Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. серотониновая система головного мозга и агрессивное поведение. генетические аспекты 8
1.1. Общие представления о серотониновой системе мозга млекопитающих 8
1.1.1. Метаболизм серотонина и его важнейшие характеристики 9
1.1.2. Рецепторы серотонина в головном мозге млекопитающих и их функциональное значение 17
1.2. Генетический контроль метаболизма серотонина у млекопшщих 20
1.2.1. Генетический контроль уровня серотонина 20
1.2.2. Генетический контроль активности триптофангид-роксилазы 24
1.3. Генетические аспекты участия серотониновой системы головного мозга в регуляции межсамцовой агрессии у мышей 26
1.3.1. Генетический контроль межсамцовой агрессии у мышей 27
1.3.2. Участие серотонина головного мозга в регуляции межсамцовой агрессии у мышей 33
Глава II.- Материалы и методы 39
2.1. Условия содержания экспериментальных животных . 39
2.2. Генетический анализ 40
2.3. Изучение агрессивного поведения 41
2.4. Биохимические методы 45
2.5. Введение фармакологических препаратов 56
2.6. Статистическая оценка полученных данных 57
Глава III. Результаты собственных исследований 60
3.1. Генетический контроль серотониновой системы голов ного мозга у мышей 60
3.1.1. Закономерности генетического контроля уровня се-ротонина 60
3.1.2. Закономерности генетического контроля активности триптофангидроксилазы в головном мозге 65
3.1.3. Генетическая корреляция между активностью триптофангидроксилазы и содержанием серотонина 81
3.2. Генетический контроль "спонтанной" агрессивности у мышей 84
3.2.1. Межлинейные различия в "спонтанной" агрессивности мышей 85
3.2.2. Наследование интенсивности "спонтанной" агрессии 87
3.2.3. Наследование уровня "спонтанной" агрессивности 91
3.3. Анализ участия серотониновой системы в регуляции "спонтанной" агрессивности у мышей 94
3.3.1. Генетические аспекты участия серотониновой системы головного мозга в регуляции агрессивного поведения 94
3.3.2. Анализ участия серотониновых рецепторов головного мозга в регуляции уровня агрессивности 97
Глава ІV. Обсуждение результатов 102
Выводы 118
Список цитируемой литературы
- Общие представления о серотониновой системе мозга млекопитающих
- Генетический контроль метаболизма серотонина у млекопшщих
- Условия содержания экспериментальных животных
- Генетическая корреляция между активностью триптофангидроксилазы и содержанием серотонина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Серотониновая система головного мозга, т.е. система нейронов, медиатором в которых является оеротонин, участвует в регуляции ряда форм поведения, в том числе и внутривидовой агрессии самцов (Попова, Науменко, Колпаков, 1978), играющей существенную роль в определении генетической структуры популяций многих видов позвоночных.
Однако сведения о характере влияния серотониновой системы мозга на проявление данной формы поведения довольно противоречивы (Попова, Науменко, Колпаков, 1978; Daruna, 1978). Генетическая корреляция между функциональной активностью се-ротониновых нейронов и особенностями агрессивного поведения вообще не изучалась.
Это обусловлено в первую очередь слабой изученностью генетического контроля серотониновой системы мозга. В настоящее время бесспорно лишь одно, что эта система находится под генетическим контролем. Это заключение основывается главным образом на результатах изучения межлинейных различий в содержании медиатора (Дорофеев, Подсосов, 1971; Попова, Кудрявцева, Лубсанова, 1978; Valzelli, Bernasconi, 1979) и В активности ключевого фермента его биосинтеза - триптофангидроксилазы ( Barchas et al. , 1974; Diez et al., І976в; Natali et al., 1980) в различных структурах головного мозга мышей. Однако закономерности наследования этих признаков изучены слабо и данные по ним противоречивы ( Schiesinger et al., 1965; Diez et al. , 1976B; Valzelli, Bernasconi, 1979; Nat all et al. , 1980).
Другой причиной, тормозящей выявление генотипической связи между серотониновой системой и внутривидовой агрессией самцов,является то, что генетический контроль агрессивного поведения изучен в основном на модели агрессивности, вызванной длительной изоляцией самцов мышей, которая является скорее патологической (Valzelli, 1973; Пошивалов, 1974), чем естественной ("спонтанной") формой этого поведения. Генетический контроль "спонтанной" агрессивности мышей изучен весьма слабо, а участие серотонина в ее регуляции вовсе не исследовано. Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было выявление закономерностей наследования таких характеристик серотониновой системы мозга, как активность триптофангид-роксилазы и уровень серотонина, а также выяснение роли серотониновой системы мозга в реализации агрессивного поведения у мышей. Были поставлены следующие задачи:
1. Определить закономерности генетического контроля уровня серотонина и активности триптофангидроксилазы в мозге у мышей.
2. Установить наличие генетической регуляции естественной ("спонтанной") агрессивности самцов мышей и изучить закономерности ее наследования.
3. Выяснить характер влияния серотониновой системы на проявление "спонтанной" агрессивности.
4. Установить,существует ли генетически обусловленная связь между "спонтанной" агрессивностью мышей и особенностями их серотониновой системы мозга.
Научная новизна. Среди исследованных линий мышей выделены две группы линий, животные которых резко различаются по активности триптофангидроксилазы в мозге. Фермент, выделенный из мозга мышей этих двух групп линий, существенно различается по кинетическим характеристикам: константе Михаэлиса и максимальной активности. Отмечено промежуточное наследование активности триптофангидроксилазы у гибридов первого поколения. Характер распределения значений цризнака у гибридов второго поколения можно описать гипотезой о его контроле одним аутосомным двухаллельным локусом.
Впервые выявлены некоторые закономерности генетического контроля спонтанной агрессивности мышей и показано, что такие ее показатели,как уровень агрессивности, отражающий высоту порога агрессивной реакции и интенсивность агрессии,характеризуют разные стороны агрессивного поведения и контролируются различными генетическими механизмами. Интенсивность агрессии наследуется как аддитивный аутосомный признак. При наследовании уровня агрессивности наблюдается доминирование и даже сверхдоминирование высокой выраженности признака.
Обнаружена высокая положительная межлинейная корреляция между активностью триптофангидроксилазы в мозге и интенсивностью агрессии у мышей. Впервые показана различная роль рецепторов серотонина первого и второго типа на проявление уровня агрессивности у мышей.
Научно-практическая ценность. Настоящее исследование позволяет глубже понять генетическую регуляцию важнейшей меди аторной системы головного мозга млекопитающих и подойти к выяснению одного из путей генетической детерминации сложных форм поведения. Полученные данные о различных эффектах стимуляции серотониновых рецепторов разного типа в регуляции агрессивного поведения позволяют объяснить противоречивое и "многоликое" действие серотонинэргических препаратов на поведение и психику, наблюдаемое в лабораторных исследованиях и клинике.
Разработанный метод определения активности триптофангид-роксилазы может использоваться для лабораторных и ішшических исследований этого фермента. Сконструированный совместно с B.C. Макаренко этограф позволяет значительно упростить и улучшить изучение различных форм поведения.
Соавторство. Представленные в настоящей работе данные получены самим автором. Проверка гипотезы о моногенном наследовании активности триптофангидроксилазы в мозге проведена совместно с к.б.н. Э.Х. Гинзбургом, Разработка и конструирование этографа выполнены совместно с инженером B.C. Макаренко. Это отражено в соответствующих публикациях.
Апробация работы. Материал был доложен и обсужден на XIII съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.Н. Павлова (секция "Генетика высшей нервной деятельности"), Алма-Ата, 1979, и на ХХУІ Совещании по проблемам высшей нервной деятельности, Ленинград, 1981.
Объем работы. Материал диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, включая 20 рисунков и 17 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 272 источника, в том числе 219 иностранных.
Общие представления о серотониновой системе мозга млекопитающих
В головном мозге млекопитающих существует специфическая система нейронов, роль медиатора в которых выполняет серото-нин (Dahlstrom et al#,I973; Cooper et al#, 1974; Буданцев, 1976) Функционально серотониновые нейроны можно разделить на две большие группы (рис. I).
К первой группе относятся нейроны, тела которых расположены в продолговатом мозге, а аксоны входят в состав булъбо-спи-нального пути ( Dahistrom, Fuxe, 1965). Вторую группу составляют нейроны, тела которых локализованы в ядрах шва среднего мозга, дающие начало системе восходящих нервных волокон ( Dahistrom, Fuxe, 1964), причем нейроны, берущие начало в дорзальном ядре, инервируют кору полушарий и стриапаллидар-ную систему, в то время как нейроны, начинающиеся из медианного ядра, - кору и лимбическую систему ( Bobiiier et al., 1975; Geyer et al., 1976).
В серотониновом нейроне происходит синтез серотонина в перикарионе, транспорт его вдоль аксона ( Dahistrom et al., 1973; Буданцев, 1976), накопление медиатора в нервных окончаниях ( Neckers et al., 1976), выделение его в синаптическую щель в ответ на нервный импульс ( Anden et al., 1964; Cooper et al., 1974), обратный захват выделившегося биогенного амина ( Kuhar et al., 1972; Snyder et al., 1973) И, наконец, окислительное дезаминирование серотонина (Буданцев, 1976).
Метаболизм серотонина и его важнейшие характернетики
Источником для синтеза серотонина является незаменимая аминокислота L -триптофан. Количество триптофана, поступающего с пищей, невелико (Рудзит, 1973) и концентрация свободной аминокислоты в крови и тканях недостаточна, чтобы вызвать насыщение механизмов, транспортирующих триптофан в нейрон и превращающих его в серотонин. В самом деле, введение триптофана В организм С пищей ( Green et al., 1962; Wurtman, Pern-strom, 1972; Pernstrom, Wurtman, 1974), внутрибрюшинная инъекция этой аминокислоты ( Moir, Eccleston, 1968; Grahame
Smith, 1971; Fernstrom, Wurtman, 1971, 1974; Baber et al., 1979) или же её внутримозговое введение ( Consolo et al., 1965) вызывали существенное увеличение содержания серотонина и усиливали его обмен в головном мозге. Напротив, диета, обедненая триптофаном, вызывала падение содержания серотонина и уменьшала интенсивность его метаболизма в мозге ( Gal,
Drewes, 1962; Biggio et al., 1974; Kantak et al., 1980). Триптофан проникает в нейрон с помощью двух механизмов: с высоким (Кг Ю М) и низким (10 10-) сродством к аминокислоте ( Knapp, Mandell, 1972а, 1973а; Mandell et al., 1974;
Diez et al., 1976c). Считают, что первый механизм связан с функционированием аминокислоты как медиатора, в то время как второй - с её участием в синтезе белка ( Bennett et al., 1972; Mandell et al., 1974). Воздействия на механизм захвата триптофана приводят к изменению в интенсивности синтеза и накопления серотонина ( Glowinski et al., 1973; Hamon, Glowinski, 1974; Hamon et al.., 1974; 1977; Hery et al., 1974; Mandell, Knapp, 1977). Однако несмотря на всю свою важность для синтеза серотонина, процесс транспорта триптофана в серотониновый нейрон, вероятнее всего, не является специфическим для этого типа нейронов. Так, ряд аминокислот способны эффективно конкурировать с триптофаном за механизм захвата нейроном ( Pernstrom, Wurtman, 1974). Разрушение ядер шва среднего мозга, приводящее к дегенерации окончаний серотониновых нейронов в переднем мозге, не изменяло интенсивности поглощения триптофана синаптосома-ми, выделенными из этого отдела ( Kuhar et al., 1972).
Синтез Синтез серотонина из триптофана происхо-серотонина дит в два этапа (риСв Z), На первом этапе аминокислота гидроксилируется до 5-гидрокситриптофана. Этот процесс катализирует фермент трип-тофангидроксилаза. На втором этапе фермент 5-гидрокситрипто-фандекарбоксилаза декарбоксидирует 5-гидрокситриптофан, превращая его в серотонин.
Генетический контроль метаболизма серотонина у млекопшщих
По-видимому, впервые межлинейные различия по содержанию серотонина в головном мозге были показаны на мышах линий C57BL/6 и BALB/c (Caspari, I960; пит. noMaas, 1962). К настоящему времени обнаружено, что многие линии различаются по уровню этого биогенного амина как в целом мозге,так и в отдельных его образованиях, таких как гиппокамп, ствол и кора больших полушарий (табл. I). Следует отметить, что разные исследователи приводят часто сильно отличающиеся оценки содержания медиатора у животных одной и той же линии. Более того, в работах разных авторов варьирует и относительное содержание биогенного амина у мышей различных линий. Так, Дорофеев и Подсосов (1971) обнаружили вдвое более высокую концентрацию серотонина в мозге у мышей линии DBA/2 по сравнению с животными линии C57BL/6, в то время как другие авторы, наоборот, отмечают более высокое содержание биогенного амина в мозге у мышей последней линии (Valzelli, Bemasconi, 1979) или же вообще не регистрируют различий между этими линиями по данному признаку (Но, Tsai, 1975; Pickett, Collins, 1975; Middaugh, Zemp, 1976).
Это сильно затрудняет сравнение результатов, полученных разными авторами, и выявление генотипического разнообразия по этому признаку. Поэтому особую ценность представляют сравнения, проводимые одновременно на нескольких линях, поскольку они (если число линий достаточно велико) дают возможность судить о величине генотипического полиморфизма данного признака. Полученные данные, несмотря на некоторое несовпадение в абсолютных значениях уровня медиатора, свидетельствуют о значительных межлинейных различиях, а, следовательно, и о существенном вкладе генотипа в определение уровня серотони-на в головном мозге у мышей. Действительно, с помощью дисперсионного анализа было показано, что разнообразие в уровне медиатора в стволе головного мозга у мышей инбредных линий в значительной мере определяется межлинейными различиями (Попова с соавт., 1978а).
Сведения о характере наследования этого признака довольно скудные и противоречивые. С одной стороны, отмечено проме -жуточное наследование уровня серотонина у гибридов первого поколения между линиями DBA/2 и C57BL/6 (Schlesinger et al., 1965). С другой стороны, на тех же линиях обнаружено доминирование низкой концентрации медиатора (Valzelli, Вег-nasconi, 1979). Возможно, эти противоречия объясняются тем, что первые исследователи измеряли этот признак у молодых животных, в то время как вторые - у взрослых особей.
Гораздо лучше изучен генетический контроль содержания серотонина в крови» По этому признаку наблюдаются очень значительные межлинейные различия (Дорофеев, Подсосов, 1971; Попова с соавт., 1978а), что облегчает проведение его детального генетического анализа. С помощью диаллельного анализа, проведенного на трех линиях мышей - C57BL/6, DD И BALB/c (Кудрявцева, 1981; Кудрявцева, Сирота, 1981), и гибридологического анализа, осуществленного на линиях сс57Вг и DD (Кудрявцева, 1981), было показано, что содержание биогенного амина в плазме крови наследуется в основном аддитивно. Однако при скрещивании линий BALB/c и DD было отмечено доминирование высокого уровня медиатора (Кудрявцева, Сирота, 1981). Авторы считают, что содержание серотонина в плазме крови контролируется рядом локусов, имеющих аллели как с аддитивным, так и с доминантным эффектами (Кудрявцева, 1981). Исходя из характера распределения значений этого признака у гибридов второго поколения между линиями сс57Вг и DD, было сделано предположение о небольшом числе локусов, контролирующих концентрацию серотонина в плазме крови.
Условия содержания экспериментальных животных
Опыты проводились на половозрелых самцах мышей инбред-ных линий и гибридах. Все животные были в возрасте 2-3 месяцев. Общее число исследованных животных составляло 730.
Мышей в возрасте одного месяца отсаживали от матерей и содержали по 10 особей в клетках размером 50x30x15 см до возраста 2-3 месяцев. Животные содержались при естественном освещении в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО АН СССР. Полноценный корм и вода давались без ограничений.
За 2-3 дня до начала экспериментов животных рассаживали в отдельные клетки размером 50x30x15 см, чтобы снять влияние группового эффекта. Известно, что данный срок достаточен, чтобы исключить влияние зоосоциального стресса (Науменко с соавт., 1971), но недостаточен, чтобы вызвать развитие "изоляционного синдрома", который обычно развивается к четвертой неделе изоляции (Valzelli, 1973; Пошивалов, 1974),
Половозрелые самцы белых аутбредных мышей, весящие около 25 г, использовались как тесторы при определении агрессивного поведения у самцов мышей инбредных линий и гибридов. Аутбредные животные содержались в стандартньк условиях по 10 особей в клетках размером 50x30x15 см. Отдельный самец использовался как тестор не более пяти раз.
В работе использованы следующие генетические методы: I) изучение межлинейных различий, 2) гибридологический анализ и 3) диаллельный анализ.
Межлинейные различия изучались на самцах мышей следующих инбредных ЛИНИЙ: C57BL/6, ВАЬВ/с, DD, СЗН/Не, СС57Вг, А/Не, AKR/j, DBA/1, A/Y, УТ, СВА, РТ. Все эти линии разводились в условиях тесного брат-сестринского инбридинга в течение десятков поколений в виварии Института цитологии и генетики СО АН СССР.
Для получения гибридов в клетки размером 50x30x15 см помещали три самки и одного самца. Непосредственно перед родами самца и не покрытых самок отсаживали от беременных. Пометы от нескольких самок не дифференцировались и содержались в одной клетке с матерями в течение всего периода вскармливания.
Агрессивное поведение у самцов мышей включает определенные стериотипные поведенческие акты, наиболее характерными из которых являются подергивание хвостом, атаки, укусы и преследование противника (Scott, Fredericson, 1951; Grant, Mackintosh, 1963; Пошивалов, 1974). Все эти поведенческие акты легко могут быть идентифицированы, так что проявление агрессивного поведения можно установить однозначно.
Обычно агрессивное поведение самцов мышей измеряют, ссаживая двух тестируемых самцов в незнакомую для них обоих (нейтральную) клетку. Однако, в отличие от большинства исследований, в которых изучалась агрессивность, вызванная длительной изоляцией самцов мышей, проявляющаяся достаточно -сильно, в наших опытах работа велась с естественной ("спонтанной") формой агрессивного поведения, выраженной гораздо слабее, чем индуцированная длительной изоляцией, и практически не проявляющейся при ссаживании самцов на нейтральной территории. Чтобы преодолеть это препятствие, мы определяли агрессивное поведение в домашней клетке тестируемого самца. Защита территории являлась дополнительным мотивационным фактором, побуждавшим тестируемого самца нападать на подсажен--ную мышь.
Для оценки агрессивного поведения в клетку с тестируемым самцом ("хозяином") подсаживали самца белых аутбредных мышей ("чужака"). Время тестирования ограничивали 10 минутами. Регистрировали первое нападение тестируемого самца на подсаженную мышь, и затем в течение двух минут определяли число нападений на "чужака" и общее время драк, т.е. суммарное время (в сек), в течение которого "хозяин" боролся с "чужаком". Использование фиксированного интервала драк (2 мин) позволяет сопоставлять интенсивность агрессивного поведения у мышей с различным латентным периодом агрессивной реакции. Тестируемые самцы, не проявлявшие агрессивного поведения в течение 10 мин, квалифицировались как неагрессивные.
Обычно в наших экспериментах "чужак" не нападал на тестируемого самца и часто даже не защищался, будучи атакован. Те редкие случаи, когда подсаженный самец все же первым нападал на "хозяина", мы исключали из последующего рассмотрения, а "чужака" выбраковывали.
Генетическая корреляция между активностью триптофангидроксилазы и содержанием серотонина
Для проверки этого предположения изучалась взаимосвязь между данными признаками у гибридов второго поколения между линиями ВАЪВ/с и C57BL/6. Выше было показано, что у гибридов второго поколения в результате расщепления появляются животные с генетически детерминированной низкой, высокой и промежуточной активностью фермента. Оказалось, что у животных с высокой активностью фермента в стволе наблюдается его высокая активность в полушариях и, наоборот, у мышей с низкой активностью ТПГ в стволе отмечена низкая ее активность в полушариях (рис. 15). Коэффициент корреляции между этими признаками у гибридов второго поколения высок (г = 0,79; Р 0,01). Б то же время у гибридов первого поколения между линиями BKLB/c и C57BL/6 корреляция между активностью фермента в этих отделах головного мозга отсутствует (г = 0,22; Р " 0,05). Известно, что гибриды первого поколения между инбредными линиями являются изогенными и все фенотипическое разнообразие признака у них обусловлено средовыми воздействиями (паратипическая вариабельность). Этот факт свидетельствует в пользу того, что корреляция между активностью трипто-фангидроксилазы в стволе и в полушариях головного мозга у гибридов второго поколения генотипическая, а не паратиіжчес-кая. Активность фермента в этих двух отделах контролируется, по-видимому, одними и теми же генетическими факторами.
Поскольку ТПГ является ключевым ферментом биосинтеза серотонина, можно предположить, что гены, контролирующие ее активность, до некоторой степени определяют уровень медиатора. Одним из способов проверки этого предположения является изучение генетических корреляций между данными признаками -уровнем серотонина и активностью триптофангидроксилазы. Было установлено, что содержание серотонина в полушариях головного мозга и активность фермента в стволе у гибридов второго поколения между линиями BALB/c и C57BL/6 коррелируют между собой (г = 0,31, р - .0,05). Корреляция между этими признаками у гибридов второго поколения может быть как генотипическои, так и паратипической, обусловленной одинаковым мо-дификационным действием средовых условий на эти признаки. Однако коэффициент корреляции между активностью триптофангидроксилазы в стволе и уровнем медиатора в полушариях мозга у изогенных гибридов первого поколения не достоверен (г = = -0,11, р р 0,05), что свидетельствует об отсутствии паратипической корреляции между данными признаками. Таким обра-зом корреляциязнаблюдаемая между активностью фермента в стволе и концентрацией биогенного амина в полушариях мозга у гибридов второго поколения,является, в основном, генотипическои. Генетически детерминированная связь между этими признаками, по-видимому, не является характерной для всех линий мышей. Не обнаружена межлинейная корреляция между активностью триптофангидроксилазы в стволе и содержанием серотонина в полушариях у мышей (г = 0,43, Р 0,05). В самом деле, мыши линий DBA/1 и СВА9 вдвое различающиеся по активности фермента в стволе, имеют одинаковое содержание биогенного амина в полушариях. У животных линии А/Не, характеризующихся низкой активностью фермента; отмечается очень высокий уровень серотонина.
В качестве модели для изучения генетического контроля внутривидовой агрессии самцов была выбрана естественная ("спонтанная") форма агрессивного поведения. Термин "спонтанная" ни в коем случае нельзя понимать как немотивированная, поскольку она возникает в ответ на вполне определенный стимул - присутствие другого самца. Этот термин, таким образом, используется, чтобы отличить данную модель от таких форм агрессивного поведения как агрессия, вызванная длительной изоляцией, болью и т.п.
Наличие собственной территории резко усиливает агрессивность самцов мышей. Стимулом, вызывающим агрессивную реакцию, в данном случае, является присутствие чужого самца на территории. Поведение мыши, прогоняющей "чужака" со своей территории, по-видимому, существенно не отличается от борьбы двух самцов за установление иерархии, однако более выражено.
Исследуемые самцы ведут себя различно по-отношению к подсаженному самцу: некоторые животные не проявляют агрессивности и ограничиваются обнюхиванием, а иногда грумингом "чужака", другие после более или менее продолжительного латентного периода начинают подергивать хвостом, нападать и кусать "чужака", а если последний убегает, то и преследовать его.
Спонтанную агрессивность у мышей оценивали по ее уровню - доле агрессивных животных в линии.-и по интенсивности - выраженности агрессивного поведения. Последнюю характеризовали по числу нападений, совершенных исследованным самцом на "чужаками по длительности драк.
Похожие диссертации на Генетические аспекты метаболизма серотонина в мозге у мышей и его участие в регуляции агрессивного поведения
