Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
Химическая коммуникация и виды химических сигналов 10
Анатомическое строение обонятельного анализатора 13
Хемосенсорные образования носовой полости 13
Обонятельный эпителий 14
Вомероназальный орган 16
Тройничный нерв 17
Конечный нерв 18
Септальный орган 19
Обонятельная луковица 20
Дополнительная обонятельная луковица 23
Нейроанатомические проекции 25
Центробежные связи 29
Обонятельные рецепторы 32
Рецепторы ВНО 36
Принципы пространственного кодирования сигнала в ОС 39
Эволюция ДОС 41
Роль обоняния в регуляции репродуктивного поведения 42
Методы и материалы 50
Иммуногистохимические методы 50
Адаптация методики иммуногистохимического окрашивания на белок Fos для рецепторной ткани ВНО 57
Исследование влияния стрессирующих факторов на рецепцию хемосигналов рецептивной самки самцами домовой мыши на уровне выстилки ВНО осуществлялось при помощи иммуногистохимического окрашивания срезов ВНО с применением антител против белка Fos 58
Изучение иммунореактивности к рецептору андрогенов (AR) в рецепторной ткани ВНО самцов домовой мыши 59
Изучение иммунореактивности к рецептору глюкокортикоидов (GR) в рецепторной ткани ВНО самцов домовой мыши 60
Оценка уровня основных стероидных гормонов в плазме крови 60
Исследование влияния стресса на восприятие сигналов рецептивной самки на уровне поведения 61
Исследование влияния стресса на некоторые параметры полового поведения 62
Статистическая обработка данных 62
Результаты и обсуждение 63
Заключение 84
Выводы 86
Список литературы 87
- Хемосенсорные образования носовой полости
- Обонятельная луковица
- Адаптация методики иммуногистохимического окрашивания на белок Fos для рецепторной ткани ВНО
- Исследование влияния стресса на восприятие сигналов рецептивной самки на уровне поведения
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Последние 15 лет исследований процессов восприятия и анализа
информации в обонятельной системе позвоночных вывели данную область
биологической науки на качественно новый уровень. Открытие
обонятельных рецепторов сделало возможным изучение механизмов
рецепции и кодирования информации о химических стимулах в
обонятельной системе млекопитающих. Современные исследования
указывают на общность механизмов проведения сигнала в обонятельной и
других сенсорных системах. Обонятельная система большинства
млекопитающих состоит из двух функционально различных отделов:
основной обонятельной системы (ООС) и дополнительной обонятельной
системы (ДОС). При общности выполняемых функций имеет место
некоторая специализация двух обонятельных систем. Имеющиеся на
сегодняшний день сведения позволяют говорить о том, что в ходе
эволюции ДОС сформировалась как система, специализированная для
восприятия и анализа феромонов и функционально близких к ним
химических соединений. В настоящее время интенсивно изучаются
механизмы регуляции рецепции и проведения сигнала в ООС и ДОС
млекопитающих. Эта проблематика вызывает большой интерес научного
сообщества, поскольку восприятие и анализ запаховых раздражителей
лежит в основе организации социального, в том числе и полового
поведения млекопитающих. Большая часть работ посвящена влиянию
половых гормонов на восприятие химических сигналов в общем и
феромонов в частности у различных видов млекопитающих. Влияние же
стресса на рецепцию в обонятельной системе совершенно не изучено. В то
же время классическими исследованиями показано подавление
репродуктивного поведения самцов различных видов млекопитающих под
воздействием стресса. Учитывая вышесказанное и наличие прямых механизмов регуляции полового поведения со стороны обонятельной системы, представляется крайне интересным исследование возможности действия гормонов стресса на рецепцию и проведение сигнала в обонятельной системе млекопитающих. Влияние стресса на восприятие химических сигналов обонятельной системой может быть рассмотрено как один из механизмов контроля репродуктивного поведения в рамках динамической модели естественной регуляции численности популяций.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось исследование влияния стресса на информационную значимость обонятельных сигналов в рамках динамической модели регуляции численности популяций. В рамках данной цели были поставлены следующие задачи:
Оценить влияние естественных видов стресса на рецепцию химических сигналов астральной самки своего вида самцами домовой мыши на уровне рецепторной ткани вомероназального органа (ВНО);
Оценить влияние естественных видов стресса на восприятие химических сигналов астральной самки своего вида самцами домовой мыши на уровне поведения;
Исследовать возможные физиологические механизмы, обеспечивающие модуляцию сигнала на уровне рецепторной ткани ВНО.
Научная новизна и практическая значимость.
В рамках настоящей работы впервые исследовано влияние стресса на восприятие химических сигналов астральной самки самцами домовой мыши на уровне периферического звена ДОС. Впервые показана иммунореактивность к рецептору глюкокортикоидов в рецепторной ткани
ВНО. Рїммунореактивность к рецептору андрогенов в рецепторной ткани
ВНО не была выявлена. Результаты, полученные в данном исследовании,
указывают на угнетение ответа рецепторных нейронов ВНО на химические
сигналы рецептивной самки под воздействием холодового и
эмоционального стресса. Впервые показано, что упомянутые виды стресса
подавляют развитие Fos-иммунореактивности в рецепторной ткани ВНО
самцов домовой мыши в ответ на предъявление подстилки, содержащей
химические сигналы рецептивной самки. Присутствие
иммунореактивности к рецептору глюкокортикоидов в рецепторной ткани ВНО позволяет предположить возможность прямого действия гормонов стресса на рецепторные клетки ВНО. Согласно полученным данным, стрессированные самцы домовой мыши не отдают предпочтения запаху астральной самки по сравнению с запахом самки на стадии диэструса, хотя животные контрольной группы демонстрировали такого рода предпочтение. Таким образом, подавление ответа рецепторных клеток ВНО приводит к угнетению реакций, связанных с половым поведением.
Автором адаптирована методика иммуногистохимического окрашивания срезов нервной ткани на белок Fos для рецепторной ткани ВНО. Правомочность использования адаптированной методики для нейрональной ткани ВНО подтверждена для лабораторных и нескольких видов дикоживущих мышей. Полученные результаты имеют теоретическое значение для понимания тонких механизмов регуляции работы обонятельной системы млекопитающих и их взаимосвязи с репродуктивным поведением. Знание механизмов регуляции полового поведения грызунов необходимо для обеспечения контроля их численности, требующегося в условиях больших городов и для эффективного ведения сельского хозяйства.
Публикации по теме диссертационной работы
По теме диссертации опубликовано 16 работ.
Апробация работы.
Работа апробирована на межлабораторном семинаре Лаборатории сравнительной нейробиологии позвоночных ИППЭ РАН и Лаборатории обработки сенсорной информации ИППИ РАН 5 марта 2009 года.
Основные результаты были представлены и доложены на следующих международных и отечественных совещаниях: XV International symposium on olfaction and taste (ISOT) 21-26 Июля 2008 г., Сан-Франциско, США; XVIII Congress of European chemoreception research organization (ECRO) 3-7 сентября 2008 г., Порторож, Словения; V European Congress of Mammology, 21-26 Сентября 2007г., Сиена, Италия; XVII Congress of European chemoreception research organization (ECRO) 4-8 сентября 2006 г., Гранада, Испания; International Summer School on Ecological Brain Research III., 31 июля - 5 августа, 2005г., Москва-Бубоницы, Россия; XXIX International Ethological Conference,20-27 сентября 2005 г., Будапешт, Венгрия; XVI Congress of European chemoreception research organization (ECRO) 20-27 августа 2004 г., Дижон, Франция; Конференция молодых сотрудников и аспирантов ИПЭЭ РАН, посвященная 140-летию А.Н.Северцова. Актуальные проблемы экологии и эволюции в исследованиях молодых ученых, 5-6 октября 2006г., Москва; 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 17-21 апреля 2006г., Пущино; Териофауна России и сопредельных территорий. VIII Съезд Териологического общества, 31 января - 2 февраля 2007 г., Москва; IV Всероссийская конференция по поведению животных, 29 октября - 1 ноября, 2007г., Москва; Конференция молодых сотрудников и аспирантов Института проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН 10-11 апреля 2008 г., Москва; XII Научная конференция, молодых
ученых по физиологии высшей нервной деятельности 8-9 октября 2008 г., Москва.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о методах и материалах, результатов и обсуждения, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена на 103 страницах и содержит 30 рисунков. Список литературы включает в себя 200 наименований, в том числе 193 на иностранных языках. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ{№ 07-04-01538).
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВИЛ - вазоактивный интестинальный пептид ВНО - вомероназальный орган ДАБ - диаминобензидин
ДОЛ - дополнительная обонятельная луковица ДОС - дополнительная обонятельная система ЛГ - лютеинизирующий гормон НА - норадреналин ОЛ — обонятельная луковица ООС - основная обонятельная система ОР - обонятельный рецептор ОСБ - одорант-связывающий белок ПД - потенциал действия
AR — рецептор андрогенов (от английского androgen receptor) CREB - cAMP-responsive element binding protein DAG — диацилглицерол
GR - рецептор глюкокортикоидов ( от английского glucocorticoid receptor)
ІРз - инозитол-1,4,5- трифосфат NPY- нейропептид Y
TRP канал - канал быстрого рецепторного потенциала (от английского Transient Receptor Potential)
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Химическая коммуникация и виды химических сигналов
Знания об окружающем мире составляют необходимую основу для выживания любого индивида на планете Земля. Для большинства видов млекопитающих ведущей сенсорной модальностью является обоняние, а анализ запаховых раздражителей - определяющим фактором в организации сложных форм поведения. Другими словами, млекопитающие пользуются в первую очередь средствами химической коммуникации. В качестве стимула для органов обоняния млекопитающих может выступать любое органическое соединение и целый ряд неорганических веществ. В химической коммуникации животных особая роль отводится функциональной группе соединений различной химической природы, называемых феромонами.
Термин феромон происходит от греческого срєрсо (pherein), что означает нести и opjuovr] (hormon) - возбуждать. Понятие «феромон» было впервые предложено Карлсоном и Люшером в 1959 году (Karlson,Luscher, 1959) для обозначения группы веществ, «которые секретируются организмом во внешнюю среду и воспринимаются особью того же вида, у которой они вызывают специфическую реакцию, например, определенное поведение или процесс развития». Введение новой терминологии было обусловлено появлением сведений о веществах, хотя и сходных в некоторых чертах с гормонами, однако не отвечавших классическому определению гормона Старлинга. Так, например, Карлсон и Люшер упоминают в своей заметке половые аттрактанты бабочки, продуцируемые и секретируемые специализированными железами, вызывающие четкую реакцию рецепторного органа, однако, выделяемые во внешнюю среду (что не вписывается в понятие гормона, выделяемого в кровь). Таким образом, феромон, действующий вне организма, как средство связи между особями, оказывается сходным по действию на особь, но
противопоставленным по месту действия гормону, выделяющемуся и оказывающему эффекты внутри одного организма. Уже в год своего рождения новый термин был использован немецким исследователем Бутенандтом (Butenandt) для обозначения бомбикола — полового феромона самки тутового шелкопряда, и получил широкое распространение. В силу интенсивного развития исследований в области химической коммуникации насекомых, концепция феромона сформировалась именно в среде энтомологов. В рамках упомянутой концепции для отнесения вещества (смеси веществ) к группе феромонов были выработаны следующие критерии: 1) видоспецифичность действия; 2) выраженная поведенческая или эндокринная реакция реципиента; 3)жестко запрограммированная реакция реципиента; 4)наличие в составе феромона одного или небольшого количества компонентов; 5) монофункциональность.. Приложимость этой концепции для описания химической коммуникации млекопитающих многократно ставилась под сомнение. Такое определение феромона является излишне жестким, поскольку известно крайне мало соединений, используемых млекопитающими для коммуникации, отвечающих всем пяти требованиям. В настоящее время под феромоном, как правило, понимают соединение (или смесь), которое выделяется организмом во внешнюю среду и может быть воспринято особью того же вида, у которой оно вызывает одну или несколько реакций (Kalmus,1964; Stowers,Marton, 2005). Это определение указывает на важнейшие характеристики феромона - секреция во внешнюю среду и индукция реакции особи того же вида. В дальнейшем в настоящей работе термин феромон будет употребляться в последнем значении. Следует отметить, что феромон также часто определяют как любой химический сигнал, посылаемый индивидом, основной функцией которого является коммуникация (общение) с другими особями своего вида (Kelliher, 2007). Такое определение феромона является крайне неоднозначным, размывает
понятие о феромональных эффектах и вносит путаницу, поскольку под него подпадает фактически любое химическое вещество, используемое для химической коммуникации между животными (Johnston, 1998).
Функционально феромоны разделяют на рилизинг-феромоны, вызывающие немедленную поведенческую реакцию реципиента, и праймер-феромоны, запускающие процессы развития или эндокринную реакцию, отставленные во времени (Brennan,Zufall, 2006). Одним из немногих известных релизинг-феромонов млекопитающих является 2-метилбут-2-енол, запускающий реакцию поиска соска матери у новорожденных крольчат (Schaal, et al., 2003). В качестве примера эффектов, характерных для праймер-феромонов, можно привести стимуляцию сперматогенеза у рыб (Sorensen, et al., 1998) и регуляцию менструального и эстрального циклов у млекопитающих. Так у многих видов млекопитающих феромоны половозрелого самца ускоряют наступление эструса у самки. Индукция эструса у самок домовой мыши под действием феромонов самца носит название эффекта Виттена (Whitten) (Ma et al., 1999; Wyatt, 2003).
Хемосенсорные образования носовой полости
В настоящее время известно шесть хемосенсорных образований, локализованных в носовой полости млекопитающих: обонятельный эпителий, вомероназальный орган, тройничный нерв, терминальный нерв, септальный орган, ганглий Грунеберга (рис.1). Носовая полость у млекопитающих разделена на две симметричные половины вертикальной перегородкой, которая образована перпендикулярной пластинкой решетчатой кости, сошником, носовым гребешком верхней челюсти и хрящом (Бронштейн, 1977). Челюстная раковина носовой полости выстлана респираторным эпителием и разделяет носовую полость на обонятельный и респираторный отделы.
Обонятельный отдел носовой полости образован раковинами решетчатой кости и задней частью носовой перегородки. Обонятельный эпителий локализован на костных завитках решетчатой кости и задних отделах перегородки (Новиков, 1988). Площадь, занимаемая обонятельной выстилкой, существенно варьирует у различных видов млекопитающих (Wysocki, et al., 1979). Обонятельная выстилка млекопитающих (рис.2) состоит из обонятельного эпителия и соединительнотканного слоя. Обонятельный эпителий - это эпителий многорядного типа, состоящий из рецепторных, опорных и базальных клеток. Соединительнотканный слой представлен немиелинизированными аксонами рецепторных клеток, боуменовыми железами, коллагеновыми волокнами и кровеносными сосудами. Боуменовы железы продуцируют слизь, которая и покрывает всю обонятельную выстилку. Опорные клетки также вырабатывают некоторые компоненты слизи, обеспечивают электрическую изоляцию рецепторных клеток, содержат ряд ферментов, нейтрализующих токсические вещества (Okano,Takagi, 1974). В опорных клетках содержится большое количество цитохром-Р450- подобных энзимов (Lazard, et al., 1991). Эти ферменты могут взаимодействовать с одорантами, инактивируя их или же воздействуя на их способность проникать через мембраны. Как показали недавние исследования, опорные клетки помимо всего прочего способны продуцировать ростовые факторы, необходимые для развития обонятельных нейронов. В частности, в опорных клетках экспрессируется нейропептид Y (NPY), выступающий в роли нейропролиферативного фактора для клеток-предшественников обонятельных нейронов (Hansel, et al., 2001).
Обонятельные нейроны составляют 75-80% от всех клеток обонятельного эпителия (Farbman,Buchholz, 1992). Центральный отросток, отходящий от базального полюса рецепторной клетки, проходит в составе тонких обонятельных волокон в обонятельную луковицу. Периферический отросток отходит от апикального полюса клетки и при выходе на поверхность эпителия образует вздутие (холмик) с несколькими неподвижными волосками. Обонятельные рецепторы локализованы на внешней мембране волосков обонятельных нейронов. Начальные стадии трансдукции сигнала протекают в обонятельных волосках (см. ниже). Продолжительность жизни рецепторной клетки составляет в среднем от 30 дней до нескольких месяцев, после чего происходит ее замена новой. Источником постоянного обновления рецепторных клеток, которые в обонятельном эпителии находят на всевозможных стадиях дифференцировки, является популяция базальных клеток (Graziadei,Monti Graziadei, 1985). Далеко не все клетки, достигшие 30-ти дневного рубежа, погибают, срок жизни некоторых из них может быть продлен до года, поскольку нейрогенез в обонятельном эпителии происходит не автоматически, а является регулируемым процессом, как и в других нервных тканях (Makay-Sim, 2003).
Вомероназальный орган, или орган Якобсона (рис.3), обнаруженный у большинства млекопитающих, представляет собой парное сигарообразное образование трубчатой структуры, расположенное в основании носовой перегородки (Бронштейн, 1977). У грызунов орган заключен в костную либо хрящевую капсулу и сообщается с носовой полостью. Дистальный конец органа заканчивается слепо. Внутренняя вентромедиальная поверхность вомероназального органа выстлана обонятельным эпителием, а дорсомедиальная покрыта респираторным (Винников, Титова, 1957; Ciges, et al., 1977). Внутренний просвет органа заполнен слизью. Выстилка вомероназального органа чисто» анатомически напоминает обонятельную выстилку. В обонятельном эпителии ВНО выделяют три основных типа клеток: рецепторные, опорные и базальные. Однако рецепторные клетки не имеют жгутиков и снабжены только микровиллами (Graziadei, 1977), существуют также различия в ультраструктуре рецепторных клеток. Аксоны рецепторных клеток, собираясь в пучки, проходят в составе вомероназального нерва сквозь продырявленную пластинку решетчатой кости и заканчиваются в дополнительной обонятельной луковице (ДОЛ) (Wysocki, 1979; Meridith, 1983).
Функции и механизмы рецепции в вомероназальном органе будут рассмотрены ниже. Тройничный нерв Респираторный и обонятельный отделы носовой полости иннервированы волокнами, входящими в состав этмоидальной и верхнечелюстной ветвей тройничного нерва (Graziadei, 1977). Тела нейронов тройничного нерва расположены в полулунном ганглии в области заднего мозга (Gray, 1975). Этмоидальная веточка пересекает поверхностный слой обонятельной луковицы и, проходя сквозь продырявленную пластинку, делится на переднюю, внешнюю и медиальную веточки. Внешняя и медиальная веточки иннервируют нижнюю стенку и перегородку носа соответственно. Волокна носоглоточной веточки как части верхнечелюстной иннервируют носоглоточный канал, переднюю часть носовой перегородки и, видимо, вомероназальный орган (Wysocki, 1979)).
Окончания волокон, иннервирующих носовую полость, свободно распределены в толще обонятельного и респираторного эпителия (Graziadei,Gagne, 1973). Возбуждение волокон тройничного нерва при помощи химических соединений может вызывать возникновение ощущений жжения, холода раздражения, а также изменение секреции слизи в носовой полости (Doty, Cometto-Muniz в Doty, 2003). Таким образом, тройничный нерв играет скорее модулирующую роль в восприятии одорантов другими хемосенсорными образованиями носовой полости. Конечный нерв
Основная функция конечного нерва до сих пор является предметом обсуждений. Предположения о том, что конечный нерв может проводить обонятельную информацию, основаны прежде всего на расположении его окончаний в эпителии ВНО (Wirsig,Leonard, 1986). Тела нейронов, входящие в состав нерва, расположены вблизи терминальной полоски, что и определило его название {nervus terminalis). У млекопитающих нерв представлен разветвленной нейрональной сетью, охватывающей дорсальную часть носовой перегородки и заканчивающейся в передней части носовой полости. В полости носа млекопитающих выделяют две основных ветви конечного нерва (Wysocki, 1979). Первая через дорсомедиальное отверстие с вомероназальным нервом доходит до органа Якобсона. А вторая ветвь нерва либо является автономной и иннервирует кончик носа (у крыс), или входит в состав передней веточки тройничного нерва (у человека) (Новиков 1988). Окончания конечного нерва располагаются вблизи эпителиальных желез (Pearson, 1941; Larsell, 1950) и имеют свободные окончания в эпителии. В нейронах конечного нерва было обнаружено высокое содержание люлиберина (Schwanzel-Fukuda,Silverman, 1980). В настоящее время показано, что конечный нерв в процессе эмбриогенеза позвоночных обеспечивает миграцию нейронов, синтезирующих и секретирующих люлиберин, к соответствующим отделам головного мозга (Schwanzel-Fukuda, Pfaff в Doty, 2003).
Обонятельная луковица
Обонятельная луковица (ОЛ) есть ростральная часть конечного мозга (Telencephalon). ОЛ представляет собой образование эллипсоидной формы с хорошо выраженной слоистой структурой, характерной для корковых образований головного мозга позвоночных (Богомолова, 1970; Scott, 1986;Shepherd, 1972). Всего в ОЛ млекопитающих выделяют шесть слоев. 1. Слой поверхностного сплетения состоит из сложного переплетения немиелинизированных волокон - аксонов рецепторных клеток обонятельной выстилки. 2. Гломерулярный (клубочковый) слой - это зона нейропиля, состоящая, с одной стороны, из окончаний сложно разветвленных аксонов обонятельных клеток, с другой дендритов митральных, пучковых и перигломерулярных клеток. В гломерулярном слое заканчиваются аксоны всех обонятельных нейронов, передачу информации в вышележащие структуры обеспечивают в первую очередь митральные и пучковые клетки. Аксодендритные Гломерулы к обонятельной коре Рис.4 Схема организации основной сплетения обонятельной луковицы крысы. ОН обонятельные нейроны, ПГ митральных, пучковых и перигломерулярные клетки ПчК _ перигломерулярных клеток пучковые клетки, М - митральные клетки. Из Kosaka, Kosaka, 2005. формируют глобулярные образования, которые и называют гломерулами (клубочками) (рис.4). Гломерулы представляют собой основную структурно-фунуциональную единицу обонятельной системы позвоночных (см. ниже). Размер гломерул у различных видов позвоночных варьирует от 30 до 200 JM (средний диаметр гломерулы мыши составляет 50 \lM). Как правило, гломерулярный слой состоит из 1-2 рядов гломерул. Каждую гломерулу ОЛ окружают тела мелких перигломерулярных клеток. Дендрит перигломерулярной клетки ветвится и переплетается с аксонами обонятельных нейронов и окончаниями пучковых и митральных клеток 1 -2 гломерул, в то время как аксон такой клетки проходит сквозь 3-5 гломерул (Dulac, Wagner, 2006; Kratskin, Beluzzi в Doty, 2003). Нейроны перигломерулярной зоны гетерогенны и различаются по своей морфологии, физиологии и нейрохимии, только морфологически здесь выделено три типа клеток. Во избежание недоразумений, стоит упомянуть, что в современной литературе клетки перигломерулярной зоны все чаще называют юкстагломерулярными (Kosaka,Kosaka, 2005). 3 .Внешний плексиморфный слой разделяет клубочковый слой и слой митральных клеток. Основным типом нейронов этого слоя являются пучковые клетки, часть из них представляет собой нейроны второго порядка, аксоны которых вместе с аксонами митральных клеток формируют латеральный обонятельный тракт, остальные нейроны являются вставочными (Schoenfeld,Macrides, 1984). 4. Слой митральных клеток у млекопитающих представлен, как правило, одним концентрическим рядом митральных клеток.
Особенностью митральных клеток является наличие крупного апикального і дендрита, отходящего радиально от тела клетки и образующего густое разветвление в клубочке. Одна митральная клетка иннервирует только одну гломерулу, при этом до 20 митральных клеток могут образовывать контакты с одной гломерулой (Meisami,Bhatnagar, 1998). Дендриты этих клеток (обычно 3-7) проникают во внешний плексиморфный слой (рис.4). Вместе с аксонами пучковых клеток аксоны митральных клеток, как уже упоминалось, формируют латеральный обонятельный тракт (Schoenfeld, et al., 1985). 5. Внутренний плексиморфный слой, практически лишенный клеточных элементов, образован в основном коллатералями митральных и пучковых клеток и пронизан радиальными дендритами гранулярных клеток (Kishi, et al., 1984;Orona, et al., 1984). В этом слое также расположены короткоаксонные клетки. (Liu,Shipley, 1994). 6. Нейроны внутреннего гранулярного слоя имеют один центральный и несколько периферических дендритов, аксон у них отсутствует. Центральный дендрит направлен во внешний плексиморфный слой, где он ветвится и образует синапсы с базальными дендритами митральных и пучковых клеток (Price,Powell, 1970; Jackowski, et al., 1978). Таким образом, в ОЛ млекопитающих выделяют два основных типа нейронов - митральные и пучковые, и три категории вспомогательных — перигломерулярные, гранулярные и короткоаксонные клетки (Doty, 2003). Пучковые и митральные клетки выполняют роль релейных нейронов, а перигломерулярные и гломерулярные клетки осуществляют модуляцию их нейрональной активности. Дополнительная обонятельная луковица
Дополнительная обонятельная луковица (ДОЛ) является первым интегративным центром дополнительной обонятельной системы (так же называемой вомероназальной) и имеется у большинства видов млекопитающих. ДОЛ располагается, как правило, дорсо-каудально относительно ОЛ. У разных видов млекопитающих размеры ДОЛ существенно варьируют, но всегда меньше размеров ОЛ. У грызунов ДОЛ имеет размер от 1 до 1,5 мм (Meisami,Bhatnagar, 1998). Что касается межполовых различий по величине ДОЛ, то Гийамон и Сеговия, а также другие авторы показали, что размеры ДОЛ самцов крысы значительно превышают размеры ДОЛ самок, благодаря стимулирующему действию андрогенов в ранний постнатальный период (Guillamon,Segovia, 1997). Существуют ли подобные различия у других видов неизвестно. По строению ДОЛ схожа с ОЛ, однако она имеет менее выраженную слоистую структуру (Allison, 1953). В ДОЛ выделяют те же слои, что и в ОЛ, однако внутренний плексиморфный слой выражен настолько слабо, что многие исследователи считают его отсутствующим (Pedersen et al., 1986). 1. Наружный слой ДОЛ носит название слоя вомероназального нерва, и состоит из тонких немиелинизированных волокон вомероназальных нейронов, окруженных многочисленными астроцитами (Halpern, 1987).
Гломерулярный слой ДОЛ, как и гломерулярный слой ОЛ, является местом первого переключения: Именно в этом слое формируются синаптические контакты между аксонами рецепторных вомероназальных нейронов и апикальными дендритами митральных и пучковых клеток. Гломерулы ДОЛ гораздо менее четко отграничены друг от друга, чем гломерулы ОЛ, и гораздо более вариабельны по величине. Так размер гломерул ДОЛ мыши находится в диапазоне от 10 до ЗОиМ в диаметре. И если одна гломерула ОЛ объединяет аксоны 1000 рецепторных нйронов, то в ДОЛ степень конвергенции на порядок ниже и составляет 1:100 (Meisami,Bhatnagar, 1998). Перигломерулярные клетки гломерулярного слоя ДОЛ не окружают гломерулы, отделяя их друг от друга, а скорее формируют граничный слой между гломерулами и внешним плексиморфным слоем. Среди перигломерулярных клеток ДОЛ присутствуют ГАМК-эргические и глутамат-эргические нейроны (Takami, et al., 1992; Quaglino, et al., 1999).
Внешний плексиморфный слой ДОЛ развит значительно хуже, чем тот же слой ОЛ. В этом слое обнаружены базальные дендриты и тела релейных клеток (митральных и пучковых), а также апикальные дендриты гранулярных клеток, залегающих в самом внутреннем слое ДОЛ (Meisami,Bhatnagar, 1998).
Адаптация методики иммуногистохимического окрашивания на белок Fos для рецепторной ткани ВНО
Для адаптации иммуногистохимического окрашивания на белок Fos для рецепторной ткани ВНО мы экспонировали самцов домовой мыши к подстилке рецептивной самки в течение временных промежутков разной длительности, а именно: 45, 60, 70, 90 и ПО минут. По окончании воздействия животных перфузировали физиологическим раствором и раствором формалина через сердце, перфузия осуществлялась под нембуталовым наркозом (40мг/кг). ВНО извлекали вместе с хрящевой капсулой, и после дополнительной фиксации в 4% растворе формалина и криопротекции изготавливали на криостате серийные срезы ткани ВНО. Препараты окрашивали по методу описанному выше. Для подтверждения правомочности использования метода для выявления Fos-иммунореактивности как ответа на предъявления запаха эстральнои самки 2-х самцов Mus musculus domesticus экспонировали в течение 90 минут к подстилке самки Mus musculus domesticus, а еще 2-х - к подстилке самки Mus spicilegus. Затем следовала уже описанная процедура перфузии и изготовления препаратов ткани ВНО.
Исследование влияния стрессирующих факторов на рецепцию хемосигналов рецептивной самки самцами домовой мыши на уровне выстилки ВНО осуществлялось при помощи иммуногистохимического окрашивания срезов ВНО с применением антител против белка Fos. Опыты проводились на самцах гетерогенной популяции лабораторных мышей и мышей линии BALB/c (количество животных -20). В качестве стрессирующего фактора было использовано воздействие низкими температурами: содержание при 4С в течение 2-ух часов. В качестве альтернативного вида стресса для дополнительной группы животных (п=6) было применено воздействие запахом хищника в течение 10 дней: на подстилку самцам мышей каждые 2-3 дня наносили 500 мкл мочи кота, содержавшегося на мясной диете. Для экспозиции к хемосигналам рецептивной самки самцов домовой мыши помещали на подстилку, взятую от самки домовой мыши, находившейся на стадии эструса. Стадию эстрального цикла определяли по влагалищным смывам. Время экспозиции составляло 90 минут.
В случае стрессирования запахом хищника временной разрыв между окончанием воздействия и тестированием составлял 4 часа для исключения Fos-иммунореактивности в ткани ВНО, вызванной запахом хищника. Непосредственно после экспозиции животных подвергали перфузии физиологическим раствором через сердце, с последующим извлечением ВНО. Срезы ВНО окрашивали с использованием антител против белка Fos (см. ниже). Количественная оценка Fos-иммунореактивности на срезах ВНО Для количественного анализа было отобрано по 4 животных из каждой группы. Количество Fos - позитивных клеток оценивали вручную, под микроскопом. Для обсчета был использован каждый пятый срез через рецепторную ткань ВНО (количество срезов через ВНО составляло 80-100 шт). Площадь срезов оценивали в программе ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).
Изучение иммунореактивности к рецептору андрогенов (AR) в рецепторной ткани ВНО самцов домовой мыши. Оценку AR-иммунореактивности в рецепторной ткани ВНО проводили в двух независимых экспериментах. Общее количество животных — 4, по 2 в каждом эксперименте. Эта часть работы была проведена на самцах мышей гетерогенной лабораторной популяции. Животные не подвергались никаким воздействиям. Срезы ВНО, служившие в качестве контрольных, были получены от тех же животных, что и опытные. Опытные образцы окрашивали с применением антител против рецептора андрогенов производства Santa Santa Cruz Biotechnology (США) AR(c-19) sc 815 в разведениях 1:50 и 1:100. На контрольные образцы вместо раствора антител наносили буфер или раствор нормальной сыворотки (Vector Lab). В качестве положительного контроля были использованы срезы ОЛ.
Изучение иммунореактивности к рецептору глюкокортикоидов (GR) в рецепторной ткани ВНО самцов домовой мыши Оценку GR-иммунореактивности осуществляли аналогично таковой для рецептора андрогенов. Общее количество животных в двух сериях эксперимента составило 5 особей. Окрашивание срезов ВНО производилось с использованием антител против рецептора глюкокортикоидов производства Cruz Biotechnology (США) GR(M-20) sc 1004 в разведениях 1:50 и 1:100. Для анализа окрашенных срезов был использован микроскоп Nikon eclipse Е400, соединенный с цифровой фотокамерой (Nikon Coolpix 990). Обработка снимков производилась в программе Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). Оценка уровня основных стероидных гормонов в плазме крови Для оценки влияния холодового стресса на уровень тестостерона и кортикостерона в плазме крови было использовано 15 особей. Животные опытной группы находились перед началом эксперимента под воздействием низких температур. Для оценки влияния эмоционального стресса на уровень кортикостерона самцам домовой мыши 3-х различных групп каждые 2-дня на подстилку наносили 0,5 мл мочи кота, мочи морской свинки или воды. Забор крови от животных осуществлялся сразу вслед за декапитацией. Все манипуляции по отбору образцов крови (с момента взятия животного в руки) занимали не более 1,5 минут. Образцы крови центрифугировали в течение 15 минут при 12 000 об/мин. Полученные образцы плазмы хранились при -20 до момента анализа. Измерение уровня тестостерона и кортикостерона в образцах плазмы осуществляли с использованием готовых наборов для ИФА производства DRG(CIIIA) EIA-1559 и EIA-4164, соответственно, и планшетного спектрофотометра SpectraMax 340РС 384. Анализ и статистическую обработку результатов измерения проводили в программе SpectraMax Software (http://www.moleculardevices.com/pages/software/softmax.html). Исследование влияния стресса на восприятие сигналов рецептивной самки на уровне поведения.
Для оценки влияния стресса на восприятие хемосигналов рецептивной самки на уровне реализации поведенческих эффектов был использован стандартный тест, основанный на предпочтении сексуально опытными самцами запаха самки своего вида, находящейся на стадии эструса, запаху самки в стадии диэструса. Так известно, что при предъявлении самцам грызунов двух вышеупомянутых образцов запаха, сексуально опытные самцы затрачивают большее количество времени а исследование образца запаха рецептивной самки по сравнению с образцом, полученным от самки, находящейся на стадии диэструса. Единственным параметром, регистрируемым в данном тесте, является время, затрачиваемое на принюхивание к определенному образцу (Hayashi, Kimura, 1974). Опыты проводились в пластиковых боксах 80x50x60 (ширина х глубина х высота). В разные углы бокса помещали образцы запаха самки мыши на стадии эструса и диэструса, а также контрольный образец (вода).
Самцов домовой мыши, подвергавшихся холодовому стрессу, помещали в тестовый бокс непосредственно после воздействия; в случае стрессирования запахом хищника временной разрыв между окончанием воздействия и тестированием, как и при оценки Fos-иммунореактивности в ткани ВНО, составлял 4 часа.
Исследование влияния стресса на некоторые параметры полового поведения Для оценки влияния такого стрессирующего агента, как запах хищника, на половое поведение у домовой мыши, самцов ссаживали с самкой, находящейся на стадии эструса. В течение 60 минут регистрировали следующие параметры полового поведения: количество садок, количество садок с интромиссиями, количество попыток садок, количество назо-назальных и назо-анальных контактов. Тест проводили до воздействия запахом хищника и после. Временной разрыв между началом тестирования и окончанием воздействия составлял 4 часа. В эксперименте были использованы мыши гетерогенной лабораторной популяции. Количество животных в эксперименте - 10. Статистическая обработка данных
При обработке результатов были использованы стандартные методы статистического анализа. Вычислялись средние, стандартные отклонения и стандартные ошибки среднего массива данных. При сравнении характеристик массивов данных были использованы непараметрические критерии (Вилкоксона-Манна-Уитни, критерий Вилкоксона для связанных выборок).
Исследование влияния стресса на восприятие сигналов рецептивной самки на уровне поведения
Для оценки влияния стресса на восприятие хемосигналов рецептивной самки на уровне реализации поведенческих эффектов был использован стандартный тест, основанный на предпочтении сексуально опытными самцами запаха самки своего вида, находящейся на стадии эструса, запаху самки в стадии диэструса. Так известно, что при предъявлении самцам грызунов двух вышеупомянутых образцов запаха, сексуально опытные самцы затрачивают большее количество времени а исследование образца запаха рецептивной самки по сравнению с образцом, полученным от самки, находящейся на стадии диэструса. Единственным параметром, регистрируемым в данном тесте, является время, затрачиваемое на принюхивание к определенному образцу (Hayashi, Kimura, 1974). Опыты проводились в пластиковых боксах 80x50x60 (ширина х глубина х высота). В разные углы бокса помещали образцы запаха самки мыши на стадии эструса и диэструса, а также контрольный образец (вода). В качестве образцов запаха использовали мочу самок домовой мыши, нанесенную на фильтровальную бумагу. Тестирование проводили 10 минут.
Самцов домовой мыши, подвергавшихся холодовому стрессу, помещали в тестовый бокс непосредственно после воздействия; в случае стрессирования запахом хищника временной разрыв между окончанием воздействия и тестированием, как и при оценки Fos-иммунореактивности в ткани ВНО, составлял 4 часа.
Исследование влияния стресса на некоторые параметры полового поведения Для оценки влияния такого стрессирующего агента, как запах хищника, на половое поведение у домовой мыши, самцов ссаживали с самкой, находящейся на стадии эструса. В течение 60 минут регистрировали следующие параметры полового поведения: количество садок, количество садок с интромиссиями, количество попыток садок, количество назо-назальных и назо-анальных контактов. Тест проводили до воздействия запахом хищника и после. Временной разрыв между началом тестирования и окончанием воздействия составлял 4 часа. В эксперименте были использованы мыши гетерогенной лабораторной популяции. Количество животных в эксперименте - 10. Статистическая обработка данных
При обработке результатов были использованы стандартные методы статистического анализа. Вычислялись средние, стандартные отклонения и стандартные ошибки среднего массива данных. При сравнении характеристик массивов данных были использованы непараметрические критерии (Вилкоксона-Манна-Уитни, критерий Вилкоксона для связанных выборок). Анализ производился при помощи пакета статистических программ STATISTIKA 7.0 Адаптация методики иммуногистохимического окрашивания на белок Fos для рецепторной ткани вомероназального органа.
На момент начала экспериментальной работы нам не удалось обнаружить публикаций, в которых для визуализации активности нервных клеток ВНО использовалась бы методика окрашивания на белок Fos. В большинстве исследований, выполненных на ткани обонятельных луковиц, необходимым и достаточным для обнаружения активированных клеток при помощи упомянутого метода предполагается интервал времени в 45-60 минут от начала стимуляции. Активация транскрипции c-fos происходит в течение первых 5 минут, а максимальное количество мРНК накапливается в клетке через 30-45 минут от начала действия стимула. Время полужизни белка Fos составляет около двух часов, а предполагаемое время достижения пиковой концентрации в клетке 60 минут после начала экспресиии (Morgan, Curran, 1991; Muller et al.,1984). Однако кинетика накопления белка в различных типах клеток может быть различной и зависит от целого ряда параметров (Hargrove, Schmidt, 1989). В предварительных опытах при экспонировании самцов домовой мыши к моче эстральной самки нам не удалось выявить Fos-иммунореактивность в рецепторной ткани ВНО при длительности экспозиции, используемой для оценки активности клеток ООЛ. Мы предположили, что отсутствие окрашивания в рецепторной ткани ВНО было связано с недостаточным количеством белка Fos. Учитывая вышесказанное, продолжительность стимуляции была увеличена. Выраженная Fos-иммунореактивность на срезах рецепторной ткани ВНО самцов домовой мыши, была выявлена лишь после 90-минутной экспозиции с подстилкой, содержащей мочу рецептивной самки. В опытах с продолжительностью стимуляции 70 и 110 минут Fos-иммунореактивность была крайне слабо выражена или же вообще отсутствовала. По всей видимости, в клетках ВНО накапливается относительно небольшое количество белка Fos, и ранее чем через 90 минут он не может быть обнаружен методами иммуногистохимии при помощи использованных нами антител. Это предположение дополнительно подтверждает тот факт, что концентрацию первичных антител также пришлось увеличить (по сравнению с используемой нами для иммуногистохимии на срезах обонятельной луковицы).
Правомочность использования методики иммуногистохимического окрашивания на белок Fos для оценки активации нейронов рецепторной выстилки ВНО была подтверждена в опытах на дикоживущих видах мышей: Mus spicilegus и Mus musculus domesticus (рис.12). Поскольку представители упомянутых видов не скрещиваются между собой, было бы логично предположить, что ответ рецепторных клеток ВНО в случае экспозиции к запаху чужого вида будет слабым. После экспозиции подстилки самки Mus musculus domesticus в эструсе самцу своего вида нами была выявлена выраженная Fos-иммунореактивность в рецепторной ткани ВНО. В случае же экспозиции подстилки самки Mus spicilegus в эструсе самцу Mus musculus domesticus иммунореактивность к белку Fos была значительно более слабо выражена и локализовалась преимущественно в апикальной части эпителия ВНО, предположительно участвующей в рецепции летучих соединений. Такие результаты дополнительно подтверждают корректность использования метода окрашивания на Fos для изучения восприятия химических сигналов рецептивной самки самцами домовой мыши на уровне рецепторного эпителия ВНО.
Исследование влияния стрессируюших факторов на рецепцию химических сигналов рецептивной самки самцами домовой мыши на уровне выстилки вомероназального органа Самцов домовой мыши экспонировали к подстилке, содержащей химические сигналы самки, в течение 90 минут. Очевидно, что моча и другие выделения эстральной самки, которые может содержать подстилка, имеют сложный химический состав и содержат как летучие соединения, так и вещества с высокой молекулярной массой. В настоящее время показано, что рецепторами нейронов базальной части ВНО воспринимаются соединения белково-пептидной природы, а рецепторы, экспрессирующиеся в апикальной части ВНО, ближе к просвету органа, способны связывать как летучие соединения, так и вещества с относительно высокой молекулярной массой (нелетучие) (Kimoto et al., 2005;. Leinders-Zufall et al., 2004). После экспонирования самцов домовой мыши к подстилке, содержащей химические сигналы эстральной самки, Fos-иммунореактивность была обнаружена, как в базальной, так и в апикальной (расположенной ближе к просвету), зонах рецепторного эпителия ВНО, что соответствует многокомпонентности сигнала (рис.13). Основная часть Fos- позитивных клеток была локализована в ростральной части ВНО.
