Введение к работе
Актуальность темы. Bacillus subtilis является вторым по значимости (после E.coli) объектом бактериальной генетики и физиологии и наиболее изученным видом грам-положительных бактерий. Ряд свойств B. subtilis делают ее перспективным объектом генетической инженерии. B.subtilis экологически безопасна: она исходно непатогенна, и организм человека не является для нее постоянным хозяином. B.subtilis не требовательна к условиям роста. Как и другие бациллы, B.subtilis секретирует белки в культуральную среду и служит важным промышленным объектом для получения различных ферментов. Одной из старейших областей применения B.subtilis является использование ее для ферментация соевых бобов; получаемые пищевые продукты широко распространены в странах юго-восточной Азии. Штаммы B.subtilis используются и в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных ДНК и продукции в их клетках чужеродных белков. В сельском хозяйстве используется также способность штаммов B.subtilis подавлять рост патогенов растений.
Для лабораторного штамма B.subtilis 168 была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Kunst et al., 1997). Дальнейшее изучение генетики этой бактерии требует определения нуклеотидных последовательностей и исследования функциональной активности внехромосомных компонентов генома – плазмид и фагов, а также изучения особенностей строения геномов других штаммов B.subtilis, используемых в промышленном производстве и выделяемых из природных источников.
Лабораторный штамм B.subtilis 168 не содержит плазмид. Долгое время в качестве векторов для клеток B.subtilis использовались плазмиды других грам-положительных микроорганизмов - стафилококков и стрептококков. Позже плазмиды были обнаружены в клетках некоторых природных и промышленных штаммов B.subtilis; подавляющее их большинство не влияет на проявление каких-либо заметных свойств бактериальной клетки, т.е. плазмиды являются криптическими.
Многие крупные плазмиды различных микроорганизмов несут гены, определяющие способность бактериальных клеток к конъюгации. До недавнего времени считалось, что основными способами горизонтального переноса генов у B.subtilis являются трансформация и трансдукция. К началу нашей работы была описана лишь одна конъюгативная плазмида из штамма B.subtilis (natto); конъюгация происходила с низкой частотой и осталась практически неисследованной. Таким образом, существовало несоответствие между изученностью и востребованностью B.subtilis и отсутствием сведений о плазмидах этого микроорганизма, а также их участия в процессе конъюгации.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структуры и функций криптических плазмид из коллекций природных штаммов B. subtilis, выделенных из почв Москвы, Московской области и различных районов Белоруссии. Особое внимание было уделено поиску и изучению конъюгативных плазмид B.subtilis.
В задачи исследования входило:
1.Поиск и характеристика криптических плазмид из природных штаммов B.subtilis, относящихся к московской и белорусской коллекциям.
2.Определение нуклеотидной последовательности некоторых мелких плазмид и их фрагментов.
3.Рестрикционный и гибридологический анализ мелких плазмид, позволяющий установить степень их родства и наличие у них тех или иных генов.
4.Поиск в природных штаммах B.subtilis крупных плазмид, способных осуществлять конъюгативный перенос ДНК.
5.Характеристика процесса конъюгации, осуществляемого плазмидами из природных штаммов B.subtilis.
6.Определение нуклеотидной последовательности и изучение строения генов tra-района конъюгативных плазмид из природных штаммов B.subtilis.
Научная новизна. С использованием методов рестрикционного анализа, гибридизации, секвенирования впервые проведено широкомасштабное исследование большого числа мелких криптических плазмид из природных штаммов B.subtilis; охарактеризованы гены плазмид и относительные частоты их встречаемости. У плазмид B.subtilis впервые идентифицированы новые ген (hsp, ген белка теплового шока) и IS-элемент (ISBsu2 семейства IS256).
В природных штаммах B.subtilis обнаружены две плазмиды, способные к конъюгативному переносу ДНК. Одна из обнаруженных конъюгативных плазмид, р19, осуществляет с высокой частотой как мобилизацию мелких плазмид, так и самоперенос в клетки различных видов бацилл; эти особенности плазмиды являются уникальными и делают ее удобным инструментом для дальнейших исследований в области генетики B.subtilis и других бацилл.
Впервые у B.subtilis определена нуклеотидная последовательность части (33,5 тпн из 95 тпн) крупной конъюгативной плазмиды (р19), в том числе значительная часть tra-района (19,9 тпн). Оказалось, что tra-район плазмиды р19 имеет сходство с tra-районами различных грам-положительных микроорганизмов (Clostridium, Bacillus, Listeria, Exiguobacterium), однако отличается от них.
Благодаря полученным в работе данным удалось впервые показать, что конъюгация играет существенную роль в горизонтальном переносе генов у штаммов B.subtilis.
Научно-практическая значимость. Полученные в работе данные о распространении и строении плазмид, содержащихся в штаммах бацилл, могут быть рекомендованы к использованию в работах по генетике, экологии и эволюции микроорганизмов, а также генной инженерии. Данные о распространении ISBsu2 среди штаммов бацилл могут быть использованы для маркирования природных и промышленных штаммов этого микроорганизма. Обнаруженная и исследованная в работе высокоэффективная система конъюгации, определяемая плазмидой р19, может быть использована в лабораторной практике и биотехнологических работах для осуществления переноса плазмидных и хромосомных генов.
Положения, выносимые на защиту.
1.Значительное количество природных штаммов B.subtilis содержит плазмиды, преимущественно мелкие. Мелкие плазмиды имеют генетические модули mob, hsp, rap; частота распространения модулей различна. Мелкие плазмиды, выделенные из различных штаммов, достаточно однородны.
2.В геноме ряда природных штаммов B.subtilis присутствует новый IS-элемент ISBsu2 (семейства IS256).
3.Крупная плазмида р19 из почвенного штамма B.subtilis обусловливает конъюгативный перенос мелких плазмид и самоперенос с высокой частотой в клетки различных видов бацилл.
4.tra-район плазмиды р19 имеет сходство с tra-районами грам-положительных бактерий различных видов, однако отличается от них.
5.Конъюгация играет значительную роль в процессах горизонтального переноса генов у B.subtilis и близких к ней видов бацилл .
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 12-ом европейском совещании по переносу и экспрессии бактериальных генов (Сиена, Италия, 1996); международном конференции по бациллам (Осака, Япония, 1998); 13-ом европейском совещании по трансформации (Кайзерслаутерн, Германия, 1999); международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001); III Съезде ВОГИС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004); международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна (Москва-Пущино, 2006); международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008); съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина, и V съезде ВОГиС (Москва, 2009); научном семинаре отдела генетических основ биотехнологии ИОГен РАН (2009).
По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ.
Благодарности. Я приношу свою искреннюю благодарность сотрудникам и аспирантам лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН, заведующему лабораторией д.б.н., профессору В.Н.Даниленко, моему научному консультанту д.б.н., профессору А.А.Прозорову за помощь и плодотворное сотрудничество; П.Б.Торстеду (Университет г.Бирмингема, Великобритания), С.Брону и С.Хольсаппелю (Университет г.Гронингена, Нидерланды) за совместную работу по определению нуклеотидной последовательности мелких плазмид; сотрудникам ИППИ РАН М.С.Гельфанду и С.А.Родионовой за помощь в анализе нуклеотидных последовательностей. Работа была поддержана грантами INTAS (№ 97-1464); РФФИ (01-04-49497а; 04-04-48078а; 07-04-00911а); РФФИ-БелРФФИ (04-04-81021-Бел2004).
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в разработке плана экспериментов, их осуществлении, анализе и обобщении полученных результатов. Суммарный личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 218 страницах, содержит 43 рисунка и 31 таблицу и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы (включающего 327 источников) и двух приложений.
