Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Общая морфофункциональная организация обонятельного анализатора млекопитающих 9
1.1.1. Обонятельная выстилка 9
1.1.2 Обонятельные рецепторы млекопитающих 11
1.1.3. Трансдукция и кодирование сигнала в обонятельных сенсорных нейронах 18
1.1.4 Основная обонятельная луковица (ООП) 21
1.1.5 Проекции основной обонятельной луковицы 26
1.1.6 Кодирование обонятельного сигнала в ООП 28
1.1.7. Вомероназальный орган 30
1.1.8. Вомероназальные рецепторы 31
1.1.9 Дополнительная обонятельная луковица 34
1.1.10 Конвергенция и синергизм ДОС и ООС 35
1.1.11 Другие хемосенсорные образования носовой полости у млекопитающих 37
1.2 Химические сигналы позвоночных 39
1.2.1. Виды химических сигналов 39
1.2.2. Андростенон 42
1.3. Роль химических сигналов в агрессивном поведении млекопитающих 45
1.3.1 Агрессивное поведение 45
1.3.2. Генетические детерминантымежсамцовойагрессии 46
1.3.3. Участие обонятельной системы в регуляции межсамцовой-агрессии... 52
1.3.4. Химические сигналы, влияющие на межсамцовую агрессию 54
Глава 2. Материалы и методы 56
2.1 Общая схема работы 56
2.2. Методы тестирования поведения 57
2.2.1 Определение порогов чувствительности к андростенону 57
2.2.2 Оценка уровня межсамцовойагрессии 59
2.2.3 Исследование предпочтения запахов мочи 60
2.2.4 Тест «открытое поле» 61
2.2.5 Статистические методы обработки поведенческих экспериментов 61
2.3. Хирургическое удаление вомероназального органа 61
2.4. Материал и методы исследований локализации нейрональной активности в обонятельной системе 62
2.4.1 Экспозиции животных к андростенону и контрольным одорантам 62
2.4.2 Приготовление и окрашивание срезов 63
2.4.3 Анализ Fos-иммунореактивности 65
2.5. Определение содержания гормонов методом твердофазного иммуноферментого анализа 66
2.5.1 Иммунохимическое определение содержания тестостерона и кортикостерона в плазме крови после экспозиции к андростенону 66
2.5.2. Статистические методы обработки 67
2.6. Генетический анализ чувствительности к андростенону и межсамцовой агрессии 67
2.6.1 Получение гибридов 68
2.6.2 Фенотипирование животных 69
2.5.1 Анализ фенотипов 70
2.5.4. Генотипирование животных с использованием ДНК маркеров 70
2.5.5 Анализ ассоциаций между фенотипами и генотипами 72
Глава 3. Результаты и обсуждение 76
3.1. Генетический анализ признаков чувствительности к андростенону \м параметров межсамцовой агрессии 76
3.1.1. Анализ фенотипов родительских линий и гибридов первого поколения 76
3.1.2. Анализ фенотипов второго поколения гибридов 85
3.1.3. Анализ ассоциаций фенотипов и генотипов второго поколения гибридов, определенных с использованием ДНК маркеров 93
3.1.4. Обсуждение 113
3.2 Участие дополнительной обонятельной системы в рецепции андростенона у домовой мыши 117
3.2.1 Удаление вомероназального органа 117
3.2.2. Исследование нейрональной активации в ВНО в ответ на стимуляцию андростеноном 118
3.2.3 Обсуждение 121
3.3. Влияние андростенона на некоторые поведенческие и гормональные показатели у домовой мыши 123
3.3.1. Тест на межсамцовую агрессию 123
3.3.2. Влияние длительных экспозиций к андростенону на ряд поведенческих показателей 126
3.3.3. Влияние экспозиций андростенона на содержание основных стероидных гормонов в плазме крови 128
3.3.4. Обсуждение 130
Заключение 133
Выводы: 139
Список литературы 141
- Обонятельные рецепторы млекопитающих
- Конвергенция и синергизм ДОС и ООС
- Определение порогов чувствительности к андростенону
- Анализ фенотипов родительских линий и гибридов первого поколения
Введение к работе
Актуальность проблемы. Агрессивное поведение играет важную роль в процессах адаптации животных к окружающей среде. Межсамцовая агрессия у домовой мыши во многом определяет характер отношений доминирования-подчинения, организацию популяционной структуры и характер избирательности скрещивания, как в естественных местообитаниях домовой мыши, так и в лабораторных популяциях (Poole, Morgan, 1973, Новиков, 1988). Сходство ряда элементов агонистического поведения человека и животных свидетельствует об их общих биологических основах.
Участие химических сигналов в регуляции различных типов.социального, в том числе и агрессивного поведения, было продемонстрировано для различных видов млекопитающих (Halpern, Martinez-Marcos, 2003, Brennan, Kendrick, 2006). В современном представлении, химические сигналы млекопитающих, к которым относят и феромоны, представляют собой отдельные химические вещества или смеси, выделяемые одной особью и оказывающие влияние на другую особь того же вида, т.е. участвующие в коммуникации (Johnston, 2000). Моча домовой мыши является естественным источником хемосигналов, оказывающих влияние на агрессивное поведение, причем феромональный- сигнал имеет андроген-зависимый характер (Mugford, Nowell, 1970, Novotny, et al., 1985, Novotny, et al., 1990, Novikov, 1993, Chamero, et al., 2007). Вещества-стероидной природы, как метаболиты гормонов, циркулирующих в организме особи; могут быть рассмотрены как кандидаты на роль естественных хемосигналов в регуляции социального поведения домовой мыши (Zahavi, 1975, Ingersoll, Launay, 1986, Nodarl, et al., 2008). За последние десятилетия из мочи домовой мыши был выделен ряд химических соединений нестероидной природы, участвующих в регуляции агрессивного поведения, однако ни одно из этих веществ не имитирует полностью хемосигналмочи (Novotny, et al., 1985, Chamero, et al., 2007).
В качестве модельного одоранта в наших исследованиях был использован стероид гонадного происхождения андростенон (5о>андрост-16-ен-3-он), наиболее известный как половой феромон хряка, вызывающий немедленный поведенческий ответ у рецептивной самки свиньи (Reed, et al., 1974). Андростенон является и кандидатом на роль модуляторного феромона у человека (Cowley, et al., 1977, Filsinger, et al., 1984, Pause, 2004). У 30-50% в популяции людей наблюдается специфическая аносмия к андростенону, т.е. неспособность распознавать именно
этот запах.на фоне, нормальной чувствительности к другим одорантам(1аЬо\л/э, Wysocki, 1984). Функциональное значение этой, одной- из^ самых распространенных у человека, аносмии. неясно. Специфические хемодефициты вызывают огромный исследовательский интерес, предоставляя возможность связать обонятельную.функцию с конкретными рецепторами и генами (Griff, Reed, 1995, Keller, etal., 2007).
Лабораторная мышь является, превосходным модельным организмом для исследований в области генетики и биомедицины человека (Silver, 1995). 90% генов, человека имеет свои гомологи у мыши, и, соответственно; наоборот. Прочтение первичной последовательности- генома мыши было в черновом' варианте завершено в 2002 году (Waterston, et al:, 2002), однако, дополнение и аннотация нуклеотидных последовательностей, продолжается'и по сей день, что отражается» в постоянном1 обновлении- специализированных баз. данных (например, MGI, NCBI). Актуальность исследований налабораторных мышах роли химических сигналов в регуляции агрессивного поведения не вызывает сомнений. Метод картирования локусов количественных* признаков, основанный на анализе ассоциаций:между, молекулярными генетическими -маркерами» и фенотипическими признаками, является, важным инструментом* для реализации общего генетического подхода к идентификации генов, контролирующих признак, по пути «от фенотипа к гену». Генетическая модель специфической аносмии к летучим стероидам* (на примере андростенона) была разработана при сотрудничестве, научных, групп Ч. Вайсоки и В.В. Вознесенской на основе 2-х инбредных линий мышей NZB/B1NJ* и. CBA/J, высококонтрастных по этому признаку (Voznessenskaya, et а\:, 1995). Малочувствительные к андростенону мыши линии NZB/B1NJ имеют очень высокий уровень агрессивности по сравнению со. многими другими инбредными линиями. (Roubertoux, Carlier, 1988; Roubertoux, et al., 2005) и, в частности, с CBA/J (Voznessenskaya, Wysocki, 2000). Согласно нашей гипотезе, хемодефицит к летучим стероидам у домовой мыши может приводить к ошибкам в распознавании запахового сигнала; несущего информацию о половой принадлежности и социальном статусе, что, в свою очередь, может служить одной из причин проявления избыточной межеамцовой агрессии.
Цель исследования. Целью данной работы было моделирование на примере андростенона связи между обонятельной чувствительностью к летучим стероидам и социальным поведением* у домовой мыши, а также исследование значимости летучих стероидов в качестве хемосигналов.
Задачи исследования. Были сформулированы следующие задачи:
Анализ наследования обонятельной чувствительности к летучим стероидам и межсамцовой агрессии с использованием модели специфической аносмии к андростенону, включая картирование отдельных генетических локусов и моделирование одновременного участия нескольких генетических факторов, контролирующих эти признаки, а также поиск генов-кандидатов по базам данных.
Исследование связи между чувствительностью к летучим стероидам и способностью распознавать по химическим сигналам пол и репродуктивный статус особей своего вида на уровне поведения на модели специфической аносмии к андростенону.
Исследование участия дополнительной обонятельной системы в рецепции этого одоранта на модели специфической аносмии к андростенону.
Исследование на уровне гормонального и поведенческого ответа информационной значимости андростенона как хемосигнала у домовой мыши.
Научная новизна. Впервые на основе генетического анализа гибридов второго поколения от скрещивания инбредных линии мышей CBA/J и NZB/B1NJ определены хромосомные локусы, оказывающие влияние на такие признаки,- как обонятельная чувствительность к летучему стероиду андростенону и межсамцовая агресссия. Впервые на модели специфической аносмии к андростенону показано отсутствие предпочтения запаха эстральной самки по сравнению с запахом самца у самцов мышей с хемодефицитом к летучим стероидам. Впервые показано участие дополнительной обонятельной системы в детекции андростенона. Впервые на модели специфической аносмии к андростенону был получен ответ на стимуляцию андростеноном на уровне рецепторной ткани вомероназального органа. Впервые показано, что предъявление андростенона (0.1%, 30 мин), вызывает снижение уровня тестостерона в плазме крови у самцов домовой мыши.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты способствуют накоплению и интеграции данных о фенотипических признаках у инбредных линий мышей-и генетических локусах, контролирующих обонятельную чувствительность к летучим стероидам (на примере андростенона), а также межсамцовую агрессию, расширяя сведения существующих баз данных. Полученные данные позволяют подойти ближе к пониманию биологических основ специфической аносмии к андростенону и агрессивного поведения у человека. Обонятельная функция человека рассматривается как перспективный маркер
ряда нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера, паркинсонизма и др. (Doty et al, 2008, Atanasova et al, 2008).
В естественной среде обитания домовые мыши наносят существенный экономический вред хозяйству и являются переносчиками опасных инфекционных заболеваний (Кулик, 1979). Исследование информационной значимости летучих стероидов в регуляции агрессивного и полового поведения грызунов позволяет оптимизировать применение сигнальных молекул на практике как естественных репеллентов и/или регуляторов репродуктивной функции.
Благодарности. Автор выражает благодарность кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН В.В. Вознесенской, под научным руководством которой была выполнена эта работа.
Автор глубоко признателен сотрудникам Монеллевского центра химических чувств (Филадельфия, США) Др. А. Бачманову, Др. Н. Босак и Др. Ц. Ли за помощь в освоении молекулярно-генетических и биоинформатических методов, а также за ценные замечания и рекомендации по работе.
Исследования частично поддержаны РФФИ 07-04-01538 и Программой Президиума РАН "Динамика генофондов и генетическое разнообразие".
Обонятельные рецепторы млекопитающих
Обширное суперсемейство генов, кодирующих обонятельные рецепторы (ОР), было открыто в 1991 году Линдой Бак и Ричардом Акселем (Buck, Axel, 1991). В 2004 году их работа была удостоена Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Основываясь на известных на тот момент экспериментальных данных об участии G-белков и ионных каналов в передаче обонятельного сигнала (Расе, et al., 1985, Nakamura, Gold, 1987, Dhallan, et al., 1990), Бак и Аксель предположили, что обонятельные рецепторы должны принадлежать к семейству 7-доменных трансмембранных рецепторов, ассоциированных с G-белками (GPCR - G-protein coupled receptor) и должны селективно экспрессироваться в обонятельной выстилке. Большое разнообразие структур одорантов позволило сделать предположение о высокой вариабельности обонятельных рецепторов и, как следствие, о мультигенном кодировании (Buck, 2004). Таким образом, при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с вырожденными олигонуклеотидными праймерами по мРНК клеток обонятельного эпителия крысы были амплифицированы гомологи генов суперсемейства GPCR. Продукты ПЦР были подвергнуты эндонуклеазной рестрикции с целью обнаружить продукт, содержащий члены мультигенного семейства. Фрагменты ДНК, полученные после рестрикции продукта, включающего гены обонятельных рецепторов, по сумме своих молекулярных масс значительно превосходили вес исходного ПЦР-продукта, тем самым подтверждая гипотезу о мультигенном кодировании. Обонятельные рецепторы были классифицированы как члены суперсемейства рецепторов, ассоциированных с G-белкам (GPCR) по своей структурной организации и способности связываться с G-белками, а также их активировать (Krautwurst, et al., 1998, Kajiya, et al., 2001). По всей видимости, связывание с одорантами и активация ОР происходит согласно известным принципами взаимодействия лиганд-рецептор. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей обонятельных рецепторов показал наличие как консервативных, так и вариабельных областей. Первые, по всей видимости, вовлечены в структурную организацию рецептора, а вторые ответствены за связывание с лигандом (Buck, Axel, 1991, Zhang, Firestein, 2002). Обонятельные рецепторы имеют 7 гидрофобных трансмембранных доменов, дисульфидную связь между консервативными цистеинами во внеклеточных петлях, консервативный сайт гликозилирования на N-конце (Katada, et al., 2004) и несколько характерных консервативных аминокислотных последовательностей (Zozulya, et al., 2001, Zhang, Firestein, 2002). Для обонятельного рецептора мыши mOR-EG (MOR 174-9) экспериментальными методами было продемонстрировано участие в связывании лиганда нескольких гидрофобных аминокислотных остатков, а также формирование кармана для связывания одоранта трансмембранными доменами 3, 5 и 6 (Katada, et al., 2005).
Очень небольшое число обонятельных нейронов (0.5-1%) экспрессирует отдельно взятый обонятельный рецептор, что указывает на экпрессию в каждом нейроне только одного или нескольких OP (Ressler, et al., 1993, Vassar, et at., 1993). Согласно наиболее распространенной гипотезе, именуемой «один нейрон -один рецептор», в одном сенсорном нейроне экспрессируется только один тип обонятельных рецепторов. Это положение было подтверждено различными экспериментальными методами, включая гибридизацию in situ (Ressler, et al., 1993, Vassar, et al., 1993), анализ ПЦР в одиночной клетке с обратной транскриптазой (single-cell RT-PCR) (Malnic, et al., 1999, Touhara, et al., 1999) и трансгенные эксперименты (Vassalli, et al., 2002, Serizawa, et al., 2003). Кроме того, гены обонятельных рецепторов относят к моноаллельным, то есть в обонятельном сенсорном нейроне экспрессируется либо материнская, либо отцовская аллель гена (Chess, et al., 1994, Ishii, et al., 2001). Исключение одной из аллелей наблюдали между эндогенными и трансгенными аллелями гена ОР, и даже между идентичными трансгенными аллелями, интегрированными в один и тот же локус отдельной хромосомы, что говорит о наличии глобального механизма (Serizawa, et al., 2000).
Каковы транскрипционные механизмы, обеспечивающие экспрессию гена только одного рецептора в обонятельном нейроне? По аналогии с другими генами, принадлежащими к мультигенным семействам, можно было б предположить необратимые перестройки ДНК (рекомбинацию, конверсию гена) или регуляцию при помощи локус контролирующих областей. Было продемонстрировано, что мыши, клонированные из ядра зрелого обонятельного нейрона, имели нормально развитую обонятельную систему, что свидетельствует об отсутствии необратимых перестроек ДНК в процессе выбора экспрессируемого рецептора (Eggan, et al., 2004). Таким- образом, вовлечение регуляторных последовательностей ДНК является наиболее вероятным механизмом. Показано, что экспрессия одного из кластеров обонятельных рецепторов мыши, включающего рецептор MOR28, контролируется расположенным выше энхансерным отрезком ДНК размером около 100 кЬ, названным Н-участком (Serizawa, et al., 2000, Serizawa, et al., 2003). Однако насколько этот механизм универсален до конца не понятно. В некоторых трансгенных экспериментах короткая последовательность ДНК, содержащая только экзоны генов ОР и промотор, оказалась достаточна для экспрессии OP (Qasba, Reed, 1998, Lewcock, Reed, 2004). Возможно, Н-участок может ассоциировать с промоторами генов ОР и оказывать как цис-, так и транс- (межхромосомные) положительные регуляторные воздействия (Lomvardas, et al., 2006). В обонятельных нейронах одна из двух аллелей Н-участка-ь инактивируется за счет метилирования, что находится в соответствии с моноаллельным характером экспрессии (Lomvardas, et al., 2006). Предполагается, что помимо положительной регуляции экспрессии, должна существовать,и отрицательная, способствующая подавлению экспрессии ещё одного гена ОР в той. же рецепторной клетке. Скорее всего, ингибиторное воздействие каким-то образом реализуется через функциональный белок обонятельного рецептора, но не через мРНК (Serizawa, et al:, 2003, Lewcock, Reed, 2004, Shykind, et al., 2004).
В обзоре Питера Момбаертса (Mombaerts, 2004b) обсуждается недостаточность доказательств гипотезы «одного нейрона - одного рецептора». Один из аргументов автора состоит в том, что экспериментальные данные, подтверждающие гипотезу, были получены на взрослых животных, в то время» как известно, что количество обонятельных нейронов и оборот нейронов у них значительно меньше, чем у детенышей. Момбаертс приводит альтернативную гипотезу олигогенного характера экспрессии обонятельных рецепторов в. процессе развития. Суть последней заключается в том, что во время дифференциации один нейрон может экспрессировать стохастически согласно распределению Пуассона 0, 1 или несколько рецепторов. При-этом нейроны, не экспрессирующие ни одного рецептора не выживают, а экспрессирующие два w более - активно элиминируются. Выдвинутая гипотеза не- противоречит накопленным данным»в поддержку теории.моногенной экспрессии. Возможность переключения экспрессии с одного гена ОР на.другой в обонятельном нейроне в определенный сенситивный (чувствительный) период была продемонстрирована в работе Шайкинда и соавт. (Shykind; et al!, 2004).
Конвергенция и синергизм ДОС и ООС
Несмотря на то, что дополнительная обонятельная система явным образом принимает участие в рецепции феромонов и реализации ряда феромональных ответов, прохождение сигнала по путям ДОС и прохождение феромонального сигнала - это не одно и то же (Halpern, Martinez-Marcos, 2003, Restrepo, et al., 2004).
С одной стороны, вомероназальные сенсорные нейроны реагируют и на некоторые обычные одоранты, не обладающие феромональной активностью (Sam, et al., 2001). С другой стороны, в рецепции ряда веществ феромональной природы, по всей видимости, играет важную роль основная обонятельная система. Например, стереотипное поведение новорожденных крольчат, направленное на поиск соска матери, в сильной степени зависит от содержания феромонов в молоке самки. Разрушение эпителия вомероназального органа ZnS04, не затрагивающее вомероназальные нейроны, приводило к нарушению этого типа поведения, тогда как хирургическое удаление вомероназального органа не оказывало1 такого эффекта (Hudson, Distel, 1986). Позднее было идентифицировано и само химическое вещество - 2-метил-бут-2-еналь, продукт молочных желез, обладающий феромональной активностью (Schaal, et al., 2003). Летучий стероид андростенон известен как феромон хряка, который повышает привлекательность самцов и способствует принятию рецептивной самкой свиньи позы лордоза. В экспериментах Доррис (Domes) и сотрудников вход в вомероназальный орган у свиней был заблокирован при- помощи хирургического цемента. Поскольку подобная операция не оказывала никакого влияния на характер полового поведения, авторы пришли к выводу об отсутствии участия ВНО в реализации» эффектов андростенона, по крайней мере, у свиньи (Domes, et al., 1997). Однако этот вывод остается спорным, поскольку для экспериментов были использованы сексуально опытные особи. Вовлечение ВНО в половое поведение самцов хомяков было впервые описано Поверсом и Винансом (Powers, Winans, 1975). Около трети хомяков с перерезкой вомероназального нерва оказались неспособными к нормальному спариванию, тогда как сочетание перерезки нерва с разрушением основной обонятельной выстилки сульфатом- цинка приводило к нарушению полового поведения у 100% самцов. Позднее, Майкл Меридит показал, что удаление ВНО у сексуально неопытных самцов хомяка нарушало половое поведение, а аналогичная операция у сексуально опытных- самцов не оказывала влияния (Meredith, 1986).
В дополнение, 2-гептанон, известный лиганд вомероназального рецептора V1Rb2, распознается и одним из OP - mOR912-93,(GailIard, et al., 2002). В экспериментах на разных видах млекопитающих было показано, что прохождение, феромонального сигнала может осуществляться не только через ДОС, но и через ООС (Restrepo, et al., 2004, Xu, et al., 2005).
Против классического строгого разделения структур и функций двух обонятельных систем (ООС и ДОС), свидетельствуют и данные молекулярно-генетических исследований. Относительно недавно было продемонстрировано, что 44 ОР, относящихся к классу 1 и классу 2 ОР, экспрессируются в рецепторной ткани вомероназального органа у мыши. Длинные отростки этих нейронов подходят к гломерулам в передней части дополнительной обонятельной луковицы. Эти же обонятельные рецепторы экспрессируются в сенсорных нейронах основного обонятельного эпителия, аксоны которых проецируются в ООЛ (Levai, et al., 2006). Таким образом, дополнительная обонятельная система не только может участвовать в детекции,одорантов ООС, но и рекрутировать те же рецепторные механизмы. Вместе с данными, о возможной экспресии вомероназальных рецепторов в основной обонятельной выстилке (Rodriguez, et al., 2000, Wakabayashi, et al., 2002), свидетельства об экспрессии OP нейронами ВНО. позволяют предположить, что обработка обонятельного сигнала в центральной-части анализатора гораздо важнее, чем локализация рецепторов на периферии.
Не так давно был обнаружен ещё один класс рецепторов, участвующих в восприятии обонятельных сигналов - TAARs (trace amine-associated receptors). Наподобие OP, TAARs экспрессируются в основной обонятельной выстилке позвоночных. Однако некоторые из их лигандов - амины, по всей видимости, обладают феромональной активностью и играют роль в хемокоммуникации (Liberies, Buck, 2006).
К обонятельному отделу носовой полости подходят волокна тройничного нерва (Graziadei, Gagne, 1973). Волокна этмоидальной веточки глазничного отдела тройничного нерва иннервируют переднюю часть, полости, а волокна верхнечелюстной веточки этого нерва- заднюю. Волокна носоглоточной веточки как части верхнечелюстной иннервируют, по-видимому, и вомероназальный орган (Wysocki, 1979). Волокна тройничного нерва участвуют в восприятии ощущений различной модальности: давления, прикосновения, боли; температуры.
В формирование запаховых ощущений, помимо собственно обонятельной системы, вносит значительный вклад система-тройничного нерва. Большинство одорантов кроме запаховой составляющей имеют и тригеминальную (вызывают раздражение, ощущение жжения). Известным специфичным одорантом системы тройничного нерва является молекула углекислого газа С02 (Hummel, Livermore, 2002). Первичная функция тригеминальной системы, по-видимому, заключается в осуществлении защитных рефлекторных изменений функции дыхания и сердца при попадании в носовую полость потенциально опасных химических соединений (Silver, et al., 1991). Септальный орган.
Представлен островком обонятельного эпителия округлой формы, расположенного по обе стороны носовой, перегородки между вомероназальным органом и обонятельной выстилкой, обычно кпереди от носоглоточного канала. Аксоны рецепторных нейронов септального органа, объединенные в пучки, как правило, по два с каждой стороны носовой перегородки (Wysocki, 1979), вместе с нервными. пучками обонятельного нерва проходят сквозь продырявленную пластинку решетчатой кости- и, по-видимому, оканчиваются в каудальной части обонятельной луковицы. (Bojsen-Moller, 1975). В эпителиальной выстилке органа содержатся боуменовы железы и рецепторные клетки, несущие жгутики. Рецепторные клетки схожи с ольфакторными нейронами (Adams, McFarland, 1971).
Роль септального органа в обонянии мало изучена. В относительно недавних работах Тиан и Ма был исследован характер экспрессии обонятельных рецепторов в септальном органе ("Пап, Ма, 2004). По всей видимости, большинство нейронов в,септальном органе экспрессирует ограниченное число ОР; причем количественный паттерн ОР варьирует. Около половины сенсорных нейронов экспрессируют ген ОР одного типа,- MOR256-3. Этот обонятельный рецептор вместе с ещё восьмью другими ОР экспрессируют около 90% обонятельных нейронов.
Определение порогов чувствительности к андростенону
Для оценки чувствительности к андростенону использовали модифицированную методику выработки условного рефлекса с положительным пищевым подкреплением»- «тест спрятанного печенья» (Voznessenskaya, et al., 1999b). Тест основан начспонтанной реакции мышей перекапывания подстилки в клетке в поисках остатков пищи: Обучение и-тестирование проводили на фоне пищевой депривации: мышей лишали.пищи за 16-20 ч до начала эксперимента. В течение первых трех дней обучения проводили ассоциацию запаха андростенона. с.пищевым подкреплением. Животному давали найтшкусочек пищи-(обладающей для него привлекательностью), спрятанный под подстилкой в одном из углов пластикового контейнера- 32x22 см. В непосредственной близости от пищи помещали на подложке из фольги кусочек марли, пропитанный раствором андростенона (0,1%, 30 мкл), а в противоположном углу клетки, также под подстилкой, на подложке - кусочек марли, смоченный в растворителе (минеральном масле - 30 мкл). Положение образцов чередовали в случайном порядке. В. день одному животному, делали 2 сессии по 10 предъявлений, в каждой. Начиная с четвертого дня, мышам предлагали-найти» в одном из углов клетки спрятанный под подстилкой образец, пропитанный 0,1% андростеноном. При обнаружении животное получало пищевое подкрепление. В качестве условного критерия обученности был принят порог в 70% верных решений. К снижению тестовой концентрации андростенона- переходили после того, как животное выполняло не менее 70% правильных решений в 3-х сессиях из 10 предъявлений подряд. В течение 5-7 дней концентрацию, андростенона пошагово снижали до тех пор, пока животное не могло локализовать образец с андростеноном менее, чем в 70% случаях. Эту концентрацию считали пороговой. Животным, которые не детектировали исходную 0,1% концентрацию, присваивали самый высокий порог чувствительности (0 по шкале бинарных разведений).
Длительные экспозиции к андростенону Для сенситизации к одоранту животных экспонировали к образцам, содержащим андростенон в течение двух недель (16 часов запаха / 8 часов без). Мыши содержались в индивидуальных клетках, размещенных в шкафах с отдельными вентиллируемыми отсеками (FluFrance). Образец - кусочек марли с нанесенным раствором андростенона (0.025%, 100 мкл), или контрольным одорантом (100 мкл минерального масла) помещали в пластиковый контейнер. Контейнер закрепляли снаружи клетки, таким образом, чтобы физический контакт с образцом- был исключен. Длительные экспозиции к андростенону (2-3 недели) вызывают значительное снижение порогов чувствительности к андростенону у обеих линий мышей (Voznessenskaya, et al., 1995).
Уровень избыточной агрессии оценивали при помощи стандартного теста ссаживания с кастрированным самцом-интрудером (Fuller, Hahn, 1976). В норме самцы лабораторных мышей не проявляют агрессивного поведения по отношению к кастрированным самцам. В качестве интрудеров были использованы самцььаутбредной линии Swiss Webster (приїфенотипировании гибридов второго; поколения) или самцы BALB/c (при исследовании влияния андростенона на физиологические и поведенческие показатели). Животные были кастрированы за 2 недели до начала эксперимента. Такой временной интервал гарантирует падение уровня тестостерона у прооперированных животных. Самцов-резидентов в течение 2 недель перед началом эксперимента содержали в индивидуальных клетках. Кастрированного интрудера подсаживали непосредственно в клетку тестируемого самца-резидента. В течение 6 минут (при фенотипировании гибридов второго поколения) или 15 минут (при исследовании эффектов андростенона) регистрировали латентный период первой атаки, количество атак и продолжительность каждой атаки. Интенсивность каждой атаки оценивали по четырехбалльной шкале. На основании интенсивности, продолжительности и общем количестве атак, каждому животному был присвоен уровень агрессивности от 0 до 6. Уровень агрессивности 0 отражает полное отсутствие агрессивных взаимодействий, в то время как 6 указывает на минимальный латентный период (1-5 сек) и крайнюю агрессивность атаки (когда необходимо вмешательство для предотвращения серьезных травм или гибели интрудера). В качестве наиболее общего показателя межсамцовой агрессии? использовали бинарную- оценку агрессивного поведения. Животным, не проявлявшим агрессии по отношению к кастрированному самцу, присваивали 0, а инициировавшим любые акты агрессивного поведения 1.
Чтобы исследовать возможный эффект одоранта на агрессивное поведение, самцу-резиденту предъявляли кастрированного самца-интрудера, дважды. В одну из попыток на аногенитальную область самца-интрудера наносили пипеткой, втирая в шерсть, контрольный одорант Во время- другой попытки на аногенитальную область интрудера наносили исследуемый одорант. Половину резидентов в первую попытку ссаживали с интрудерами с нанесенным аногенитальную область исследуемым одорантом, а во вторую с нанесенным контрольным одорантом; Другой половине предъявляли интрудеров с одним или другимобразцом в обратной очередности. Временной интервал между попытками составлял 24 Часа.
Анализ фенотипов родительских линий и гибридов первого поколения
Обонятельная чувствительность к андростенону. Мыши линиид NZB/B1NJ, как. самцы, так и? самки, значительно! менее чувствительны к андростенону, чем мыши линии-СВА (CBAVJ и CBA/Lac). Пороги чувствительности к андростенону; определенные ранее в трех различных- поведенческих тестах; (Y-образном лабиринте с положительным пищевым- подкреплением? и« с отрицательным: подкреплением; тесте: «спрятанного: печенья»); различались, у этих? двух линий, по крайней мере, в 2000 раз? (Voznessenskaya; et. al., 1999b). Первоначально, пороги чувствительности к;- андростенону у мышей: были определены на основе методики? обучения? с положительным пищевым подкреплением, в Y-образном? лабиринте; Перед тем; как тестировали порог чувствительности к андростенону,1 животных обучали реагировать в целом на присутствие запаха в: рукаве лабиринта; используя: набор одорантов (фенилзтиловьійі спирт, амилацетат, галаксолид); Вї дальнейшем близкие пороги чувствительности к андростенону для этих двух линий были получены на основеі двух других поведенческих тестов. Для определения порогов В; данной работе, в связи» с: необходимостью фенотипировать, большое количество животных, был выбражболее быстрый «тест спрятанного;печенья» Также, в предыдущих; исследованиях; выполненных в нашей группе; было продемонстрировано, что мыши этих: двухг линий; не; различаются по своей способности детектировать амилацетат (запах банана) и некоторые другие одоранты, что свидетельствует о, специфичности аносмии к андростенону у мышей линии NZB/B1NJ:
Примечание: исходная концентрация андростенона 0.1% (v/w). Животным, которые не детектировали эту концентрацию присваивалось нулевое значение. Над столбиками указано количество мышей в экспериментальных группах. Двухфакторный дисперсионного анализ (главные эффекты - пол и генотип) данных, представленных на рис. 13 выявил значительное влияние генотипа F(3,78) = 436, р 0.001, пола F(1,78)=277, р 0.001 (самки менее чувствительны, чем самцы) и взаимодействие между этими двумя эффектами F(3,78)=277, р 0.001.
Мы наблюдали разницу в чувствительности между самцами реципрокных гибридов первого поколения: было отмечено наследование по «материнскому типу». Самцы CN (материнская линия СВА, высокочувствительна к одоранту) лучше детектируют андростенон, чем самцы NC. Самки обоих типов реципрокных гибридов Fi малочувствительны к андростенону. Такого рода распределение порогов чувствительности может быть результатом влияния генетических факторов и/или негенетических материнских эффектов (пренатальных или постнатальных). Если имеет место действие генетических факторов, то наиболее вероятным представляется наследование, сцепленное с Х-хромосомой. Самцы линии NZB/B1NJ, наряду со специфической аносмией к андростенону, демонстрировали повышенную агрессивность по отношению к кастрированному самцу-интрудеру. Уровень агрессивности оценивали в стандартном 6 минутном тесте. Процент агрессивных животных у родительских линий и двух типов гибридов первого поколения представлен на рис. 14, другие исследованные показатели межсамцовой агрессии представлены на рис. 15 А-В.
Примечание: Величины латентных периодов (ЛП) были трансформированы с помощью натурального логарифма ln(x), чтобы уменьшить отклонение распределений от нормального. Животным, которые не проявляли агрессии, было условно присвоено значение латентного периода в 360 с. Над столбиками отмечены статистически значимые различия между родительскими линиями ( -р 0.0001) и типам реципрокных гибридов F1 (#-р 0.05, ##-р 0.01), вычисленные по критерию Манна-Уитни. Для сравнения на графиках приведены усредненные показатели для второго поколения гибридов. СВА - CBA/J, NZB - NZB/B1NJ.
Ряд показателей агрессивного поведения сильно и достоверно коррелировали между собой как у родительских линий, так и у гибридов первого и второго поколения (см. Приложение 2). Таким образом, мы можем обсуждать все эти параметры вместе. Однако отметим, что сильная отрицательная корреляционная связь между латентным периодом первой атаки и максимальной интенсивностью атак наблюдалась только в том случае, когда при расчете ЛП у неатаковавших животных был принят за 360 с (продолжительность тестирования).
Мы наблюдали статистически достоверные отличия по параметрам межеамцовой агрессии как между исходными родительскими линиями, так и между типами реципрокных гибридов первого поколения. Высокий уровень агрессивности у самцов линии NZB, по сравнению со многими другими инбредными линиями мышей, в том числе с СВА, описан в литературе (Roubertoux, Carlier, 1988, Brodkin, et al., 2002, Nakamura, et al., 2005). Самцы NZB отличны по ряду биохимических показателей, сопряженных с агрессивным; поведением. Из 12 инбредных линий, исследованных группой французских ученых, самцы NZB имели наибольший вес семенников, самые высокие показатели содержания тестостерона в плазме крови и активности стероидной сульфатазы, а также один из самых низких уровней серотонина и бета-эндорфина в мозге (Roubertoux, et al., 2005). В этой же работе по перечисленным показателям мыши СВА/Н значительно отличались от мышей NZB.
Полученная разница в агрессивности между реципрокными кроссами может быть объяснена действием генетических и/или негенетических факторов. Среди возможных генетических причин: сцепление с Х-хромосомой, митохондриальная наследственность, геномный импринтинг. Нельзя исключить и негенетические пренатальные и постнатальные материнские эффекты. Известно, что на X-хромосоме имеются локусы, в определенной мере контролирующие агрессивное поведение (Brodkin, et al., 2002, Roubertoux, et al., 2005).
Стоит заметить, что в нашем кроссе самцы NC (мать NZB) оказались более агрессивными по сравнению с самцами CN. Таким образом, полученное нами расщепление фенотипов в Fi не соответствует предположению о вовлечении Y-хромосомы в регуляцию агрессивного поведения, развиваемому несколькими группами исследователей (Selmanoff, et al., 1975, Van Oortmerssen, Sluyter, 1994; Guillot, et al., 1995). В противном случае мы бы наблюдали повышенный!уровень агрессивности у самцов CN (отец NZB/B1NJ). Возможно, различия связаны с известными влияниями на регистрируемые показатели агрессивности генетического фона тестируемых животных и интрудера, а также выбранной парадигмы тестирования (Maxson, Canastar, 2003).
Похожие диссертации на Роль летучих стероидов (на примере андростенона) в регуляции агрессивного поведения у домовой мыши
