерии Bacillus subtilis 26D используются как основа при производстве биологически активного препарата для защиты растений. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae 509 активно применяются в пищевой промышленности, в частности в хлебопечении.
Кроме того, эти микроорганизмы занимают различное таксономическое положение. Бактерии Bacillus subtilis 26D являются представителями прокариотических организмов, а дрожжи Saccharomyces cerevisiae 509 относятся к эукариотам.
Цель работы: Улучшение ростовых и технологических показателей культур дрожжей Saccharomyces cerevisiae 509 и бактерий Bacillus subtilis 26D путем применения комплексона ОЭДФ и Э1МИ КВЧ миллиметрового диапазона. Подбор оптимальных значений концентрации указанного комплексона и оптимальных параметров излучения для последующего внедрения данных методов стимуляции в промышленность.
Научная новизна: Выявлено влияние комплексона ОЭДФ в широком диапазоне концентраций на ростовые и технологические характеристики Bacillus suhlilis 26D и Saccharomyces ccrcvisiae 509.
Впервые проведено изучение влияния ЭМИ КВЧ в широком частотном диапазоне 53,5-54,5 ГГц и 61,0-63,0 ГГЦ на рост бактерий Bacillus suhlilis 26D (прокариоты) и хлебопекарных дрожжей Saccharomyces ccrcvisiae 509 (зукариоты).
Показано, что используемые химический (комплексен ОЭДФ) и физический (ЭМИ КВЧ) факторы могут оказывать на микробные культуры как стимулирующее, так и ипгпбируюшее действие. Характер этого действия зависит от количественной характеристики фактора (концентрация комплексона, частота ЭМИ КВЧ).
Методом ЯМР-релаксометрии проведен структурно-динамический анализ биополимеров клеток, подвергнутых различным воздействиям. Впервые показано, что ЭМИ КВЧ оказывает одновременное влияние на биополимеры, локализованные как в клеточных оболочках, так и в протоплазме. Установлено, что комплексообразующпй агент ОЭДФ в зависимости от концентрации неодинаково влияет на биополимеры клеточных оболочек и протоплазмы.
Практическая значимость: В результате исследований были установлены оптимальные для каждой культуры микроорганизмов концентрации комплексона. Показана возможность успешного применения комплексона ОЭДФ в процессе ферментации бактерий Bacillus sub tills 26D с целью усиления их биологической активности.
Выпушена опытная партия модифицированного препарата для зашиты растений «Фнтоспорип». Проведены опытно-промышленные испытания препарата для защиты растений, па основе бактерий Bacillus suhlilis 26D, выращенных в присутствии оптимальной концентрации комплексона. Выявлено улучшение посевных качеств семян пшеницы, обработанных этим препаратом. При использовании данного препарата
8 в вегетативный период наблюдалось увеличение его фупгицидной активности, что выражалось в снижении пораженноети растений корневыми гнилями, мучнистой росой и бурой ржавчиной.
Показано, что использование ЭМИ КВЧ миллиметрового диапазона для облучения бактерий Bacillus subtilis 26D и дрожжей Succharomyces cerevisiae 509 приводит к улучшению технологических показателей. Данный метод может быть рекомендован для использования в пищевой промышленности п в производстве БАВ.
Выпушена опытная партия модифицированного препарата для защиты растений, посевной материал для которого предварительно был обработан ЭМИ КВЧ со стимулирующей частотой. Результаты полевых испытаний показали целесообразность использования ттого препарата для защиты растении. При обработке семян пшеницы этим препаратом улучшается всхожесть, снижается поражеппость болезнями. 11ри обработке препаратом растений огурцов, гвоздик, калл о в выявлено, что этот препарат обладает высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям корневых гнилей и фптофтороза.
Показано, что применение модифицированного препарата повышает иммунитет растении, увеличивает урожайность овощных культур.
[Выпушена опытная партия хлебопекарных дрожжей, посевной материал для которой предварительно подвергся обработке ЭМИ КВЧ стимулирующей частоты. Отмечено увеличение выхода биомассы дрожжей от потребленной мелассы. Технологические показатели выпущенных дрожжей соответствуют ГОСТу 171-81.
Акты об опытно-промышленных испытаниях приведены в приложениях к диссертационной работе.
Апробация работы: Результаты работы были доложены на девятой Международной конференции молодых ученых «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений»
(Казань 1998), па IX Международной конференции молодых ученых
«Синтез, исследование свойств, модификация и переработка
высокомолекулярных соединений» (Казань 1998), на второй
Межрегиональной конференции «Пищевая промышлеппость-2000»
(Казань 1998), на конференции молодых ученых «Пищевые технологии»
(Казань, 1998), на V Международной научной конференции «Методы
кибернетики химико-технологических процессов» (Казань 1999), на IV
Республиканской конференции «Актуальные 'экологические проблемы
республики Татарстан» (Казань 2000), на второй Межрегиональной
конференции молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань 2001), па
Международной научно-практической конференции «Актуальные
проблемы развития прикладных исследовании и пути повышения их
эффективности в сельскохозяйственном производстве» (Казань 2001), на
конференции «Экологические проблемы города Казани» {Казань 2001),
на первом форуме молодых ученых и специалистов Р'Г (Казань 2001), на
ежегодных отчетных конференциях КГТУ (2001,2004), на первом
форуме молодых ученых и специалистов РТ (Казань 2001), на третьей
Межрегиональной конференции молодых ученых «Пищевые
технологии» (Казань 2002), па объединенной Международной научной
конференции «Новая геометрия природы» (Казань 2003), па научной
сессии Казанского государственного технологического университета
(Казань 2003), па XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной
химии (Казань 2003), па II Московском международном конгрессе
«Биотехнология; состояние и перспективы развития» (Москва 2003), на
Всероссийской научно-технической конференции-выставки
«Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва 2004), на 111 Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2004), па Общероссийской конференции молодых ученых «Пищевые технологии» (Казані- 2005).
10 Объем її сіруктурп работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и библиографического указателя (183 наименования источников). Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включает в себя 9 таблиц, 12 рисунков.
Основные методы управления метаболизмом
Использование широкого спектра лимитирующих и ингибирующих (факторов, изменяющих метаболіті в желаемую сторону, то есть лля сверхспнтеза того пли иного продукта, открывает- пути для максимального усиления желаемой функции и полного использования потенциальных биохимических способностей микроорганизмов! 1-9].
Влиять на процессы метаболизма микроорганизмов можно с помощью как химических, гак и физических факторов. Как правило, химические агенты не являются питательными веществами для роста микробной культуры, но их присутствие может оказывать влияние на состояние клетки, стимулируя пли ингибируя процессы жизнедеятельности.
Влияние химических факторов разнообразно и действие их может проявляться на субклеточном, клеточном и падклеточпом уровнях. Приведем некоторые примеры влияния химических факторов на рост и метаболизм микроорганизмов.
В настоящее время достаточно хорошо извесшы результаты использования химических веществ для регулирования роста микроорганизмов. Особенно широкое применение химические ингибиторы получили в промышленных процессах, связанных с производством продуктов микробного синтеза. В частности, особый интерес в данной области представляют ингибиторы, увеличивающие проницаемость клеточной мембраны.
Так, например, авторами [ ] предложено использовать препарат ли-тических ферментов, образуемых Bacillus sublili.s, для увеличения выхода лизина у Hrcvibacterium.
Довольно часто для регулирования роста микробных культур применяют различного рода ПАВ [ ]. Внесение в среду ПАВ твин- и тпин- приводит к увеличению синтеза u-кетоглутаровой кислоты у Pseuchmonas iwnliqitefaciens - нродуцеїпа кетокислот. Сверхсинтез сіерииов у других микроорганизмов происходит при подавлении роста ингибитором окислительного фосфорилирования или ионизирующими излучениями, но не ингибиторами белкового синтеза [ ]. Использование твин- и олеиновой кислоты при культивировании Coiynebaclerium ghitamicum влияет на биосинтез лизина [ ].
Хорошо известно, что ингибирование роста ионами водорода вызывает у организмов, осуществляющих брожение, увеличение синтеза нейтральных продуктов энергетического метаболизма, а подщелачивание среды - образование ннзкомолскулярных летучих кислот [ ]. Кроме того, много исследований посвящено изучению влияния изменения рН среды па рост, морфологические, физиологические особенности микробных культур [ , , ].
Авторами [ ] изучалось действие ингибитора сорбита натрия на проточную культуру дрожжей Saccharomyccs cerevisiae. В этом случае наблюдается увеличение синтеза продукта брожения - глицерина.
Синтез витамина В і: у пропионовокиелых бактерий увеличивается при ингибировании роста антибиотиками независимо от характера их действия. Подобным образом действует и тиосульфат натрия. Для получения рибофлавина при выращивании Eremothecium ashbyi можно ипгибировать синтез белка фторфепилаланином или нитратом кобальта, при этом синтез витамина продолжается на должном уровне [ ].
Микробиологические объект исследований
Объектами исследований в данной работе япились бактерии Bacillus sitblilis 26 D и дрожжи Saccharomyces cerevisiae 509. Выбор именно этих объектов обусловлен несколькими причинами.
Во-первых, эти микроорганизмы находят широкое применение во многих областях народного хозяйства. Бактерии Bacillus sublllis 261) используются как основа при производстве биологически активного препарата для защиты растении «Фитоспорин». Дрожжи Saccharomyces cerevisiae 509 активно применяются в пищевой промышленности, в частности в хлебопечении.
Во-вторых, как объекты научных исследований они имеют ряд положительных качеств: обладают относительно высокими скоростями роста, не требовательны к субстратам, процессы их метаболизма достаточно хорошо изучены.
Кроме того, при выборе объектов исследования пронимали во внимание обстоятельство, что эти микроорганизмы занимают различное таксономическое положение. Бактерии Bacillus subtilis 26D являются представителями прокариотических организмов, а дрожжи Saccharomyces cercvislae 509 относятся к эукариотам. В связи с этим, представляет интерес наблюдение за поведение этих культур под действием различных факторов.
Поддержание и хранение дрожжевой культуры
В лабораторных условиях дрожжевая культура поддерживалась на скошенном сусло-агаре [163], хранилась в холодильнике при температуре 3-5С. Пересев культуры на свежую питательную среду проводился одни раз в месяц с проверкой чистоты культуры.
Исследование влияния комплексона на рост микроных культур
Одной из наиболее экономически выгодных питательных сред для культивирования Bacillus snblilis является среда на основе пшеничных отрубе ii.
Известно, чю пшеничные отруби представляют собой отход производства и состоят, в основном, из зерновых оболочек. Однако часто они содержат также зародыши и алейроновый слоіі. Из литературных данных известно, что питательные вещества, наиболее ценные в биологическом отношении, сосредоточены в незначительной по массе зародышевой части и в оболочках [167]. Основным компонентом черновых оболочек является клетчатка и гем и целлюлоза [168]. В алейроновом слое и в зародыше довольно высокая концентрация белка, которая может составлять до 22% от общего количества белка зерна [169,170]. Кроме того, минеральные вещества зерна находятся, главным образом, в периферийных частях зерновки, где они играют стабилизирующую функцию [168 J 71].
Таким образом, пшеничные отруби представляют достаточно стойкий комплекс полисахаридов, белков и минеральных веществ, что вызывает необходимое!ь использования дополнительных методов для повышения сіепепи извлечения питательных веществ из отрубей. Принимая во впимапне стабилизирующую роль катионов, в частности катионов кальция, нами была исследована возможность использования для этих целей комплексо-образующего агента ОЭДФ.
Согласно общепринятой методике приготовления питательных сред на основе зерна и продуктов его переработки предусматривается необходимость таких стадии, как заваривание и автоклавирование [168]. В таблице 3.1.1.1 представлены данные о содержании редуцирующих веществ и белка в средах па различных стадиях их приготовления. Анализ полученных результатов показал, что изменение содержания редуцирующих веществ и белка в средах на разных стадиях их приготовления в зависимости от концентрации комплексона происходит неодинаково.
