Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Ответ бактерий Escherichia coli на окислительный стресс 13
1.1. Реактивные формы кислорода и их токсическое действие на клетки 13
1.2. Компоненты антиоксидантной защиты 19
1.3. Регуляция ответа Е. coli на окислительный стресс 23
1.3.1. Ответ на действие перекиси водорода, роль OxyR регулона 24
1.3.2. Ответ на действие генераторов супероксид аниона, роль SoxRS регулона ... 26
1.3.3. Роль О регулона в защите клеток от окислительного стресса...29
1.4. Глутатион и его роль в жизнедеятельности Е. coli 30
1.4.1. Ферменты метаболизма глутатиона 34
1.5. Роль калия у бактерий Е. coli 37
Глава 2. Антибактериальные вещества 40
2.1. Общие особенности антибактериальных препаратов 40
2.2. Классификация антибактериальных препаратов 41
2.3. Краткая характеристика применяемых в работе антибактериальных веществ. 42
2.3.1. Хлорамфеникол (левомицетин) 42
2.3.2. Рифампицин 44
2.3.3. Грамицидины 45
2.3.4. Ацетамидофенол 47
2.4. Антибиотикоустойчивость, взаимосвязь транскрипционных активаторов МагА и SoxS 49
Глава 3. Объекты и методы исследования 54
3.1. Бактериальные штаммы 54
3.2. Питательная среда и условия культивирования 56
3.3. Определение содержания общего и наружного окисленного глутатиона .57
3.4. Определение GSSG внутри клетки 58
3.5. Определение активности -галактозидазы 62
3.6. Определение концентрации внутриклеточного калия 62
3.7. Влияние условий аэрации и температуры на рост бактерий Е. coli, обработанных антибактериальными веществами с разным спектром действия 62
3.8. Методика определения выживаемости клеток с использованием верхнего агара 63
3.9. Статистическая обработка данных 63
Глава 4. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Е. coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола 65
4.1. Грамицидин 65
4.1.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных грамицидином 65
4.1.2. Влияние грамицидина на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах 70
4.1.3. Влияние грамицидина S на экспрессию антиоксидантных генов70
4.1.4. Влияние грамицидина на статус глутатиона 76
4.2. Хлорамфеникол 84
4.2.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных хлорамфениколом 84
4.2.2. Влияние хлорамфеникола на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах 85
4.2.3. Влияние хлорамфеникола на экспрессию антиоксидантных генов 88
4.2 А. Влияние хлорамфеникола на статус глутатиона и уровень внутриклеточного калия 92
4.3. Рифампицин 92
4.3.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных рифампицином 92
4.3.2. Влияние рифампицина на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах 95
4.3.3. Влияние рифампицина на активность антиоксидантных систем.95
4.3.4. Влияние рифампицина на статус глутатиона и уровень внутриклеточного калия. 99
4.4. Ацетамидофенол 102
4.4.1. Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных ацетамидофенолом 102
4.4.2. Влияние ацетамидофенола на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах 108
4.4.3. Влияние ацетамидофенола на экспрессию антиоксидантных генов 109
4.4.4. Влияние ацетамидофенола на статус клеточного глутатиона и внутриклеточный калий 110
Глава 5. Комбинированное действие ацетамидофенола и антибиотиков на растущие клетки Е. coli 112
5.1. Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий Е. coli, обработанных грамицидином 112
5.2. Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий Е. coli, обработанных хлорамфениколом 113
5.3. Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий Е. coli, обработанных рифампицином 113
Заключение 118
Выводы 132
Список литературы 134
- Реактивные формы кислорода и их токсическое действие на клетки
- Определение GSSG внутри клетки
- Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных грамицидином
- Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий Е. coli, обработанных рифампицином
Введение к работе
Актуальность проблемы. В природной среде пребывание бактерий в условиях, оптимальных для размножения, является скорее исключением, чем правилом. Бактерии постоянно подвергаются воздействию разного
рода стрессов, которые могут быть следствием резких изменений , - параметров окружающей среды. К их числу относится окислительный
f стресс. В обычных условиях уровень активных форм кислорода (АФК), способных повреждать практически все молекулярные компоненты клеток (белки, нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны), поддерживается на безопасном уровне благодаря активности антиоксидантных систем. В определенных условиях уровень оксидантов может превышать способности антиоксидантных систем к их детоксикации, следствием чего будет снижение активности клеток, вплоть до полной гибели. Бактерии конститутивно синтезируют антиоксидантные ферменты, а также обладают механизмами адаптивного ответа, благодаря которым предварительное действие малых доз оксидантов вызывает повышенную устойчивость к последующему действию больших доз. Ключевыми ,« регуляторами адаптивных ответов у бактерий Escherichia coli являются
w транскрипционные факторы SoxRS и OxyR (и регуляторные гены soxRS и oxyR), которые индуцируют согласованную экспрессию групп генов (регулонов) в ответ на действие супероксидного аниона (CV) и перекиси водорода (Н2О2), соответственно (Storz, Imlay, 1999; Pomposiello, Demple, 2002).
Причиной повышения АФК выше критического уровня может быть воздействие экзогенных оксидантов, таких как перекись водорода (Н2Ог)
i
или генераторы супероксидного аниона (О2 ) (паракват, менадион и др.). Одним из главных внутриклеточных источников АФК может быть дыхательная цепь, продуцирующая их, как побочные продукты в процессе
аэробного метаболизма (Imlay, Fridovich, 1991; Gonzalez-Flecha, Demple, 1995). Повышение концентрации АФК до уровня, вызывающего окислительный стресс, может происходить в результате нарушения нормального метаболизма при экстремальных воздействиях. Изучение роли антиоксидантных систем и их активности у бактерий при различных воздействиях, не связанных с прямым действием экзогенных оксидантов, " находится в начальной стадии. Роль антиоксидантных систем при
• воздействии на бактерии лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков - одна из мало изученных проблем в этой области. Хотя потенциальное участие антиоксидантных систем в устойчивости к антибиотикам и другим лекарственным препаратам в настоящее время не вызывает сомнений, остается много нерешенных проблем в этой области. Так известно, что обработка бактерий Е. coli рядом антибиотиков и лекарственных препаратов приводит к индукции гена sodA, кодирующего супероксиддисмутазу А, в то же время роль других компонентов антиоксидантной защиты изучена недостаточно. Нет ясности в вопросе о роли в устойчивости бактерий к антибиотикам и лекарственным препаратам такого важного антиоксиданта как глутатион, играющего в
у эукариотических клетках ключевую роль в защите от оксидантов и
• ксенобиотиков. Мало данных о влиянии такого широко распространенного препарата как ацетамидофенол (парацетамол) на активность антиоксидантных систем и их роль при действии этого препарата на бактерии. В совокупности анализ научной литературы показывает, что данные о роли этих систем в ответе бактерий Е. coli на действие антибиотиков и ацетамидофенола немногочисленны и противоречивы. В этой связи выявление роли антиоксидантных систем на действие антибиотиков и ацетамидофенола является актуальной задачей.
Цель настоящего исследования — изучение роли антиоксидантных систем в ответе растущих бактерий Escherichia coli на действие антибиотиков, обладающих разным механизмом действия, и ацетамидофенола.
Основные задачи исследований:
1. Используя штаммы со слияниями генов, кодирующих компоненты антиоксидантных систем с геном /?-галактозидазы, изучить влияние грамицидина, хлорамфеникола, рифампицина и ацетамидофенола на экспрессию антиоксидантных генов.
2. Изучить влияние антибиотиков и ацетамидофенола на внутри- и внеклеточный статус глутатиона.
3. Используя штаммы Е. coli, несущие мутации в генах, кодирующих компоненты антиоксидантных систем, изучить роль этих систем в устойчивости бактерий к антибиотикам и ацетамидофенолу.
4. Исследовать влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных антибиотиками и ацетамидофенолом.
5. Исследовать комбинированное действие антибиотиков и ацетамидофенола на рост Е. coli.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние антибиотиков с разным механизмом действия (грамицидина, хлорамфеникола, рифампицина) и ацетамидофенола на уровень внутри- и внеклеточного восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона и соотношение GSH:GSSG в растущих бактериях Escherichia coli. Обнаружено, что обработка бактерий такими соединениями как грамицидин и ацетамидофенол приводит к снижению концентрации внутриклеточного глутатиона и к одновременному повышению внеклеточного глутатиона. В то же время, обработка рифампицином вызывает повышение уровня внутриклеточного глутатиона при одновременном снижении внеклеточного глутатиона. Таким образом, показано, что антибиотики с разным механизмом действия способны влиять на концентрацию глутатиона внутри и снаружи клетки.
Обнаружена существенная роль глутатиона в устойчивости к грамицидину, рифампицину и ацетамидофенолу.
Показано, что обработка бактерий грамицидином и ацетамидофенолом приводит к изменениям в активности антиоксидантных систем, характерным для окислительного стресса.
Обнаружено, что при совместном действии исследуемых антибиотиков с ацетамидофенолом ингибирующее действие этих соединений на рост носит аддитивный характер.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в этой работе данные расширяют наше представление о роли антиоксидантных систем в жизнедеятельности микроорганизмов и понимание механизмов, контролирующих адаптацию бактерий к различным стрессам, в том числе, к действию антибиотиков и других лекарственных веществ.
Ацетамидофенол является основой популярных и широко применяемых в терапии лекарств (парацетамола, панадола, солпадеина и т.п.) Данные о действии ацетамидофенола на бактерии, а также комбинированного действия ацетамидофенола и антибиотков могут иметь практическое значение, поскольку затрагивают актуальные проблемы медицины и экологии микроорганизмов, связанные с воздействием антибиотиков и других лекарственных препаратов на нормальную микрофлору кишечника. Известно, что неконтролируемое применение антибиотиков и других лекарственных веществ часто приводит к побочным эффектам, связанным с подавлением нормальной микрофлоры и дисбактериозам. Наши исследования свидетельствуют о том, что
и
одновременное применение ацетамидофенола и антибиотиков может потенциально усиливать их ингибирующее действие на рост и развитие Е. coli, являющейся представителем нормальной микрофлоры человека и животных.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Глутатион вносит вклад в защиту растущих бактерий Escherichia coli от грамицидина, рифампицина и ацетамидофенола.
2. Обработка клеток Е. coli грамицидином, рифампицином и ацетамидофенолом приводит к изменениям, характерным для окислительного стресса.
3. Обнаруживается выраженное сходство в действии грамицидина и ацетамидофенола на растущие клетки Е. coli.
4. При комбинированной обработке ингибирующее действие ацетамидофенола и испытуемых антибиотиков на рост и накопление биомассы носит аддитивный характер.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 6-й и 7-й Пущинских школах - конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2002 и 2003 годы; на Межрегиональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии". Пермь, 2002 г.; Междисциплинарной конференции с международным участием "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека ("НБИТТ-21"), Петрозаводск, 2003.
По теме диссертации опубликовано 5 работ. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 162 страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и 37 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 265 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме "Изучение неспецифического отклика и адаптивных реакций клеток на различные стрессовые воздействия" (индекс приоритетного направления 4.1.13, номер госрегистрации 01910055305). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 01-04-48129 и № 03-04-49137.
Реактивные формы кислорода и их токсическое действие на клетки
Кислород является неотъемлемой частью жизнедеятельности подавляющего большинства живых организмов, которые, за исключением незначительного количества анаэробных бактерий, полностью зависят от наличия кислорода в среде. В первую очередь кислород необходим для образования АТФ в процессе окислительного фосфорилирования, которое связано с восстановлением молекулы О2 до воды и является основным энергообразующим механизмом аэробов. Хотя АТФ образуется и в анаэробных условиях, в количественном отношении эффективность анаэробного синтеза намного ниже. Если у эукариот окислительное фосфорилирование происходит в специализированных органеллах митохондриях, то у бактерий, не имеющих внутриклеточных мембранных структур, оно осуществляется на плазматической мембране (Скулачев, 1989).
При аэробном дыхании основная часть потребляемого клетками кислорода подвергается четырехэлектронному восстановлению ферментами дыхательной цепи с образованием нейтральной молекулы воды. Наряду с этим во время дыхания протекают реакции одно-, дву- и трех-электронного восстановления кислорода с образованием супероксидного радикала (супероксид аниона, О2 ), перекиси водорода (Н2О2), гидроксильного радикала ОН и других активных форм кислорода (АФК) (Fridovich, 1978; Chance et al, 1979; Pryor, 1986). H2O2 и О2 могут также возникать как промежуточные продукты при нормальном функционировании ряда ферментов (Меньшикова, Зенков, 1997; Ghe et al., 1985; Ramasarma, 1990; Imlay, Fridovich, 1991). Так было показано, что в аэробно растущих Е. coli аутоокисление NADH дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, D-лактатдегидрогеназы а также флавинового кофактора сульфитредуктазы может вносить существенный вклад в генерацию Н2О2 и О2" (Imlay, Fridovich, 1991a; Imlay, Fridovich, 1991b; Gonzalez-Flecha, Demple, 1995; Messner, Imlay, 1999). Недавние иследования показали, что роль таких компонентов дыхательной цепи как хиноны и цитохромоксидазы в продукции АФК менее значительна (Messner, Imlay, 1999). Фумаратредуктаза, которая индуцируется в течение анаэробного роста, очень быстро реагирует с кислородом и может способствовать % . окислительному стрессу при переходе клетки от анаэробного к аэробному т способу существования (Imlay, 1995). Аэробно растущие клетки Е. coli обладают достаточно высокой активностью супероксиддисмутаз для поддержания стабильной концентрации О2\ на относительно безопасном уровне около 10"1 М (Gort, Imlay, 1998). Образование Н2О2 in vivo в аэробных условиях показано несколькими исследовательскими группами. Концентрация Н2О2 в клетках Е. coli в аэробных условиях составляет 107 и 10"6 М. Вероятно это безопасный уровень, поскольку порог токсичности Н2О2 составляет 10 5 М (McCormick et ah, 1976; Berglin et ah, 1982; Gonzalez-Flecha, Demple, 1995). Токсичное действие перекиси водорода и супероксид аниона, отчасти, может связываться с их прямым взаимодействием с компонентами живых клеток (Fair, и Kogoma, 1991; Fridovich, 1989, 1995). Более важной считается способность Н202и О2" быть предшественниками гидроксильного радикала (ОН"), который является высокотоксичным оксидантом. Имея высокий стандартный окислительно-восстановительный потенциал (Ео =+2.3В), гидроксильный радикал быстро вступает в реакцию практически с любыми биомолекулами в местах его образования (Basaga, 1990). Реакция Фентона — один из главных источников образования ОН" в присутствии ионов металлов с переменной валентностью (Me), таких как Fe2+ или Си+: Супероксид также может участвовать в образовании ОН в реакции, катализируемой ионами металлов (реакция Хабер-Вейсса):
Очень важной реакцией для супероксидного аниона является его спонтанная или катализируемая дисмутация, приводящая к образованию Н2О2 и О2. Токсическое действие супероксиданиона может быть также связано с его способностью повышать концентрацию свободного железа в цитоплазме за счет освобождения Fe2+ из железосерных кластеров ряда белков (Gardner, Fridovich, 1991; Keyerjmlay, 1996).
С одной стороны это ингибирует активность таких белков, а, с другой, делает доступным участие железа в реакции Фентона.
Одна из ситуаций, в которой микроорганизмы подвергаются окислительному стрессу, случается при встрече с иммунными клетками хозяина, которые продуцируют АФК как один из способов борьбы с чужеродными организмами. Хорошо установлено, что скорость .гибели патогенных микроорганизмов прямо пропорциональна скорости продукции макрофагами АФК (Fanton, Ward, 1982; Nathan, 1987). С другой стороны, нарушение образования О2 клетками крови приводит к повышению восприимчивости организма к инфекционным заболеваниям (Babior, 1978).
Обычно АФК не представляют опасности для клеток, благодаря эффективной антиоксидантной защите. В нормальных условиях скорость образования АФК и скорость их детоксикации антиоксидантными системами клеток сбалансированы так, что не происходит накопления АФК в количествах, способных оказывать токсическое действие. Однако в определенных ситуациях этот баланс может быть нарушен настолько, что происходит повышение концентрации АФК до размеров, при которых возникает опасность окислительного повреждения клетки, что и определяет сущность окислительного стресса (Fridovich, 1978).
Многочисленные данные свидетельствуют о том, что О.С. (окислительный стресс) может быть как причиной, так и следствием многих патологических состояний на уровне клеток, тканей и органов. Так, повышение скорости формирования О2" в клетках крови человека способствует возникновению воспалительных процессов, создающих угрозу развития многих заболеваний (Пескин, Столяров, 1994). Развитие О.С. показано при более чем 100 заболеваниях, в том числе ревматоидном артрите, атеросклерозе, язве желудочно-кишечного тракта, ишемической болезни сердца, астмы и других (Меньшикова, Зенков, 1997; Halliwel, Gutteridge, 1990). Другая сторона окислительных повреждений, вызванных АФК, - развитие раковых заболеваний. Было показано, что во время окислительного стресса возрастает экспрессия протоонкогенов c-fos и c-mys, и значительно снижается, по сравнению с. нормальными клетками, уровень антиоксидантных ферментов (Пескин, Столяров, 1994). С окислительными повреждениями внутри клеток связывают также свободнорадикальный механизм старения и программированной клеточной смерти (апоптоза) (Дильман, 1986; Slater et ah, 1996; Hochman, 1997).
Определение GSSG внутри клетки
Приготовление инокулята. Клетки Е. coli выращивали на минеральной среде М9 (рН 7.0) следующего состава (г/л): Na2SC 4 12Н2О - 15.13; КН2РО4 - 3; NH4CI - 1; NaCl - 0.5; MgSO4 7H2O - 0.246; СаС12 - 0.011 с добавлением 4 г/л глюкозы (Miller, 1972). В среду кроме глюкозы, добавляли 0.2 % казаминовых кислот и тиамин (10 мкг/мл). Там, где это было необходимо, в ночную культуру добавляли соответствующий антибиотик (25 мкг/мл). Бактерии Е. coli переносили с агарового косяка в стерильные флаконы, содержащие 100 мл среды, и культивировали в термостате при 37С в течение 18-20 часов. 20 мл этой культуры переносили в 100 мл свежей среды такого же состава, и далее использовали для экспериментов.
Культивирование. В зависимости от варианта опыта бактерии выращивали в аэробных или в анаэробных условиях. В первом случае клетки Е. coli культивировали в колбах на установке для выращивания микроорганизмов УВМТ 12-250 при 37С и 150 об/мин. Для создания анаэробных условий бактерии культивировали в термостате без перемешивания. Предварительные измерения показали, что в этих условиях парциальное давление кислорода в среде падает до очень низких значений даже при невысоких плотностях биомассы.
За ростом бактерий следили по изменению поглощения при 670 нм, измеряемому на фотометре КФК-3 (толщина кюветы 5 мм). Обработку бактерий оксидантами проводили в середине логарифмической фазы роста, когда плотность культуры составляла 0.3-0.4 г сухих клеток на литр.
В работе использовались реагенты, полученные от «Sigma»: казаминовые кислоты, тиамин, фермент глутатионредуктаза, DTNB, ЭДТА, НАДФН, GSH, GSSG, NEM, ОНФГ, агар, меркаптоэтанол, дезоксихолат, антибиотики. Остальные реагенты, использованные для приготовления растворов и сред были отечественного производства, классифицируемые как х.ч.
Для определения общего глутатиона (GSH + GSSG) 15 мл культуры Е. coli центрифугировали и супернатант использовали для определения общего глутатиона. Осадок ресуспензировали в 5 мл 0.02 М ЭДТА и клетки разрушали с помощью ультразвука. Восстановленный (GSH) и окисленный (GSSG) глутатион определяли спектрофотометрически (Tietze, 1969) в последовательности, описанной ранее (Smirnova et al., 2000). Для осаждения белка к бесклеточному гомогенату приливали 0.2 мл 5 М НСЮ4 и затем осаждали белок центрифугированием. Избыток хлорной кислоты нейтрализовали 5Н КОН, доводя рН до 7.5. Для удаления перхлората калия пробы сначала охлаждали, а затем центрифугировали. Реакционная смесь для определения общего глутатиона содержала бесклеточный гомогенат, из которого осадили белок, 0.1М Na-фосфатный буфер (рН 7.5), 5,5-дитиобис-2-нитробензойную кислоту (DTNB), глутатионредуктазу и НАДФН. Поглощение пробы измеряли через 3 минуты после добавления НАДФН при 412 нм на спектрофотометре СФ-26. Контрольная кювета содержала смесь аналогичного состава за исключением того, что вместо гомогената добавляли 0.02 М ЭДТА. Концентрацию общего глутатиона рассчитывали по калибровочному графику, используя в качестве стандарта GSH. Для построения калибровочного графика использовали растворы с известной концентрацией GSH и обрабатывали их таким же способом, как и пробы с гомогенатом (рис. 3). Концентрацию общего глутатиона выражали в мкмоль/г сух. клеток.
При определении окисленного глутатиона к пробе, приготовленной таким же способом, как для определения общего глутатиона, добавляли N-этилмалеимид (NEM). После связывания с GSH избыток NEM удаляли шестикратной экстракцией эфиром. Концентрацию окисленного глутатиона определяли с помощью глутатионредуктазы, как описано выше.
Концентрацию восстановленного (GSH) глутатиона рассчитывали по разнице между концентрациями общего (GSH+GSSG) и окисленного (GSSG) глутатиона. 30 мл культуры Е. coli центрифугировали, осадок ресуспензировали в 5 мл ЭДТА, добавляли NEM до конечной концентрации 2 мМ. Клетки разрушали ультразвуком. Для осаждения белка добавляли 5М НСЮ4 и белок осаждали центрифугированием. Супернатант нейтрализовали до рН 7.5 5М КОН, пробы замораживали и затем центрифугировали. Проводили семикратное экстрагирование проб эфиром. Реакционная смесь для определения GSSG внутри клетки и контрольная кювета были того же состава, как описано в разделе 3.3. Для построения калибровочного графика использовали растворы с известной концентрацией GSSG и обрабатывали их таким же способом, как и пробы с гомогенатом (рис. 4). Концентрацию выражали в мкмоль/г сух. клеток.
Влияние условий культивирования на рост бактерий Е. coli, обработанных грамицидином
Однако уровень внеклеточного окисленного глутатиона (GSSG0Ut) был на порядок выше, чем в цитоплазме и, соответственно, соотношение GSHout:GSSGout было также на порядок ниже, чем GSHin:GSSGin (табл. 7;8). Это подтверждает известные ранее данные (полученные на основе анализа других параметров) о том, что в аэробных условиях в цитоплазме поддерживаются более восстановительные условия, чем с наружной стороны клеток. Однако вновь следует отметить, что в экстраклеточной среде клетки также поддерживают восстановительные условия, хотя и на более низком уровне. Грамицидин S оказывал выраженное действие на статус внеклеточного глутатиона (табл. 6;7). Через 40 мин. после добавления грамицидина (10 мкг/мл) концентрация общего глутатиона в среде увеличивалась почти в два раза и составляла 17 мкмоль/г сухих клеток при 9 в необработанных клетках. Такое увеличение концентрации общего наружного глутатиона (GSHout+GSSG0Ut) происходило за счет повышения концентрации GSHout, (табл. 6) следствием этого было соответствующее повышение соотношения GSHou,:GSSGout (табл. 8). Сравнение данных об изменениях внутри- и внеклеточного глутатиона при действии грамицидина в высокой концентрации (табл. 3;4;6;7), позволяет предположить, что увеличение внеклеточного глутатиона в этой ситуации могло происходить за счет его транспорта из цитоплазмы. . . .. Обработка клеток грамицидином S в низкой концентрации (1 мкг/мл) вызывала увеличение внеклеточного глутатиона в 2.5 раза. Примечательно, что при действии низкой концентрации грамицидина происходило увеличение глутатиона как внутри, так и снаружи клеток, тогда как при высокой концентрации антибиотика повышение внеклеточного глутатиона происходило при одновременном снижении внутриклеточного глутатиона.
Таким образом, обработка грамицидином растущих аэробно клеток Е. coli приводила к заметному повышению экспрессии трех антиоксидантных генов: sodA, soxS и gor. В то же время, не обнаружено существенного влияния обработки грамицидином на индукцию гена katG, кодирующего фермент каталаза-гидропероксидаза HPI. В опытах с грамицидином наблюдали и повышение чувствительности мутантов по синтезу глутатиона (gshA) и супероксиддисмутазам А и В (sodAB). Обработка клеток грамицидином приводила к заметному снижению уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSH) и существенному снижению соотношения GSH:GSSG. В наших условиях аэробно растущие клетки были более чувствительны к грамицидину при 42С, чем при 37С.
Суммируя приведенные выше данные, можно сделать вывод о наличии признаков окислительного стресса при действии грамицидина на растущие аэробно клетки Е. coli. Хлорамфеникол в концентрации 38 мкг/мл и выше полностью ингибировал рост Е. coli как в аэробных, так и анаэробных условиях.
На рисунках 14 и 15 показано действие хлорамфеникола при одной и той же температуре, но при разных режимах аэрации. При 37С, как в отсутствие хлорамфеникола, так и в присутствии, клетки в аэробной культуре растут лучше, чем в анаэробных условиях. В то же время, при 42С в аэробных и в анаэробных условиях клетки росли с одинаковой скоростью. Сравнивая результаты, приведенные на рисунках 14 и 15, следует сделать вывод, что при 42С обработка хлорамфениколом в аэробных условиях более сильно ингибирует рост, чем в анаэробных.
Для выяснения роли антиоксидантных систем в ответе Е. coli на обработку хлорамфениколом, измеряли удельную скорость роста бактерий, несущих мутации в генах, контролирующих различные компоненты этих систем.
Наибольшее влияние на устойчивость к хлорамфениколу (38 мкг/мл) оказывала потеря активности двух супероксиддисмутаз А и В. Растущие клетки СОД-дефицитного штамма QC909 {sodAsodB) были менее чувствительны к хлорамфениколу, чем клетки родительского штамма GC4468 {sodA+sodB+) (рис. 16) у-глутамилтранспептидаза участвует в метаболизме глутатиона в клетках разных типов, но данные о роли у-глутамилтранспептидазы в ответе на окислительный стресс у животных противоречивы, в зависимости от условий и типа клеток этот фермент может играть как положительную, так и отрицательную роль в антиоксидантной защите. Нет определенности и в вопросе о роли у-глутамилтранспептидазы при окислительном стрессе у бактерий. В наших условиях клетки Е. coli SH646 {ggt), дефицитные по синтезу у-глутамилтранспептидазы не оказывали существенного влияния на действие хлорамфеникола. Мутации gshA и katG также не влияли на устойчивость клеток к хлорамфениколу.
Влияние предобработки ацетамидофенолом на рост бактерий Е. coli, обработанных рифампицином
Ранее было показано, что обработка клеток Е. coli генератором супероксидного аниона менадионом приводит к заметному изменению статуса внутри- и внеклеточного глутатиона, которое выражалось в заметном повышении уровня окисленного внутри- и внеклеточного глутатиона, и, соответственно, снижении соотношения GSH:GSSG по обе стороны цитоплазматической мембраны (Smirnova et ah, 2000). С другой стороны, как показано выше, обработка бактерий ацетамидофенолом приводила к индукции генов, участвующих в защите от супероксидного аниона. Представляло интерес выяснить, как обработка бактерий ацетамидофенолом влияет на статус глутатиона внутри и снаружи клеток.
Обработка клеток ацетамидофенолом (7.5 мкг/мл) приводила к снижению уровня GSHjn на 40 %. Поскольку концентрация внутриклеточного окисленного глутатиона после обработки ацетамидофенолом изменялась незначительно, в клетках сохранялось высокое соотношение GSH;n:GSSGin, хотя его значение было на 50 % ниже, чем в необработанных клетках.
Обработка бактерий ацетамидофенолом приводила к увеличению внеклеточного восстановленного глутатиона на 29 %, двухкратному снижению внеклеточного окисленного глутатиона и повышению соотношения GSHout:GSSGout с 12 до 36 (табл. 3-8). Следует также обратить внимание на тот факт, что в клетках, обработанных ацетамидофенолом, увеличением концентрации GSH в среде сопровождалось одновременным снижением его уровня в цитоплазме. Это может свидетельствовать в пользу того, что обработка Е. coli ацетамидофенолом приводит к выходу некоторой части глутатиона в среду.
В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что при обработке аэробных Е. coli ацетамидофенолом не обнаруживаются существенные признаки окислительного стресса с наружной стороны клеток.
Известно, что у Е. coli внутриклеточный пул калия может контролироваться редокс-состоянием клетки и глутатион может быть важным компонентом такой регуляции. Было показано также, что как редуктанты, так и оксиданты могут модулировать трансмембранные потоки калия (Meury, Kepes, 1982; Мешу, Robin, 1990). Представляло интерес выяснить, влияет ли обработка бактерий ацетамидофенолом на уровень внутриклеточного калия. Обработка Е. coli ацетамидофенолом (7.5 мкг/мл) вызывала выход части калия из клеток, и через 60 мин после добавления ацетамидофенола концентрация внутриклеточного калия в обработанных клетках была на 10 % ниже первоначального уровня, тогда как в необработанных клетках она к этому времени повышалась на 22 % (табл. 2).
Наши результаты свидетельствуют о том, что обработка растущих аэробно клеток Е. coli ацетамидофенолом также может приводить к окислительному стрессу. На это указывает одновременное увеличение экспрессии sodA и soxS, снижение содержания глутатиона внутри клеток и соотношения GSHjn:GSSGin. Косвенным признаком окислительного стресса при действии ацетамидофенола является более высокая чувствительность аэробных культур Е. coli к ацетамидофенолу при 42С, чем при 37С. Примечательно, что ацетамидофенол ингибировал экспрессию генов katG и katE.
В этой серии опытов клетки Е. coli AB1157, растущие в аэробных условиях при 37С, сначала обрабатывались различными концентрациями ацетамидофенола, а затем через 30 минут грамицидином D в концентрации 50 мкг/мл. В качестве примера приведены данные о влиянии предоработки клеток ацетоамидофенолом в концентрции 7.5 мкг/мл (рис. 35). Как было показано выше при этой концентрации ацетамидофенол частично ингибировал рост бактерий и, в то же время, индуцировал экспрессию антиоксидантных генов. Обработка клеток одним ацетамидофенолом в этой концентрации ингибировала накопление биомассы на 13 %, а одним грамицидином - на 26 %. Добавление ацетамидофенола перед обработкой клеток грамицидином приводила к ингибированию накопления биомассы на 33 %. Если принимать во внимание изменения удельной скорости роста в первые 60 мин после добавления грамицидина или ацетамидофенола, то видно, что обработка клеток ацетамидофенолом ингибировала скорость роста на 23 %, а грамицидином — на 45 %. Обработка грамицидином в присутствии ацетамидофенола ингибировала скорость роста на 65 %. Таким образом, анализ обоих ростовых параметров свидетельствует о том, что в описываемых условиях при совместном действии ацетамидофенола (7.5 мкг/мл) и грамицидина D (50 мкг/мл) наблюдался аддитивный эффект. Этот эффект наблюдался и при действии ацетамидофенола в концентрациях 5 и 10 мкг/мл. Предобработка клеток ацетамидофенолом в низкой концентрации (1 мкг/мл) не влияла на последующее действие грамицидина.
