Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Спектр мутаций, индуцированных алкилирующими веществами 16
1.2. Эксцизионная репарация оснований 17
1.2.1. 3-метиладенин-ДНК гликозилазы 20
1.3. Адаптивная репарация 20
1.3.1. Репарация 06-алкилгуанина 21
1.3.2. 06-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы Е. coli 22
1.3.3. Роль сигма-факторов РНК-полимеразы в механизме регуляции экспрессии генов адаптивного ответа 25
1.3.4. Терминация адаптивного ответа 27
1.4. SOS-зависимый механизм, индуцированный МННГ, в клетках Е. coli 28
1.5. Современная модель SOS-ответа Е. coli 29
1.6. Связь между адаптивной репарацией и SOS-системой 32
1.7. Эксцизионная репарация нуклеотидов 32
1.7.1. UvrABC эндонуклеаза Е. coli 33
1.7.2. Взаимодействие между UvrA и UvrB белками - феномен узнавания повреждения ДНК 35
1.7.3. Эксцизионная репарация нуклеотидов, сопряженная с транскрипцией 37
1.8. Предпочтительная репарация 06-метилгуанина на транскрибируемой нити ДНК 38
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 40
2.1. Штаммы Я coli 40
2.2. Инкубационные среды, антибиотики, химические вещества 41
2.3. Ингибирование транскрипции и трансляции в клетках Е. coli 42
2.4. Определение (3-галактозидазы 42
2.5. Определение РНК в клетках 44
2.6. Выделение плазмидной ДНК 45
2.7. Электрофорез в агарозном геле 46
2.8. Трансформация 46
2.9. Биолюминесцентный анализ - SOS-Lux тест 47
2.10. Оценка частоты индуцированных мутаций 47
ГЛАВА 3. Результаты исследования 50
3.1. Сравнительный анализ ответов клеток штаммов Е. coli группы В и К12 на мутагенное, бактерицидное и генотоксическое действие МННГ и МННГ в комбинации с рифампицином и хлорамфениколом 50
3.2. Индуцированный мутагенез в делящихся и неделящихся клетках Е. coli 60
3.2.1. Влияние рН инкубационной средына индуцированный мутагенез в культурах клеток логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli 61
3.2.2. Ингибирование синтеза Б-галактозидазы хлорамфениколом и ингибирование синтеза РНК рифампицином 65
3.2.3. Влияние ингибиторов процессов транскрипции или трансляции на мутагенное и бактерицидное действие МННГ 67
3.2.4. Влияние рН инкубационной среды на индуцированный мутагенез в адаптированных к МННГ клетках культур логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli 72
3.2.5. Влияние ингибиторов процесса транскрипции или трансляции на индуцированный мутагенез и бактерицидное действие МННГ в адаптированных к МННГ клетках Е. coli 76
3.3. Влияние осмотического стресса и ингибирования процессов транскрипции или трансляции на индуцированный мутагенез в Е. coli 79
3.4. Влияние осмотического стресса и ингибирования процессов транскрипции или трансляциина индуцированный мутагенез в адаптированных к МННГ клетках Е. coli 87
3.5. Экспрессия LexA-контролируемой транскрипционной сшивки рсda: iluxCDABE в делящихся и неделящихся клетках Е. coli 92
Обсуждение результатов 99
Выводы 112
Список литературы 113
- Эксцизионная репарация оснований
- UvrABC эндонуклеаза Е. coli
- Влияние рН инкубационной средына индуцированный мутагенез в культурах клеток логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli
- Влияние рН инкубационной среды на индуцированный мутагенез в адаптированных к МННГ клетках культур логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli
Введение к работе
Интенсивное развитие промышленного производства значительно увеличило антропогенный прессинг на объекты окружающей среды. К наиболее опасным компонентам загрязнения окружающей среды относятся химические соединения и физические факторы, которые вызывают повреждения наследственного материала живых организмов [29, 30, 128, 170]. В ответ на повреждения ДНК в клетке активируются процессы точного восстановления первоначальной структуры ДНК и механизм мутагенеза, обеспечивающий жизнеспособность клеток с потенциально летальными повреждениями генома.
Экспериментальный материал, полученный за последние 30 лет исследований в области мутагенеза, свидетельствует о консерватизме формирования, как повреждений ДНК, так и мутаций, и об отсутствии принципиальных отличий процесса восстановления повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот, в том числе и в клетках человека [175, 196, 197]. Анализ репарации ДНК в клетках организмов с различным уровнем организации привел к существенному прогрессу в понимании молекулярных, биохимических и генетических основ многокомпонентной и мультивариантной системы защиты клеток от ДНК - повреждающего действия мутагенных факторов.
Актуальность исследований репарации повреждений ДНК, определяется фактами существования связи между дефектами систем восстановления предмутационных ошибок в геноме и нарушением регуляции экспрессии генов, снижением скорости роста и жизнеспособности клеток прокариот [125, 127], или развитием патологических состояний в организме человека [40, 85, 95, 144]. Установлено, что процесс репарации ДНК играет ключевую роль в развитии нервной системы человека [60, 144], а нарушение механизма контроля геномной реорганизации в процессе V(D)J рекомбинации ведет к развитию иммунодефицитов [50, 98].
В настоящее время у человека известно несколько фенотипов высокой чувствительности к мутагенному действию физических факторов и химических соединений, обусловленных врожденной недостаточностью репарационного синтеза ДНК [22, 36, 50, 102]. Например, отличающиеся по фенотипическим признакам синдромы Кокейна, Блума, Вернера, Фалькони, пигментной ксеродермы вызваны мутациями в генах, которые кодируют белки, необходимые как для эксцизионной репарации нуклеотидов, так и для эксцизионной репарации нуклеотидов, сопряженной с транскрипцией [49, 63, 75, 118, 175, 195]. Детальное изучение и систематизация механизмов репарации позволили установить, что для соматических клеток с дефектами систем репарации ДНК характерны такие признаки, как повышенный уровень индуцированных мутаций, разная чувствительность к цитотоксическому действию мутагенных факторов, остановка деления клеток на определенных стадиях клеточного цикла деления в результате действия мутагенов.
Несмотря на значительные успехи в изучении процесса репарации ДНК, по-прежнему основное количество исследований сфокусировано на изучении, во-первых, причин нестабильности генома и, во-вторых, механизмов резистентности бактериальной и эукариотической клетки к действию химических соединений или физических факторов [117, 118, 205]. Альтернативные, на первый взгляд, исследования направлены на решение актуальной в настоящее время задачи — сохранение многообразия живых форм на Земле и решение более узких практических задач — роль аккумуляции мутаций в формировании патогенности сапрофитных микроорганизмов, разработка новых подходов получения микроорганизмов -продуцентов или деструкторов химических соединений. С точки зрения здоровья человека актуальность исследований заключается в расшифровке механизмов трансформации клеток и метастазирования [197] и в определении мишеней, чувствительных к действию лекарственных
препаратов, с целью создания более эффективных терапевтических средств [53].
В комплексе актуальных проблем особый интерес вызывает вопрос влияния физиологического состояния клетки на процессы спонтанного и индуцированного мутагенеза. Суть проблемы заключается в том, что существенные отличия физиологического состояния делящихся и неделящихся клеток живых организмов, и клеток испытывающих влияние различных факторов среды, вносят коррективы в процесс спонтанного и индуцированного мутагенеза [18, 23, 27, 122, 130]. В природе бактериальные клетки, как правило, находятся в условиях стресса. Не менее редко стрессовые факторы оказывают влияние и на клетки организма человека. Общей характеристикой неделящихся клеток и клеток, находящихся в условиях нелетального селективного давления факторов среды, является блокирование процесса репликации [41, 76, 86]. Изменение физиологического состояния клетки в результате давления фактора внешней среды и нарушение баланса внутриклеточных механизмов ведет к формированию гипермутабельных субпопуляций микроорганизмов или к каскаду мутационных процессов в клетках эукариот [107, 110].
Одна из современных гипотетических моделей мутагенеза объясняет появление гипермутабельных субпопуляций клеток, как результат переключения с механизма точной репарации повреждения ДНК на потенциально мутагенную репликацию с сохранением повреждения, химическая структура которого и контекст нуклеотидной последовательности, окружающей предмутагенное повреждение, влияют на частоту и тип индуцированных мутаций [15, 21, 71, 89, 105, 215]. В этом сложном процессе мутагенез и репарация ДНК включаются в механизм регуляции деления клетки и необходимы для регуляции экспрессии генов [27, 115, 119]. В контексте этой гипотезы актуальной задачей является изучение процессов, ведущих к высокому уровню спонтанного мутагенеза, и
природы резистентности к мутагенным факторам клеток прокариот и эукариот, испытывающих физиологический стресс.
В настоящее время основные представления репарации ДНК эффективно интегрируются в области научных исследований молекулярных основ наследственных заболеваний человека, предрасположенности к возникновению онкологических заболеваний и учитываются при разработке нового поколения профилактических и терапевтических лекарственных препаратов. Знания, полученные при изучении механизмов репарации и сопряженных механизмов защиты клеток от ДНК - повреждающего действия эндогенных и экзогенных факторов, служат основой современной стратегии создания лекарственных препаратов, более эффективных, чем фенольные антиоксиданти, изотиоцианаты, флавоноиды и кумарины, которые способны стимулировать множественные регуляторные пути защиты клеток от повреждений ДНК и могут использоваться для предупреждения инициации канцерогенеза [134]. Вторым направлением в области разработки новых терапевтических средств, является создание антибактериальных препаратов, обладающих электрофильной активностью. Мишенью антибактериальных электрофильных препаратов является комплексный механизм защиты грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, в том числе и система репарации ДНК [53].
Состояние вопроса. Среди химических веществ, обладающих мутагенной и канцерогенной активностью, особое внимание уделяется электрофильным соединениям и оксидантам, которые не только входят в состав антропогенных загрязнений окружающей среды, но и образуются в результате метаболизма или генерируются в процессе жизнедеятельности клеток живых организмов. Эти две группы химических соединений индуцируют различные потенциально мутагенные повреждения и специфические мутационные спектры [46, 58, 59, 108, 157].
В восстановлении повреждений ДНК, индуцируемых такими электрофильными соединениями, как монофункциональный N-MeTrni-N'-
нитро-ІМ-нитрозогуанидин (МННГ) или бифункциональный 3,4 — эпоксициклопента[с,с(]пирен участвуют SOS-независимая [209, 211] и SOS-зависимая модели репарации [205, 213]. К SOS-независимой относится эксцизионная репарация оснований и адаптивная репарация. SOS-зависимую репарацию выполняют ферменты, контролируемые белками RecA иЬехА[28,198].
Инициирующим событием активации той или иной модели репарации является образование различных типов повреждений ДНК. Модифицированные основания, образованные в результате реакции алкилирования ДНК, восстанавливаются участниками процесса SOS-независимой репарации: алкил-ДНК гликозилазами, ДНК-метилтрансферазами и белками адаптивного ответа. Появление в ДНК таких субстратов, как апуринновые\апиримидиновые сайты (АП-сайты) служит сигналом для активации SOS - зависимой модели репарации. АП-сайты в ДНК являются продуктом реакции взаимодействия ДНК гликозилаз с модифицированными основаниями ДНК [24, 25, 26, 209].
Было показано, что в клетках штамма Escherichia coli, мутантного по гену xthA, кодирующему АП эндонуклеазу, частота мутаций, индуцированных МННГ, выше, чем в клетках штамма дикого типа [58]. Снижение частоты индуцированных мутаций наблюдается в клетках штамма, мутантного по генам xthA и alkA. Ген аНсЛ, кодирует 3-метиладенин-ДНК гликозилазу, фермент адаптивной репарации, который регулируется транскрипционным активатором ada-onepona [123]. Экспериментальные данные, во-первых, дали основание предположить, что в процессе восстановления повреждений, индуцированных МННГ, участвует SOS-зависимая модель репарации. Во-вторых, между SOS-зависимой и SOS-независимой моделями существует связь. В настоящее время получены косвенные доказательства связи между SOS-репарацией и адаптивным ответом [33]. Механизм переключения систем репарации неизвестен.
Предполагая, что АП-сайты являются потенциально мутагенными повреждениями и формируются в сайтах ДНК, поврежденных соединениями с канцерогенной активностью, был предложен второй гипотетический механизм индукции SOS - зависимой модели репарации [89, 209]. Основанием для гипотезы стали данные о том, что модифицированные N-метил-Ы'-нитро-М-нитрозогуанидином основания ДНК в клетках Е. coli, преимущественно образуются в районе репликативной вилки [78]. Многочисленные повреждения ДНК в районе репликативной вилки вызывают SOS - мутаторный эффект, который является следствием снижения экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I, или активации SOS-системы. Не исключается и вариант совместного вклада ошибок репликативного и репарационного синтеза ДНК в процесс мутагенеза [119, 203].
Результатом SOS-мутаторного эффекта являются Г:Ц—>Т:А и А:Т-»Т:А трансверсии, образование которых зависит от контекста нуклеотидной последовательности ДНК. Трансверсии входят в мутационный спектр, индуцируемый алкилирующими соединениями, но не являются доминирующим типом мутаций.
Исследования показали, что АП-сайты и Об-метилгуанин,
образованные в результате обработки Е. coli алкилирующими соединениями,
являются субстратами UvrABC-эндонуклеазы, которая участвует в модели
эксцизионной репарации нуклеотидов и эксцизионной репарации
нуклеотидов, сопряженной с транскрипцией [99]. В настоящее время
отсутствуют данные, подтверждающие участие модели предпочтительной
репарации в восстановлении повреждений, индуцированных МННГ на
транскрибируемой нити ДНК. Более того, были получены противоречивые
результаты о связи процессов репарации и синтеза белка в клетках E.coli.
Было показано, что ингибирование трансляции может либо снижать [6], либо
повышать [172] мутагенную активность МННГ.
Таким образом, на современном этапе развития теории мутагенеза и
репарации ДНК не решены вопросы механизма переключения между
11 моделями репарации и взаимосвязи процессов репарации и транскрипции при восстановлении повреждений, индуцированных электрофильными соединениями.
Цель настоящего исследования - изучение влияния дефектов систем
репарации и дефицита глобального регулятора генов стационарной фазы
роста на мутагенез, индуцированный Ы-метил-ЬГ-нитро-М-
нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток Е. соїі в условиях ингибирования процессов транскрипции и трансляции.
Основные задачи исследования:
Сравнить частоту мутаций, индуцированных К-метил-М'-нитро-N-нитрозогуанидином, в культурах делящихся и неделящихся клеток штаммов Е. coliy дефектных по системам репарации.
Исследовать процесс индуцированного мутагенеза в условиях ингибирования процессов транскрипции или трансляции.
Оценить влияние ингибиторов транскрипции или трансляции на процесс индуцированного мутагенеза в адаптированных к М-метил-їчР-нитро-N-нитрозогуанидину клетках Е. coli.
Изучить индукцию LexA-контролируемого промотора гена cda в ответ на обработку клеток Е. соїі ІЧ-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидином.
Научная новизна. Впервые установлено участие механизма
предпочтительной эксцизионной репарации нуклеотидов в восстановлении
ДНК Е. coli, поврежденной монофункциональным алкилирующим
соединением М-метил-Ы'-нитро-]Ч-нитрозогуанидином. Проведен
сравнительный анализ частоты индуцированных мутаций в культурах делящихся (логарифмическая фаза роста); делящихся, но толерантных к закисленню среды; а также неделящихся (стационарная фаза роста и клетки, деление которых временно блокировано осмотическим стрессом) Е. coli дикого типа, Е. coli uvrA, Е. coli rpoS, Е. coli ada. Установлено, что необходимым условием переключения с SOS-зависимого на SOS-независимый механизм репарации является присутствие белка RpoS.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о процессах репарации и мутагенеза, индуцированного монофункциональными алкилирующими соединениями. Результаты свидетельствуют о том, что факторы, блокирующие деление или активирующие механизмы толерантности клеток Е. coli к закисленню, индуцируют SOS-зависимую резистентность к МННГ. Резистентность к МННГ неделящихся или растущих, но толерантных к закисленню, клеток Е. coli зависит от белка RpoS. В резистентных к МЫНГ клетках Е. coli существует период низкой экспрессии транскрипционной сшивки pcda::lwcCDABE. В период низкой экспрессии транскрипционной сшивки pcda::luxCDABE восстановление потенциально мутагенных повреждений осуществляют SOS-зависимая, в том числе, сопряженная с транскрипцией и SOS-независимая репарация. В этот период незначительное, но линейное увеличение экспрессии транскрипционной сшивки pcdav.luxCDABE в неделящихся клетках Е. coli rpoS, свидетельствует о том, что мутация rpoS396 вызывает нарушение баланса механизмов точной репарации и индуцированного мутагенеза. Заключение сделано на основании ингибирования индуцированной резистентности при блокировании синтеза белка.
Переключение механизма эксцизионной репарации на механизм SOS-мутагенеза в неделящихся клетках сопровождается повышением экспрессии LexA-регулируемой транскрипционной сшивки pcdav.luxCDABE. Присутствие мутантного белка RpoS в неделящихся клетках сокращает продолжительность периода переключения с процесса точной репарации на механизм SOS-зависимого индуцированного мутагенеза.
Установлено, что клетки Е. coli, растущие при оптимальных условиях среды, отличаются от растущих, но толерантных к закисленню или неделящихся клеток не только отсутствием периода низкой экспрессии транскрипционной сшивки pcda::luxCDABE, но и более высокой чувствительностью к бактерицидному и мутагенному действию МННГ.
Баланс SOS-зависимого, SOS-независимого механизмов восстановления и SOS-зависимого индуцированного мутагенеза определяют резистентность клеток Е. coli к МННГ.
При выполнении работы были получены рекомбинантные штаммы Е. coli высоко чувствительные к генотоксическому действию химических соединений. Сочетание высокочувствительного биолюминесцентного анализа и классического подсчета реверсий по триптофановому оперону позволяет получить экспресс-оценку потенциального и прямого генотоксического и мутагенного действия комплекса соединений или индивидуальных мутагенов в объектах окружающей среды. Штамм Е. coli WP2s с плазмидой pPLS-1, несущей LexA-контролируемую транскрипционную сшивку pcdai'JwcCDABE, был использован при проведении исследований по проекту РФФИ № 00-04-96096 эколого-генетического мониторинга морской экосистемы.
Основные положения, выносимые на защиту.
В культурах неделящихся клеток стационарной фазы роста, подвергнутых действию осмотического стресса, и в культурах клеток, толерантных к закисленню среды, уровень частоты мутаций, индуцированных М-метил-К'-нитро-К-нитрозогуанидином, ниже, чем в культурах клеток логарифмической фазы роста.
Ингибирование процесса транскрипции повышает, а процесса трансляции снижает уровень частоты мутаций, индуцированных Ы-метил-г>Р-нитро-К-нитрозогуанидином, в клетках Е. coli дикого типа, Е. coli ada, Е. coli rpoS, но не Е. coli uvrA.
Экспрессия LexA-контролируемой транскрипционной сшивки pcdanluxCDABE в клетках Е. coli стационарной фазы роста; клетках, толерантных к закисленню, и в клетках, подвергнутых действию осмотического стресса, более выражена, чем в клетках логарифмической фазы роста, растущих при оптимальных условиях среды.
Точная репарация ДНК происходит в период слабой экспрессии LexA-контролируемой транскрипционной сшивки pcday.liaCDABE в клетках Е. coli дикого типа, Е. coli ada, Е. coli rpoS, но не Е. coli uvrA, обработанных N-
метил-І^Г-нитро-Н-нитрозогуанидином и подвергнутых действию
осмотического стресса.
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации были представлены на региональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" (г. Пермь, 1999), XXXVIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (г. Новосибирск, 2000), VII молодежной научной конференции "Актуальные проблемы биологии и экологии" (г. Сыктывкар, 2000). По теме диссертации были опубликованы тезисы в региональном сборнике "Научно-технический прогресс и агропромышленный комплекс" (г. Пермь, 2000), в материалах I Всероссийской научной конференции с международным участием "Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека" (г. Новосибирск, 2002) и в материалах Международной научно-практической конференции "Загрязнение окружающей среды и здоровье населения" (г. Смоленск, 1999).
Всего по теме диссертации было опубликовано 7 работ, в том числе статья в журнале Микробиология (2000. № 6. С. 805 - 809).
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение процессов спонтанного и индуцированного мутагенеза в условиях экспериментальной и реальной химической нагрузки" (номер государственной регистрации 01.9.00017990). Работа выполнена при финансовой поддержке Комиссии РАН по работе с молодежью, научный проект № 285 (1999 - 2001 гг.) и РФФИ, проект № 00-04-96096 (2000 - 2002 гг.).
Список принятых сокращений: МННГ - N-MeTnn-N'-HHTpo-N-нитрозогуанидин; УФ - ультрафиолетовое излучение; а — сигма S субъединица РНК-полимеразы; oD - сигма D субъединица РНК-полимеразы; meAda — метилированный белок Ada, АП сайты - апуриновые или апиримидиновые сайты, ЭРО - эксцизионная репарация оснований, 06-МГТ 1-метил-гуанин ДНК трансфераза I, днДНК - двунитевая ДНК, онДНК - однонитевая ДНК.
Эксцизионная репарация оснований
В качестве объекта при изучении процесса мутагенеза широко используют различные штаммы микроорганизмов. До 60-х годов XX века оценивали частоту прямых мутаций в клетках Е. coli. Штаммы Е. coli trpA, полученные Чарльзом Яновски с коллегами, дают возможность оценить частоту обратных мутаций от ауксотрофности к прототрофности по триптофану [214]. В 70-е годы Брюсом Эймсом с коллегами были сконструированы апатогенные и ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonella typhimurium [10]. Метод регистрации обратных мутаций или реверсий от ауксотрофности к прототрофности клеток тестерных штаммов Е. coli и S. typhimurium не только является чувствительным и экспрессным, но позволяет определить силу мутагенной активности химического соединения или физического фактора и классифицировать индуцированный мутагенез по типу сдвига рамки считывания или замене пар оснований.
В связи с тем, что молекулярные механизмы мутагенеза и восстановления повреждений ДНК более подробно изучены в клетках Е. coli, чем в клетках S. typhimurium, мутантные штаммы Е. coli являются удобным инструментом для изучения, a S. typhimurium для скрининга и классификации химических соединений на слабые и сильные мутагены или супермутагены.
Так, секвенирование ДНК клеток Е. coli, обработанных монофункциональными алкилирующими веществами, позволило выявить специфический спектр фиксированных мутаций [62, 195]. Анализ спектра мутаций в ДНК Е. coli, индуцированного алкилирующими веществами, свидетельствует о доминировании мутаций, которые относятся к транзициям типа Г:Ц- А:Т или А:Т- Г:Ц [62]. Установлено, что в маркерном гене 1ас\ клеток Е. coli, немутантных по гену гесА, после обработки МННГ на месте потенциально мутагенных повреждений ДНК максимально может быть сформировано 267 мутаций, из них 261 принадлежат к транзициям Г:Ц — А:Т, а 2 - А:Т—»Г:Ц и одна трансверсия А:Т—»Т:А [62]. Транзиции возникают в результате ошибки встраивания нуклеотида в комплементарную нить ДНК в процессе репликативного синтеза напротив N-3-метиладенина, N-7-метилгуанина, О6-метилгуанина и О -метилтимина.
Кроме перечисленных типов мутаций, обнаружена одна делеция длинной 16 п.о. и две мутации по типу сдвига рамки считывания (-1), (+7) в "горячей точке", которая фланкирована прямыми повторами. Мутации формируются как на транскрипционно активной, так и нетранскрибируемой нитях ДНК [62].
Таким образом, в результате реакции ДНК с алкилирующим соединением образуется двенадцать типов различных потенциально мутагенных повреждений, из которых формируются такие типы мутаций, как транцизии, трансверсии, делеции и сдвиг рамки считывания. Основания, модифицированные алкилирующими веществами, являются субстратом ферментов эксцизионной репарации оснований (ЭРО) [89, 117].
Экспериментальные данные повышенной чувствительности клеток Е. coli к бактерицидному и мутагенному действию алкилирующих соединений позволили установить, что восстановление оснований ДНК, поврежденных алкилирующим соединением, осуществляет эксцизионная репарация оснований [25, 131], в которой участвует специфический класс ферментов, получивших название ДНК гликозилазы [57, 209]. Известно два класса ДНК гликозилаз: монофункциональные ДНК гликозилазы, в результате действия которых образуются безосновные сайты; бифункциональные ДНК гликозилазы/лиазы, осуществляющие разрезание связи С - О ДНК в 3 — направлении. Некоторые ДНК гликозилазы/лиазы разрезают С - О связи ДНК в 5 -направлении от повреждения.
Большинство из известных ДНК гликозилаз впервые были идентифицированы в клетках Е. соїі. В основном ДНК гликозилазы - это небольшие белки с молекулярной массой менее 30 кДа, не состоят из субъединиц и не нуждаются в кофакторах [57].
ДНК гликозилазы участвуют в реакции гидролиза N-гликозидной связи, примыкающей к химически измененному некомплементарному основанию в дезоксирибозофосфатной цепи. На месте вырезанного основания остается дезоксирибоза, связанная с предыдущим и последующим нуклеотидами фосфодиэфирными связями.
Первоначальный ферментативный этап эксцизионной репарации приводит к появлению АП сайтов в ДНК [209]. Удаление АП сайтов инициируется вторым классом ферментов эксцизионной репарации, которые получили название апуриновые/апиримидиновые эндонуклеазы [57].
АП - эндонуклеазы специфически узнают АП сайты в двунитевой ДНК. Гидролиз АП - эндонуклеазой одной из фосфодиэфирных связей в 5 - или 3 -направлении от АП сайта приводит к образованию ника в двунитевой ДНК. Большинство АП - эндонуклеаз осуществляет гидролиз фосфодиэфирной связи в 5 - направлении от повреждения ДНК [58]. Последовательное действие ДНК гликозилазы, 5 -АП-эндонуклеазы приводит к образованию гепа в один нуклеотид в двунитевой ДНК [58].
В таблице 1 представлены гены системы эксцизионной репарации алкилированных оснований ДНК Е. coli [58].
UvrABC эндонуклеаза Е. coli
Факты, подтверждающие существование сопряженного функционирования двух регуляторных систем, свидетельствуют о том, что экспрессия адаптивного ответа ингибирует индукцию некоторых генов SOS-системы, а SOS-ответ снижает адаптивный ответ. Было предположено, что механизм восстановления поврежденной ДНК продуктами генов одной из систем репарации сопряжен с формированием сигнала, необходимого для ответа второй системы [167]. Конкуренция в привлечении RecF белка возникает между адаптивной репарацией и SOS-ответом при одновременном активировании этих процессов в клетке [198].
Хотя RecF белок не участвует ни в SOS-, ни в адаптивном ответе клеток Е. coli, а необходим для стабилизации поврежденной репликативной вилки и восстановления нарушенного процесса репликации [33, 34], тем не менее, факты свидетельствуют о том, что клетки Е. coli, мутантные по гену гес, гиперчувствительны к УФ излучению и налидиксовой кислоте и имеют фенотип гиперчувствительности к мутагенному действию МННГ. Как правило, у штаммов, мутантных по гену recF, наблюдаются дефекты индукции некоторых генов SOS-системы, в том числе гесА+, а при обработке алкилирующими веществами индукция ada - оперона значительно меньше, чем в клетках дикого типа [198].
Эксцизионная репарация нуклеотидов является одним из важных и универсальных механизмов ДНК репарации в живых организмах, который позволяет удалять практически все известные типы повреждений ДНК [198]. Этот тип репарации обнаружен в клетках всех живых организмов и является высоко консервативным [177].
В отличие от эксцизионной репарации оснований, эксцизионная репарация нуклеотидов - это процесс, при котором поврежденные основания ферментативно удаляются при помощи инцизии и эксцизии из ДНК в виде олигонуклеотидов, а не как свободные основания. Таким образом, в дуплексной ДНК формируется геп, который заполняется в процессе репарационного синтеза, и затем происходит реакция лигирования между вновь синтезированным фрагментом и матричной нитью при помощи ДНК лигазы. Эксцизионная репарация нуклеотидов представляет многоэтапный биохимический процесс, в котором участвуют продукты ряда генов [58].
Как и в случае с индукцией SOS-репарации, традиционно считается, что эксцизионная репарация нуклеотидов восстанавливает повреждения ДНК, которые, в отличие от аддуктов, индуцированных МННГ, вызывают конформационные изменения структуры двойной спирали [79]. Однако повышение частоты мутаций, индуцированных МННГ, в клетках штаммов, дефектных по генам эксцизионной репарации, по сравнению с клетками Е. coli дикого типа, свидетельствует об участии эксцизионной репарации нуклеотидов в восстановлении повреждений ДНК, индуцированных алкилирующими соединениями [194, 198].
Один из основных этапов эксцизионной репарации нуклеотидов заключается в определении расположения и идентификации поврежденных оснований в геноме.
В процессе эксцизионной репарации нуклеотидов участвуют продукты генов Е. coli uvrA+, uvrB+, uvrC+, uvrD+ и poIA+ [99, 100, 101, 190]. Продукты генов uvrA+, uvrB+ и uvrC+ необходимы на этапе эндонуклеотической инцизии ДНК и конститутивно экспрессируются в небольших количествах в клетках Е. coli, необработанных мутагенами. Отличительной особенностью штаммов Е. coli, мутантных по uvrA, uvrB или uvrC генам, является высокая чувствительность к ультрафиолетовому излучению и ряду химических соединений, таких как митомицин С, налидиксовая кислота [159]. Ген uvrA+ и белок UvrA
Транскрипция гена uvrA+ индуцируется в ответ на повреждение ДНК химическими соединениями. Ген uvrA+ относится к классу SOS-генов, и регулируется белком - репрессором LexA. Сайт связывания LexA репрессора расположен в операторно - промоторном районе [150]. Подобная последовательность обнаружена в регуляторном районе гена uvrB+ [55].
UvrA является ДНК - независимой АТФ-азой. Это свойство позволило отнести белок к суперсемейству прокариотических АТФ-аз, многие из которых участвуют в активном транспорте веществ, обеспечивают резистентность клеток к химическим соединениям, играют роль в клеточном делении, экспорте белков, рекомбинации и репликации [44]. Состоящий из 44 аминокислотных остатков С-концевой район белка является районом узнавания потенциально мутагенных повреждений ДНК.
Белок UvrA имеет два функциональных АТФ-азных мотива возле N-концевого и С-концевого районов [152]. Оба АТФ-азных сайта функционируют кооперативно в реакции гидролиза АТФ. Взаимодействие АТФ с UvrA вызывает конформационные изменения белка [150, 151, 152]. Белок UvrA может существовать в двух формах: мономер в отсутствии АТФ и димер в присутствии АТФ.
В своей димерной форме UvrA белок связывается с поврежденным участком ДНК. Однако комплекс (ЦУГА)2ДНК является короткоживущим. Более высокая селективная связь белка UvrA с поврежденной ДНК обеспечивается специфическим взаимодействием с белком UvrB [55, 174].
Регуляция гена uvrB+ относится к комплексным процессам [55]. Транскрипция гена контролируется с двух перекрывающихся промоторов: SOS-зависимого и SOS-независимого [192]. Известно, что промотор Р1 гена uvrB+ определяет конститутивную и индуцибельную транскрипцию гена, а промотор Р2 обеспечивает, в основном, регуляцию транскрипции с промотора PL В условиях in vitro связывание белка LexA с промотором Р2 может препятствовать связыванию РНК - полимеразы с Р1 и локальному раскручиванию ДНК, которое предшествует инициации транскрипции [191]. Значение третьего промотора РЗ до конца не изучено. Однако существующие данные дают основание предполагать, что экспрессия гена uvrB+ каким-то образом сопряжена с репликацией ДНК [191].
Одна из особенностей UvrB белка заключается в присутствии аминокислотной последовательности, гомологичной району, по которому происходит протеолитическое расщепление белка Ada Е. coli [186]. Кроме того, в аминокислотной последовательности белка UvrB обнаружены два района гомологичные районам белка UvrC [194].
Белок UvrB специфически связывается с UvrA и образует протеин-протеин и протеин-ДНК комплексы, которые являются важными компонентами процесса инцизии поврежденной ДНК. UvrB белок конститутивно экспрессируется на уровне 250 молекул на клетку (значительно больше, чем UvrA белок). При индукции SOS-системы уровень белка UvrB повышается до 1000 молекул на клетку [58].
Влияние рН инкубационной средына индуцированный мутагенез в культурах клеток логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli
Экспериментальный материал, полученный за последние 30 лет исследований процессов индуцированного мутагенеза при помощи бактериальных тест-систем доказал, что чувствительность к мутагенному действию химических соединений или физических факторов не является групповым или видовым признаком энтеробактерий, а обусловлена "Grigg" эффектом [64] и дефектами систем репарации.
Установлено, что появление прототрофных по различным признакам ревертантов вызывает супрессию роста ауксотрофных клеток и снижает чувствительность тест - системы. Основываясь на известные факты, установленные в работах по индуцированному мутагенезу [30, 64, 204, 212], и полученные нами результаты необходимо подчеркнуть, что в штаммах Е. coli, таких как АВ2421, ауксотрофных по синтезу нескольких аминокислот, "Grigg" эффект более выражен, чем в штамме WP2s, ауксотрофном по одной аминокислоте. Для проведения дальнейшей экспериментальной работы следующий аргумент сыграл решающую роль при выборе в качестве тест -объектов штаммов Е. coli WP2 и WP2s - высокая чувствительность штаммов, в связи с более низким "Grigg" эффектом и более высокой чувствительностью к SOS - индуцирующему сигналу.
При изучении индуцированных мутаций в his аллелях S. typhimurium [10] или trp [121] и lac [82, 97] генах штаммов Е. coli групп В и К12 установлено, что гомологические ряды нуклео- или электрофильных веществ индуцируют специфические мутационные спектры, в которых доминирует определенный тип мутаций [48, 50, 58, 76, 82, 84]. Тип мутаций, доминирующий в спектре, индуцированном УФ излучением, отличается от доминирующего типа в мутационном спектре бенз[а]пирена или акридинового оранжевого, но идентичен типу мутаций в спектре, индуцированном химическими УФ-миметиками [58]. Анализ мутаций в ДНК прокариотических и эукариотических клеток, подтвердил специфичность мутационных спектров различных мутагенных факторов и независимость спектра от видовой принадлежности тест-объекта [58]. Согласно литературным данным специфичность мутационного спектра определяется механизмами формирования мутаций из потенциально мутагенных повреждений ДНК, контекстом нуклеотидной последовательности, поврежденного района ДНК и функциональным состоянием систем репарации [41,44, 50, 62].
Таким образом, сравнительный анализ экспериментальных данных подтвердил наличие общей тенденции ответов клеток Е. coli WP2 и К 12s или WP2s и АВ2421 на бактерицидное и мутагенное действие УФ излучения, МННГ, рифампицина, хлорамфеникола и сопоставимость влияния ингибиторов транскрипции и трансляции на LexA-контролируемую биолюминесценцию клеток рекомбинантных штаммов Е. coli групп В и К12. Сделанные в работе выводы не противоречат фактам, описанным в научной литературе [76, 79, 97].
При изучении мутагенеза, индуцированного алкилирующим соединением, выбраны делящиеся и неделящиеся клетки Е. coli, как две модельные системы для оценки частоты реверсий охр мутации в генах trpE или hisG. Делящиеся клетки представлены культурами клеток середины логарифмической фазы роста при оптимальных параметрах среды или толерантных к нелетальному закисленню среды (рН 6,5) [13]. Неделящиеся клетки представлены культурами клеток стационарной фазы роста или клетками, в которых процесс деления временно и обратимо блокирован нелетальным осмотическим стрессом [13, 68, 69,144, 184].
Основанием для предположения, что чувствительность к мутагенному действию МННГ зависит от физиологического состояния клеток Е. coli, послужили следующие факты: изменение частоты мутаций, индуцированных МННГ, при изменении параметров инкубационной среды [173]; на выживаемость клеток Е. coli влияют рН, компонентный состав инкубационной среды и фаза роста [133, 139, 184]; в ответ на изменение рН среды, повышение осмотического давления среды и при переходе из логарифмической в стационарную фазу роста в клетках Е. coli увеличивается концентрация белка RpoS [51, 73,80,81,93,208]; белок RpoS регулирует определенный набор генов в клетках стационарной фазы роста, в клетках экспоненциальной фазы роста, но растущих в среде со слабым закислением (рН от 5,8 - 7,0) и в клетках, инкубируемых в среде с высоким осмотическим давлением [13,81,93]; в клетках стационарной фазы роста или в клетках, находящихся в состоянии стресса, вызванного голоданием, присутствие белка RpoS необходимо для увеличения в 20 раз концентрации белка Ada [184]; ацетат является одним из метаболитов клеток стационарной фазы роста [13]; в клетках экспоненциальной фазы роста, толерантных к слабому закисленню среды, ацетат индуцирует экспрессию aidB+ гена системы адаптивного ответа и повышает резистентность Е. coli к мутагенному действию МННГ [173] и бактерицидному действию перекиси водорода [13]. Эксперименты этого этапа работы направлены на решение таких задач, как оценка частоты индуцированных мутаций в делящихся и неделящихся клетках Е. coli, определение доминирующего влияния рН инкубационной среды или возраста культуры клеток на SOS-зависимый и SOS-независимый механизмы репарации и изучение чувствительности к бактерицидному и мутагенному действию МННГ клеток Е. coli, мутантных и немутантных по rpoS гену. Согласно результатам, представленным в таблицах 4 и 5, при рН 7,4 чувствительность к мутагенному действию МННГ делящихся клеток Е. coli дикого типа (WP2 и К 12s) и мутантных по uvrA гену выше, чем неделящихся клеток. Инкубация клеток Е. coli WP2 и WP2s середины логарифмической фазы роста в среде с рН 6,5 вызывает снижение частоты индуцированных мутаций, но не влияет на индуцированный мутагенез в клетках стационарной фазы роста (рис. 6). Отличия бактерицидного действия МННГ в культурах клеток разных фаз роста штаммов WP2 или WP2s, при рН 7,4 статистически недостоверны (табл. 4). Установлено, что выживших клеток после инкубации с мутагеном в среде с рН 6,5 в культуре логарифмической фазы роста Е. coli WP2s -(78,2±1,2) %, а в культуре стационарной фазы роста - (77,5±2,9) %.
Влияние рН инкубационной среды на индуцированный мутагенез в адаптированных к МННГ клетках культур логарифмической и стационарной фаз роста Е. coli
Различные виды стрессов, вызванные изменением условий окружающей среды, оказывают постоянное воздействие на все живые организмы. Изменения в структуре ДНК, вызванные нестабильностью химических связей нуклеотидов или модификацией химической структуры нуклеотидов в ДНК при нефизиологических параметрах среды, приводят к временной и обратимой остановке процесса полуконсервативной репликации. Остановка репликации происходит, прежде всего, в результате блокирования механизма продвижения репликационных вилок, но не инициации новых циклов репликации [139, 145, 178]. Кроме стрессовых условий окружающей среды, временную остановку репликации в делящихся клетках Е. coli К12 и Е. соїі В дикого типа, вызывают химические соединения или физические факторы, повреждающие ДНК [147, 179].
Существует, по крайней мере, два альтернативных предположения о том, как в клетках возобновляется синтез ДНК на матрицах, содержащих повреждения, блокирующие репликацию: возобновление инициации репликации на некотором расстоянии вниз по течению от остановки синтеза ДНК; продолжение синтеза ДНК, минуя повреждение матричной нити. Первый сценарий относится к потенциально мутагенным процессам, в связи с ошибочным кодированием или некодирующей природой ошибок ДНК [177, 180,201]. С целью сохранения целостности генома механизм репарации ДНК интегрируется в сеть молекулярных процессов транскрипции, экспрессии генов, репликации и контроля цикла клеточного деления [73, 101, 159, 197]. В ответ на повреждения ДНК индуцируется SOS-система и экспрессия ингибитора деления клетки, кодируемого геном sfiA+ (альтернативное название sulA+), и как следствие, происходит филаментообразование [58].
Хотя многие соединения, активирующие SOS-систему, генерируют первичные нарушения конформационной структуры ДНК, последние не являются единственным источником индуцирующего сигнала. К индуцирующим сигналам относятся и вторичные проявления повреждений, которые изменяют структуру нуклеотидов или спирали ДНК. Существует предположение, что сигналом для активации SOS-системы в Е. coli, обработанной МННГ, являются АП сайты, формирующиеся в результате ферментативной реакции, катализируемой ДНК гликозилазами [127].
Так как к субстратам SOS-зависимых Uvr-эндонуклеаз Е. coli относятся АП сайты и 06-метилгуанин [72, 175, 194, 203], то дефекты генов или дефицит белков эксцизионной репарации нуклеотидов являются причиной более высокой чувствительности к мутагенному действию МННГ штаммов Е. coli WP2s uvrA и Е. coli АВ2421 uvrA, чем штаммов дикого типа. Высокая экспрессия LexA-регулируемой транскрипционной сшивки промотора гена cda+ с lux опероном в Е. coli uvrA, по сравнению с Е. coli дикого типа, подтверждает участие эксцизионной репарации нуклеотидов в восстановлении потенциально мутагенных повреждений, индуцированных МННГ.
В отличие от глобальной эксцизионной репарации нуклеотидов ключевым моментом инициации транскрипционно-зависимой модели эксцизионной репарации является остановка РНК-полимеразы возле поврежденного сайта. На современном этапе изучения молекулярных механизмов репарации не доказано блокирование РНК-полимеразы сайтами с алкилированными основаниями и участие транскриционно-зависимой модели репарации в восстановлении повреждений в транскрибируемой нити, хотя продукты алкилирования ДНК нитрозогуанидином формируются в транскрибируемой и нетранскрибируемой нитях [21]. Можно предположить, что АП сайты, как и пиримидиновые димеры или фотопродукты могут останавливать продвижение РНК-полимеразы в транскрибируемых участках ДНК. Установлено, что в ДНК формируется петля, если АП сайты располагаются в противоположных нитях небольшого участка [9, 20, 21].
Альтернативное влияние ингибиторов транскрипции и трансляции на индуцированный мутагенез в клетках логарифмической фазы роста Е. coli дикого типа свидетельствует об участии эксцизионной репарации нуклеотидов, сопряженной с транскрипцией, в восстановлении ДНК, алкилированной МННГ. В клетках Е. coli uvrA, дефектных по эксцизионной репарации нуклеотидов, ингибирование транскрипции или трансляции вызывает усиление процесса индуцированного мутагенеза. Отсутствие альтернативного влияния ингибиторов транскрипции и трансляции на индуцированный мутагенез в Е. coli uvrA подтверждает участие транскрипционной модели в восстановлении повреждений ДНК.
В концепции механизма репарации существует предположение, что при низком уровне эксцизионной репарации нуклеотидов экспрессия alkA+ и tag+ генов является необходимым условием процесса восстановления повреждений ДНК [47, 90, 91, 92]. Известно, что инициация транскрипции гена alkA+ РНК-полимеразой осуществляется более эффективно в присутствии фактора а , чем о в условиях in vitro и in vivo, если отсутствует метилированный белок Ada, или присутствует только метилированный N-терминальный домен белка Ada [91].
Сделанное нами предположение о том, что в адаптированных и неадаптированных к МННГ клетках Е. coli uvrA в репарации повреждений ДНК участвуют белки эксцизионной репарации оснований и ДНК-метилтрансферазы, функционирование которых зависит от уровня транскрипции и трансляции, не противоречит, а результаты повышения частоты индуцированных мутаций при ингибировании транскрипции и трансляции согласуются с гипотезой.
