Содержание к диссертации
Введение
Глава I Метаболизм и биологические эффекты нитроароматических соединений 14
1.1. Ароматические нитросоединения, их химические характеристики и практическое применение 14
1.2.Пути биотрансформации некоторых представителей нитроароматических соединений 16
М ГЗ.Генотоксические свойства нитроарилов 22
1.4.Токсические свойства нитроарилов 25
Глава 2. Строение и свойства клеточной стенки грамотрицательных бактерий 28
2.1 . Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий 29
2.2.Вариабельность барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны грамотрицательных бактерий 32
Глава 3. Жизнеспособное, но некультивируемое состояние аспорогенных бактерий35
Заключение по обзору литературы 39
Экспериментальная часть 41
Глава 4.Материалы и методы исследований 41
4.1. Микроорганизмы, среды и условия культивирования 41
4.2.Микробиологические методы 41
4.2.1 .Определение концентрации биомассы 41
4.2.2.Подсчет общего количества бактериальных клеток 41
4.2.3.Определение количества живых клеток микроорганизмов 42
4.2.4.Микроскопические наблюдения 42
4.2.5. Опре деление размеров клеток 42
4,2,6.Определение показателя преломления бактериальных клеток 42
4.2.7.Определение барьерных свойств внешней липолротеидной мембраны 43
4.3.Химические и биохимические методы 43
4.3.1 .Определение эффективности трансформации ТНТ 43
4.3.2,Интегральная оценка количества продуктов нитровосстановления 44
4.3.3.Выделение и идентификация метаболитов трансформации ТНТ 44
4.3.4.Определение количества нитритов 44
4.3.5.0пределнние концентрации глюкозы 45
4.3.6.Определение количества окисленных и восстановленных кофакторов 45
4.4.Метод проточной цитофлуориметрии 46
4.4.1 .Определение трансмембранной разности электрических потенциалов 46
4.4.2.Определение проницаемости внутренней плазматической мембраны 46
4.5.Статистическая обработка результатов 47
Глава 5.Резулыаты исследований и их обсуждение 48
5.1. Оценка барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны штаммов Е. coli 48
5.2.Влияние ТНТ на рост и деструктивные свойства Е, coli К12 и Е. coli 055 51
З.З.Влияние ТНТ на морф о физиологические свойства клеток К coli К12 65
5.3.1 .Влияние ТНТ на морфологию и размеры клеток Е. соїіКП 65
5.3.2.Изменеиие показателя преломления и гранулярности клеток Я. соНК.12, культивируемых с ТНТ 69
5.3.3.Влияние ТНТ на проницаемость внешней липопротеидной мембраны и плазматической мембраны клеток Е.со1гК12 74
5.3.4.Влияние ТНТ на содержание кофакторов клеток Е. coli К12 культивируемых в присутствии ТНТ и на катаболизм глюкозы 76
5.3.5.Подавление 2,4,6-тринитротолуолом аккумуляции энергии и изменение энергетического профиля популяции клеток Е.СОІІК12 81
Заключение 87
Выводы 90
Литература 92
- Ароматические нитросоединения, их химические характеристики и практическое применение
- Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий
- Микроорганизмы, среды и условия культивирования
- Оценка барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны штаммов Е. coli
Введение к работе
Актуальность проблемы. Нитроароматические соединения традиционно используют в качестве взрывчатых веществ и сырья для производства красителей, синтетических полимеров и растворителей. Они известны так же как избирательно действующие лекарственные препараты и пестициды. Большинство из них высокотоксичные и трудноразлагаемые неприродные соединения, относящиеся к числу экологически опасных веществ.
Одним из представителей полинитроароматических соединений является 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ) - вещество, отличающееся выраженными токсическими свойствами и устойчивостью к биодеградации. Как следствие деятельности военных отраслей промышленности и военных объектов в различных регионах мира выявлены большие территории, загрязненные остатками взрывчатых смесей, основным компонентом которых является ТНТ [Fernando et al., 1990; Comfort et al., 1995; Scheibner et al., 1997]. С увеличением уровня производства ТНТ, вызванного потребностями военных, возрастает значение ремедиации мест производства ТНТ, оказывающего вредное влияние на окружающую среду.
В настоящее время наряду с физическими и физико-химическими способами детоксикации отходов, загрязненных ТНТ, разрабатываются подходы для их биоремедиации с использованием микроорганизмов: грибов [Fernando et al., 1990; Hawarl et al., 1999], анаэробных [Boopathy, Kulpaing, 1992; Boopa-thy et al., 1993] и аэробных бактерий [Наумова с соавт., 1979; Наумова с со-авт. 1988; Boopathy et al., 1994; Kalafut et al., 1998]. Механизм биотрансформации ТНТ аэробными и аэротолерантыыми микроорганизмами интенсивно исследуется [Boopathy et al., 1994; Fuller, Manning, 1997; French et al., 1998; Kalafut et al., 1998; Наумов с соавт., 1998, І999; Hawari et al., 2000; Esteve-Nunez et al., 2001; Зарипов с соавт., 2002; Zarlpov et al., 2002],
Известно, что аэробные грам отрицательны e и грамположитель-ные бактерии различаются по чувствительности к токсическому действию ТНТ [Наумова с соавт., 1982 а] и по стратегии трансформации
ксенобиотика [Kalafut et al., 1998]. Отмечается высокая устойчивость к токсическому действию ксенобиотика у грамотрицательных микроорганизмов по сравнению с грамположительными. Вероятно, это является причиной преобладания грамотрицательных бактерий в почвах загрязненных ксенобиотиком. Механизм такой устойчивости может быть обусловлен различными причинами. В том числе наличием в структуре
vy клеточной стенки внешней липопротеидной мембраны (ВЛПМ), вы-
полняющей функцию дополнительного защитного барьера клетки и препятствующего одномоментному поступлению в клетку высоких концентраций ксенобиотика. Однако известно, что стабильность и проницаемость ВЛПМ штаммов грамотрицательных видов может существенно различаться. Следствием этого возможны внутривидовые
Ч отличия в устойчивости штаммов к токсическому действию ксенобио-
тиков, в том числе и ТНТ. Нельзя исключить, что подобные различия могут сказаться и на особенностях стратегии трансформации ксенобиотика устойчивыми и чувствительными штаммами. В частности, стратегия транс формации чувствительными штаммами грамотрицательных бактерий может быть зависима от токсического пресса ксеио-
^ биотика, подобно стратегии, описанной нами ранее для аэробной
Bacillus subtilis SKI, чувствительной к токсическому действию ТНТ. Несмотря на привлекательность высказанных предположений, мы не нашли их экспериментального подтверждения.
Токсическое действие различных веществ может не только подавлять жизнеспособность микроорганизмов, но и вызывать их адаптацию к новым
4 условиям существования, механизмы которой могут быть разнообразными. В
основе адаптации микроорганизмов к токсическим веществам нередко лежит использование как специальных ферментов детоксикации, так и различных ферментных систем обмена веществ клетки. Количество и последовательность использования ферментных систем обмена веществ клетки для детоксикации будут зависеть от совокупности их свойств и, в частности, от устой-
*
чивости ферментов к инактивируюгцему (ингибирующему) действию ксенобиотика и от значения каталитической константві в реакциях превращения ксенобиотика как субстрата. Исходя из этого, логично предположить, что концентрация ТНТ может оказать решающее значение на его трансформацию той или иной ферментной системой клетки, что, возможно, и определяет особенности так называемой стратегии трансформации. Адаптационные процессы к неблагоприятным условиям среды обитания не ограничиваются реакциями детоксикации, а затрагивают целый ряд морф о физиологических показателей клеток [Пронин с соавт., 1982; Мулюкин с соавт., 1996; Мулюкин с соавт., 1997; Мулюкин, 1998; Головлев, 1998; Куриыенко с соавт., 2003]. Влияние высоких концентраций ТНТ на адаптационные изменения метаболизма и морфофизиологические показатели клеток грамотрицательных бактерий - деструкторов практически не исследованы, несмотря на то, что такие исследования имеют несомненное теоретическое и практическое значение.
Цель и задачи исследования. В связи с выше изложенным, цель работы - установить различия в чувствительности к токсическому действию 2,4,6- тринитротолуола штаммов Escherichia coli, отличающихся барьерными свойствами внешней липопротеидной мембраны, и оценить адаптационные изменения штамма Escherichia coli, способного к полной элиминации ксенобиотика, в ответ на токсический стресс.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:
Разработать метод определения барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны грамотрицательных бактерий. Провести сравнение барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны исследуемых штаммов Escherichia coli.
Оценить способность штаммов, различающихся стабильностью и проницаемостью внешней липопротеидной мембраны, к деструкции ксенобиотика.
Определить влияние различных концентраций 2,4,6-тринитротолуола на изменение стратегии его трансформации штаммами Escherichia coli, различающимися стабильностью и проницаемостью внешней липопротеидной мембраны.
Используя традиционные методы микробиологических исследований и проточную цитофлуориметрию установить характер воздействия высоких концентраций 2,4,6-тринитротолуола на морфофизиологические свойства клеток штамма Escherichia coli К12, способного к полной элиминации ксенобиотика.
Научная новизна работы. Разработан метод оценки барьерных свойств ВЛПМ грамотрицательных бактерий, основанный на различии в чувствительности штаммов Е. coli к анионному поверхностно активному веществу - натриевой соли, ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Аэрозоль ОТ, АОТ) и основному фуксину.
Впервые установлено, что штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий, различающиеся по чувствительности к токсическому действию ксенобиотика, адаптируются к токсическим концентрациям, используя как стратегию нитровосстановяения, так и денитритации. С увеличением концентрации ксенобиотика происходило изменение стратегии его трансформации с образования продуктов нитровосстановяения иа образование нитритов, как у изученной ранее грам положительной В. subtilis SKI, чувствительной к токсическому действию ТНТ [Куриненко с соавт., 2003].
Впервые установлено, что изменение стратегии трансформации ксенобиотика различными штаммами одного и того же вида грамотрицательных бактерий, различающихся барьерными свойствами внешней липопротеидной мембраны, зависит от концентрации ТНТ. Смена образования продуктов нитровосстановления на продукты денитритации происходит при более низкой концентрации ксенобиотика у штамма, обладающего менее стабильной и более проницаемой ВЛПМ.
Впервые, на примере штамма Е. coli К12, обладающего наиболее
стабильной и наименее проницаемой внешней липопротеидной мембраной, установлено, что действие высокой концентрации ТНТ(200мг/л) в аэробных условиях сопровождается изменением морфологических показателей клеток: уменьшением размеров, увеличением их плотности и изменением морфологии части клеток популяции с палочковидной на кокковидную.
Впервые, с помощью метода проточной цитофлуориметрии, установлено, что ТНТ оказывает иншбирующее действие на механизмы, ответственные за энергетический статус клеток Е. coli, что проявляется в снижении их трансмембранного потенциала (Ду).
Впервые также установлено различие в так называемом энергетическом профиле популяции - в количественном распределении клеток популяций контроля и «ТИТ-клеток» по значению A\j/. В обеих популяциях, в зависимости от фазы роста в контроле и концентрации ТНТ в «ТНТ-клетках», имелись субпопуляции с высоким и низким значением Ду. В контроле бимодальное распределение клеток по значению Д\|/ имело место в лаг-фазе и при переходе в стационарную фазу роста. Для «ТНТ-клеток» бимодальное распределение по значению Д\|/ определялось во всем диапазоне высоких концентраций ТНТ.
Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены доказательства того, что изменение стратегии трансформации ТНТ зависящее от концентрации ксенобиотика и впервые описанное нами для аэробной грамположительной В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003], получило подтверждение для грамотрицательной Е. coil Это обосновывает необходимость выяснения механизма переключения стратегии нитровосста-новления на денитритацию и выяснения молекулярного механизма денитри-тации, который до сих пор не известен. Знание деталей этих механизмов представляет интерес для фундаментальной науки, в частности раздела, изучающего регуляцию метаболизма микроорганизмов в экстремальных условиях жизнеобеспечения.
Установлено, что ТНТ в токсических концентрациях вызывает структурно-функциональные перестройки клеток Е. coll, что проявляется в уменьшении размеров, и увеличении удельной плотности, подавлении аккумуляции энергии. Эти перестройки обратимы и со снижением концентрации ксенобиотика происходит нормализация морфофизиологических показателей клеток. Эти данные имеют практическое значение. Их целесообразно учитывать при определении кинетических параметров роста бактерий в условиях токсического стресса. Пренебрежение этими данными при определении кинетических параметров роста бактерий, культивируемых в условиях токсического стресса, может привести к некорректным выводам, если эти параметры сформулированы на основе оптической плотности культуры.
Переключение стратегии трансформации ТНТ имеет не только научное, но и практическое значение. Его необходимо учитывать при использовании аэробных грамотрицательных бактерий или сообщества микроорганизмов для биодеградации отходов, содержащих ксенобиотик.
Основные положения, выносимые не защиту.
Вид Е. соїі демонстрирует высокую вариабельность барьерных свойств внешней липопопротеидной мембраны.
Штамм Е. coll. К12 со стабильной внешней липопротеидной мембраной по сравнению со штаммом Е. coli 055 с более проницаемой и менее стабильной ВЛПМ обладает способностью к более быстрой и полной элиминации ТНТ из среды культивирования.
Токсическое действие ТНТ по отношению к шт. Е. coli К12 проявляется в диссоциации культуры на две жизнеспособные субпопуляции, характеризующиеся выраженными морфологическими и физиолого-биохимическими отличиями.
Клетки Е. coli К12, культивируемые в присутствии высоких концентраций ТНТ, отличаются более мелкими размерами, увеличением удельной плотности, повышенной проницаемостью ВЛПМ.
5. Высокая концентрация ТНТ приводит к снижению скорости утилизации глюкозы штаммом Е. coll К12, уменьшению в клетках штамма количества восстановленных никотинамидадениндинуклеотидов и увеличению восстановленных флавопротеидов.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение 2001-2005гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета «Молекулярные механизмы ответа клетки на раздражение. Влияние природы и силы раздражителя, функционального состояния клетки и степени ее дифференцированное на содержание клеточного ответа» (№ гос. регистрации 01.2.00.1.15733, научный руководитель д.б.н. проф. Б.М. Куриненко). Постановка задачи диссертационного исследования принадлежит научному руководителю работы д.б.н. проф. Б.М. Куриненко. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Трансмембранную разность электрических потенциалов (трансмембранный потенциал - Д\|/) бактерий, проницаемость внутренней плазматической мембраны, прямое светорассеяние FSC (показатель размера клетки) и боковое светорассеяние SSC (показатель гранулярности цитоплазмы) определяли совместно с д.м.н. проф. Г.В. Черепневым и врачом-лаборантом Т.А. Вели-жинской, на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA) па базе лаборатории иммунологии Республиканской Клинической Больницы № 2 Министерства Здравоохранения Республики Татарстан. Определение количества окисленных и восстановленных кофакторов проводили совместно с к.б.н. Р.Э. Давыдовым на спектрофлуориметре «S1GNE - 4М» на базе лаборатории инженерной энзимологии Казанского Государственного Университета им. В.И. Ульянова-Ленина.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ (Казань, 2001, 2002, 2003, 2004), школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пу-
щино, 2003, 2004), XII и XIII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю доктору биологических наук профессору Б.М. Курииенко, за чуткое руководство; кандидату биологических наук Г.Ю. Яковлевой за поддержку и внимательное отношение к работе; кандидату биологических наук Р.Э. Давыдову за определение количества окисленных и восстановленных кофакторов и участие в обсуждении результатов; доктору медицинских наук Г.В. Черепневу и. врачу-лаборанту Т.А. Велижинской; за возможность осуществления цитофлуориметрии на базе лаборатории иммунологии РКБ №2 МЗРТ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 4 таблицы, 18 рисунков. Библиография содержит 173 источников, из них 120 зарубежных авторов.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Ароматические нитросоединения, их химические характеристики и практическое применение
Ароматические нитросоединения представляют собой один из важ % нейших классов химических соединений.
Нитроароматические соединения (нитроарилы) - нитрозамещенные производные моно- и полициклических ароматических углеводородов. Основной способ получения нитроарилов - замена атомов водорода в бензольном кольце на нитрогруппу [Schoffield, 1980; Beland et al., 1985].
Известно, что, по крайней мере, 10% производства в химической про мышленности, так или иначе, связано с ароматическими нитросоединениями [Rickert, 1987]. Основные области применения - производство красителей, пластмасс, кинофотоматериалов, ускорителей вулканизации и стабилизато ров в резиновой промышленности, пептидный синтез [Давиденко с соавт., 1990]. На основе нитроарилов производится ряд лекарственных препаратов нитрофураны, составившие целую эпоху в развитии фармакологии в 50-х щ годах [Ebringen, Bencova, 1980; Amgar et al., 1983], а также многочисленные соединения ряда тиофена, пиррола, тиазола и т. д. [Давиденко с соавт., 1990]. Различные нитроароматические соединения широко используются в качестве инсектицидов, гербицидов и фунгицидов [Мельников, 1974; Duque et al., 1993]. Большинство нитроарилов предлагаются к использованию как взрыв чатые вещества, компоненты зажигательных смесей и ракетных топлив [Urbanski, 1984]. Выхлопные газы автомобилей, продукты сгорания различ ных видов топлива, являющиеся основными загрязнителями воздуха, содержат значительные количества потенциально опасных ароматических нитро-соединений: 1,8-динитропирен, 1-нитропирен, 2-нитро-4,6-дихлорфенол и др. [Gibson, 1983; Tokiwa, Ohnishi, 1990].
Одной из существенных особенностей многих нитроароматических со единений является выраженная стабильность [Fewson, 1981; Haigler, Spain, 1993]. Известно, что некоторые соединения данного класса длительное время сохраняются в воде, почве, оказывая токсическое действие на все виды организмов [Иличкина, 1984; Скрябин, Головлева, 1976]. Даже спустя 50 лет после Второй мировой войны на территории бывших военных заводов в почве обнаруживаются значительные количества ТНТ, что свидетельствует об устойчивости этого соединения к естественной деградации [Preuss et al., 1993;Siminietal., 1995].
Стабильность нитроарилов, по мнению ряда авторов [Bruhn et al, 1987; Higson, 1991], обусловлена снижением электронной плотности в ароматическом кольце из-за присутствия нитрогрупп, что в свою очередь лрепятствует электрофильной атаке оксигеназ. Таким образом, основной этап в биодеградации нитроарилов - освобождение молекулы от нитрогрупп.
Активное применение ароматических нитро со единений привело к тому, что на сегодняшний день они представляют собой один из важнейших классов загрязнителей окружающей среды [Lewtas, Nishioka, 1990]. Известно, что многие из них - высокотоксичные соединения [Ellis et al., І980], более того, с конца 70-х годов, когда впервые были обнаружены мутагенные свойства ряда нитроарилов [McCann et al., 1975], не вызывает сомнений генетическая опасность данного класса соединений.
Одним из представителей нитроароматических соединений является 2,4,6- тринитротолуол (ТНТ) - взрывчатое вещество, находящее широкое применение в военной промышленности благодаря некоторым своим свойствам: низкая температура плавления, устойчивость к физическим воздействиям, относительно безопасные методы производства [Urbanski, 1984; Pal, Ryon, 1985; Ryon, Ross, 1990]. Вместе с тем это соединение отличается выраженными токсическими свойствами и устойчивостью к биодеградации, что позволяет отнести его к числу опасных загрязнителей воды и почвы. К примеру, в почвах некоторых индустриальных районов обнаруживаются свыше 10 г/кг почвы ТНТ [Fernando et al., 1990; Duque et al., 1993]. Актуальной яв ляется проблема загрязнения ТНТ различных водоемов, в особенности источников питьевой воды [USEPA, 1989; Ryon, Ross, 1990; Bennett, 1994].
Таким образом, все вышеизложенное определяет необходимость изучения механизмов биотрансформации нитроарилов, метаболических путей их активации и инактивации, возможных токсических эффектов, в том числе и на организмы-деструкторы.
Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий
Под электронным микроскопом клеточная стенка грамотрицательных бактерий представляет собой многослойную структуру. Внутренний электронно-плотный слой толщиной порядка 2—3 нм., состоит из пептидоглика-на. Снаружи к нему прилегает, как правило, волнистый слой (8—10 нм), имеющий характерное строение: две электронно-плотные полосы, разделенные электронно-прозрачным промежутком. Такой вид характерен для элементарных мембран. Поэтому трехконтурный внешний компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий получил название наружной мембраны.
Пептидогликан образует только внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегая к цитоплазматической мембране. Для разных видов грамотрицательных эубактерий содержание этого гетерополимера колеблется в широких пределах. У большинства видов он образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся поперечными связями между гетеропо-лимерными цепями. Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки — наружная мембрана. Она состоит из фос-фолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида [Stanier, 1941; Gupta et al., 1998].
Специфическим компонентом наружной мембраны является липополи-сахарид (ЛПС) сложного молекулярного строения, занимающий около 30—40% ее поверхности и локализованный во внешнем слое. ЛПС - это ам-фифильная молекула, состоящая из трех компонентов: лияида А, базисной части, или ядра и О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями. Ли-пополисахарид "заякорен" в наружной мембране липидом А, придающим токсичность полисахариду отождествляемому поэтому с эндотоксином. От липида А отходит базисная часть липополисахарида. Наиболее постоянной частью ядра липополисахарида является кетодезоксиоктановая кислота. О-специфическая цепь, отходящая от ядра липополисахарида, определяет серо-группу, серовар (разновидность бактерий, выявляемая с помощью иммунной сыворотки) определенного штамма бактерий. Таким образом, с понятием липополисахарида связаны представления об О-антигене, по которому можно дифференцировать бактерии. Отрицательный заряд ЛПС обеспечивает сильный отрицательный заряд наружной мембране грамотрицательных микроорганизмов. Одна из наиболее важных функций ЛПС - это заякоривание в наружной мембране мембранных белков [Hancock, 1984].
Липофильный слой наружной липопротеидной мембраны практически непроницаем для экзогенных гидрофильных соединений, к которым относится большинство питательных веществ (сахаров, аминокислот) и антибиотиков. Транспорт перечисленных соединений внутрь бактериальной клетки осуществляется через воронкообразные белковые структуры (пориновые каналы), встроенные в липополисахаридный слой. Гидрофобные соединения (среди антибиотиков к таковым относятся хинолоны, макролиды и тетрацик-лины) способны диффундировать через липополисахаридный слой. Сравнительно высокомолекулярные антибиотики, такие как гликопептиды, природные пенициллины с трудом проникают через пориновые каналы грамотрицательных бактерий, чем и объясняется природная устойчивость этих микроорганизмов к перечисленным препаратам. Характер окраски по методу, предложенному Гансом Христианом Иоахимом Граммом (сокращенно по Грамму) полностью коррелирует с особенностями строения клеточной оболочки. Кристаллический фиолетовый более прочно удерживается в гидрофильной области многослойного лептидогликана и тейхоевых кислот грамположи-тельных бактерий. Вымывание же красителя из липофильной наружной мембраны грамотрицательных бактерий происходит очень быстро, в результате чего эти микроорганизмы утрачивают синий цвет [Сидоренко, 2000].
Помимо слоев клеточной стенки, типичных для большинства грамот-рицательных бактерий, у некоторых представителей этой группы обнаружены дополнительные слои, так называемые S-слои, разной электронной плотности, располагающиеся с внешней стороны от наружной клеточной мембраны. Однако до настоящего времени не ясно, относятся ли они к клеточной стенке, являясь результатом ее последующего усложнения, или же представляют собой структурные элементы многослойного чехла. S-слой, представляющий собой паракристаллическую белковую структуру, покрывает всю поверхность бактериальной клетки [Baumeister et al., 1987]. У грамотрица-тельных бактерий S-слои примыкают к липидному бислою снаружи внешней мембраны. Субъединицы S-слоев могут связываться с липид-липополисахаридным комплексом, с белками наружной мембраны, с пепти-догликаном или ассоциированными с пептидогликаном нейтральными полисахаридами, гидрофобными, водородными связями и прямым электростатическим взаимодействием [Beveridge,1981].
Функциональная роль S-слоев до конца не выяснена, но будучи расположенными на поверхности клетки, они участвуют непосредственно во взаимодействии клетки с окружающей средой, можно предположить что они обеспечивают организму преимущество в естественных конкурентных условиях обитания [Sleytr et al.,1988]. S-слои могут выполнять защитную функцию, способствуя термостабильности бактериальной клетки, адаптации ее к различным факторам внешнего воздействия, участвуют в поддержании формы клетки. Пористая структура S-слоев играет роль своеобразного фильтра, способствующего поступлению в клетку необходимых питательных веществ и выходу метаболитов, а также препятствующей воздействию крупных молекул литических ферментов, поверхностно-активных веществ и различных токсических агентов [Северина, 1995].
Микроорганизмы, среды и условия культивирования
Объектом исследования служили штаммы Е. coli К12, Е. coli 055, Е coli 020, Е. coli 25927, Е. coli В12, Е. coli 0124, Е. coli K2KS, Е. coli 209, Е. coli 168, Е. coli 026 из коллекции музея Казанской государственной меди Ф цинской академии.
Инокулят выращивали в колбах на 100 мл на мясопептонном бульоне (МПБ) 16-18 ч при 30С в условиях принудительной аэрации и вносили в среду до конечной концентрации 3,4 ТО7 клеток/мл. Культи вирование вели в колбах на 250 мл на качалке при 120 об./мин на синтетиче ской среде следующего состава (г/я): (NH4)2S04 - 0.5; MgS04-7H20 - 0.25; NaCl - 0.5; глюкоза - 3.0; ТНТ - 0.2; фосфатный буфер (0.2 М КН2Р04 / Na2HP04, рН 7.0)- 4 % (об./об.). ТНТ, предварительно растворенный в этаноле, вносили перед автокла-вированием в подогретую до 80С среду до конечной концентрации 20 - 200 мг/л. у9 Определение концентрации биомассы. Концентрацию биомассы определяли нефелометрическим методом, измеряя светорассеяние, вызываемое суспензией клеток микроорганизмов, на фотоколориметре КФК-2-УХЛ4.2 с красным светофильтром, при длине волны 670 нм [Методы общей бактериологии, 1983].
Подсчет общего количества бактериальных клеток. Подсчет вел-ся в счетной камере Горяева-Тома [Методы общей бактериологии, 1983]. Подсчет числа клеток проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Jena (ГДР), с объективом х 40, и окуляром х 15. Подсчитывали количество клеток микроорганизмов в 20 малых квадратах сетки. Количество клеток в 1мл суспензии вычисляли по формуле: N=[(A-J00O)/h-S)-n,rfle « N - число клеток в 1 мл. суспензии; А - среднее число клеток в малом квадрате сетки камеры Горяева-Тома; h - глубина камеры в мм; S - площадь квадрата сетки в мм ; п - разведение исходной суспензии; 1000мм3=1мл;
Определение количества живых клеток микроорганизмов. Жиз неспособность определяли путем высева на плотные питательные среды и подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Для этого клеточную суспензию в соответствующем разведении высевали в 5-7-кратной повторно сти на чашки Петри с агаризованной мясопептонной средой, которые инку бировали при 28С в течение 2 суток. Подсчет колоний производили в вари антах разведений, дающих не более 80 колоний на чашке. Данные выражали в виде средних величин с расчетом среднеквадратичных отклонений [Методы общей бактериологии, 1983].
Микроскопическое наблюдение. Проводили с помощью микро скопа Carl Zeiss Jena (ГДР) с фазово-контрастным устройством. Готовили живые и фиксированные окрашенные фуксином препараты клеток. Первые щ микроскопировали с использованием фазово-контрастного устройства, с объ ективом х 20, и окуляром х 15, вторые - с использованием иммерсионной системы, с объективом х 100, и окуляром х 15. Фотографировали цифровой фотокамерой NIKON Coolpix SI с использованием иммерсионной системы, с объективом х 100, и окуляром х 15.
Определение размеров клеток. Определение размеров клеток по ,л пуляции проводили под микроскопом с помощью окулярного винтового микрометра МОВ-1-15Х, пользуясь фазово-контрастным устройством, измеряли 20-30 клеток, указывая средние размеры клеток, и пределы колебаний, размер выражали в микронах [Методы общей бактериологии, 1983].
Определение показателя преломления бактериальных клеток. Для расчета удельной плотности клеток использовали фотометрическое опреде ление показателя преломления бактерий экстрапояяционно-графическим методом [Фихман, 1967].
Определение барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны ГВЛПМ). Барьерные свойства ВЛГТМ оценивали по разнице в КОЕ, выросших на мясопептонном агаре (МПА) и МПА с добавлением фуксина в концентрации аналогичной его количеству в дифференциально диагностической среде Эндо (0,2 г/л), а также по разнице в КОЕ, вы росших на МПА и МПА с АОТ в концентрации 10"3 % и МПА с АОТ в той же концентрации, но с добавлением фуксина [Оригинальный метод автора].
Определение эффективности трансформации ТНТ, Эффектив » ность трансформации оценивали по убыванию концентрации ТНТ в культу ральной жидкости. Для определения ТНТ использовали метод, основанный на цветной реакции ТНТ с Na2S03 в щелочных условиях [Лурье, Рыбникова, 1974]. К 5 мл культуральной жидкости после осаждения клеток центрифугированием при 3500g в течение 15 мин добавляли 20 мл дистиллированной воды и 0.5 г Na2S03. Через 5 мин добавляли 0.5 мл 8% раствора NaOH и тща щ тельно перемешивали. Через 10 мин измеряли оптическую плотность при 440 нм на фотометре КФК2УХЛ4.2. (кювета 10 мм). Концентрацию ТНТ рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов ТНТ в диапазоне концентраций 4.4 - 440 цМ. В качестве контроля использовали культуралънуго жидкость культуры Е. coli, культивируемую без ТНТ, обработанную аналогичным способом.
Оценка барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны штаммов Е. coli
При дальнейшем увеличении концентрации ТНТ количество ПНВ снижалось, и в среде начинали накапливаться нитриты. То есть оба штамма способны трансформировать ТНТ, используя стратегию нитрово останов л ения и денитритации ксенобиотика. Вместе с тем, система редукции, ответственная за образование ПНВ, у клеток штамма Е. coli 055 инактивировалась раньше, чем у штамма Е. coli К12. Соответственно в процесс трансформации ТНТ у штамма Е. coli 055 раньше, чем у штамма Е. coli К12 включалась система денитритации ксенобиотика.
Таким образом, трансформация различных концентраций ТНТ различается у исследуемых штаммов. В присутствии малотоксичных концентраций ксенобиотика среди продуктов первых реакций трансформации обоих штаммов преобладают ПНВ. Эта стратегия трансформации, как характерная для грамотрицателы-шх бактерий, описывается в литературе и для других гра-мотрипательных видов [Kalafut et al., 1998; Spain, 1995]. Однако, как видно из представленных данных на рис. 7, с увеличением концентрации ТНТ, высокотоксичной для штаммов Е. coli, наряду с ПНВ, отмечается значительное увеличение нитритов. Из литературы известна лишь способность грамполо-жительных бактерий, более чувствительных к токсическому действию ТНТ, к образованию нитритов [Kalafut et al., 1998]. Способность к образованию значительного количества нитритов, после подавления системы редукции, показана так же нами для В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003].
Представленные нами данные свидетельствуют о том, что различные штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий могут различаться по чувствительности к токсическому действию ТНТ. Они способны адаптироваться к токсическим концентрациям ТНТ, используя как стратегию нитровосстановления, так и денитритацию ксенобиотика, как и ранее изученная нами В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003]. Более высокая чувствительность к токсическому действию ТНТ клеток штамма Е. coli 055 и переключение метаболизма со стратегии нитровосстановления на денитрита цию при более низких концентрациях ксенобиотика по сравнению со штаммом Е. coli К12, находятся в соответствии с нарушением барьерной функции его ВЛПМ, а переключение стратегии трансформации у обоих штаммов с увеличением концентрации ТНТ является доказательством роли токсического пресса в этом переключении. Очевидно, что переключение стратегии трансформации ТНТ штаммом Е. coli К12 с образования ПНВ на денитрита-цию, свидетельствует о подавлении ксенобиотиком системы редукции, что следует рассматривать как проявление токсического действия ТНТ в отношении и этого штамма Е. coli.
Ранее нами было показано, что адаптационные механизмы чувствительной к токсическому действию ТНТ В. subtilis SKI, наряду с переключением стратегии нитровосстановления на денитритацию ксенобиотика, также включают в себя целый ряд морфофизиологических изменений клеток [Куриненко с соавт., 2003]. Следует ожидать, что подобные изменения либо отсутствуют, либо носят другой характер у бактерий, способных трансформировать высокие концентрации ксенобиотика. Учитывая это обстоятельство, дальнейшая работа велась со штаммом Е. coli К12, с использованием ТНТ в концентрации 200 мг/л.
Одной из особенностей ранее исследованной нами аэробной В. subtilis SKI, чувствительной к токсическому действию ТНТ, является неадекватность изменения количества клеток и оптической плотности культуры в присутствии ксенобиотика [Куриненко с соавт., 2003]. В связи с этим, мы определили интенсивность роста Е. coli К12, оценивая его по изменению D67o, общему количеству клеток и количеству КОЕ культуры в присутствии 200 мг/л ТНТ.
Полученные данные свидетельствуют о том, что De7o культуры в присутствии ТНТ на 2ч и 4ч роста были выше, чем в контроле, и становились равными контролю, начиная с 6ч культивирования (рис. 9 а). Более высокие значения D ;70 отмечались при высоких концентрациях ТНТ в среде культивирования (100 - 150 мг/л). Снижение D67o в опыте до значений в контроле происходило прн значительном снижении концентрации ксенобиотика до 18+2 мг/л и ниже.
В отличие от D67(b общее количество клеток в контроле в течение всего времени культивирования достоверно превышало количество клеток в опыте. Это же относилось и к количеству КОЕ (рис. 9 б). Таким образом, увеличение D 570 культуры Е. colt К12, растущей в присутствии высоких концентраций ТНТ, не было связано с увеличением количества клеток, а вероятнее всего, как и в случае с В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003], связано с изменением морфологии или физических свойств клеток.
Микроскопическое исследование показало, что в контроле клетки сохраняли палочковидную форму и подвижность в течение всего срока культивирования. На фиксированных окрашенных препаратах они были представлены в виде одиночных палочек или коротких цепочек (рис. 10). Клетки, растущие в присутствии ТНТ («ТНТ-клетки») претерпевали морфологические изменения. Начиная со 2ч культивирования клетки были представлены двумя формами: 85-90% - палочки, хорошо окрашивались фуксином, как и клетки в контроле, и 10-15% - круглые (кокковидные) клетки, мельче контрольных, в нативных препаратах мало подвижны и хорошо преломляли свет. К 4ч количество палочковидных форм значительно снижалось и составляло 25-30%, а количество кокковидных форм возрастало до 70-75%. Палочковидные формы «ТНТ-клеток» преимущественно одиночны, тогда как в контроле наоборот, значительная часть клеток была представлена цепочками. К 6ч в среде с ТНТ было обнаружено 60-70% палочковидных форм клеток и 30-40% кокковидных. На 8ч в опытном варианте сохранялось около 5-10% кокковидных клеток, остальные 90-95% - палочковидные клетки и цепочки палочковидных клеток, хорошо окрашиваемых, подвижных.
