Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. 2,4,6-Тринитротолуол (ТНТ) и формирование основополагающей концепции его микробного метаболизма 11
2. Токсичность и мутагенность ТНТ 16
3. Аэробный метаболизм ТНТ у прокариот 19
4. Анаэробный метаболизм ТНТ у прокариот 25
5. Метаболизм ТНТ у грибов 30
6. Метаболизм ТНТ у растений 35
7. Взаимодействие ТНТ и его интермедиатов с органическим матриксом почвы 38
8. Метаболизм динитротолуолов микроорганизмами 41
Экспериментальная часть 45
Материалы и методы 45
1. Источники и условия выделения микроорганизмов 45
2. Выделение и идентификация дрожжей 45
3. Культивирование дрожжей в отсутствие и в присутствии ТНТ 46
4. Световая микроскопия 47
5. Определение способности дрожжей утилизировать нитриты и нитраты 47
6. Определение способности дрожжей к гетеротрофной нитрификации 47
7. Аналитические методы 48
7.1. Спектрофотометрия 48
7.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 48
7.3.Масс-спектрометрия 49
7.4. Хромато-масс-спектрометрия 49
7.5. Ионная хроматография 50
7.5.1. Определение нитрит- и нитрат-ионов 50
7.5.2. Определение органических кислот 50
8. Химические реактивы 51
9. Статистическая обработка результатов 51
Результаты исследований 52
1. Выделение и идентификация микроорганизмов, способных к редукции ароматического кольца ТНТ 52
2. Трансформация ТНТ штаммом Y. lipolytica AN-L15 55
2.1. Конверсия ТНТ в аэробных условиях роста при рН 6.0 55
2.1.1. Начальный этап трансформации ТНТ 55
2.1.2. Анализ продуктов восстановления ароматического кольца ТНТ 59
2.1.3. Второй этап трансформации ТНТ 64
2.1.4. Рост дрожжей и продукция органических кислот 67
2.1.5. Трансформация ТНТ в условиях роста при повышенной моляр-ности фосфатного буфера 68
2.2. Конверсия ТНТ в аэробных условиях роста при рН 7.0 68
2.3. Конверсия ТНТ в статических условиях роста на уровне рН 6.0-7.0 71
2.4. Конверсия ТНТ в анаэробных условиях роста 75
3. Трансформация ТНТ штаммом G. candidum AN-Z4 75
4. Трансформация ВЭЖХ-очищенных ТНТ-гидридных комплексов 77
4.1. Стабильность С-3 моногидридного комплекса ТНТ 77
4.2. Абиотическое взаимопревращение ТНТ-гидридных комплексов 79
4.3. Трансформация индивидуальных ТНТ-гидридных комплексов клетками дрожжей 81
5. Превращение нитрит-иона в присутствии и в отсутствие дрожжевых клеток 82
Обсуждение результатов 87
Заключение 100
Выводы 103
Литература 105
- 2,4,6-Тринитротолуол (ТНТ) и формирование основополагающей концепции его микробного метаболизма
- Источники и условия выделения микроорганизмов
- Выделение и идентификация микроорганизмов, способных к редукции ароматического кольца ТНТ
- Стабильность С-3 моногидридного комплекса ТНТ
2,4,6-Тринитротолуол (ТНТ) и формирование основополагающей концепции его микробного метаболизма
Ароматические нитросоединения, такие как нитрофенолы, нитробензолы, нитротолуолы и нитробензойные кислоты, используются при производстве пестицидов, красителей, взрывчатых веществ, промышленных растворителей. 2,4,6-Тринитротолуол представляет собой полинитроароматическое кристаллическое соединение желтого цвета, интенсивно применяющееся как в военной промышленности, так и в качестве химического интермедиата при производстве красителей и соединений, нашедших применение в области фотографии. ТНТ имеет плотность 1.654 г/мл, обладает слабой растворимостью в воде (в пределах 104-113 мг/л) и сильной в полярных органических растворителях (метаноле, этаноле, этиловом эфире, ацетоне, ацетонитриле). Загрязнение окружающей среды этим соединением возникает в результате масштабного его синтеза и применения (Sax, Lewis, 1987; Rieger, Knackmuss, 1995; Spain, 1995).
В состав молекулы ТНТ входят три нитрогруппы, которые снижают электронную плотность его ароматической я-системы, что препятствует электрофильным атакам исходного соединения оксигеназами. Нитрогруппа содержит два электроотрицательных элемента - азот и кислород:
Так как атом кислорода обладает большей электроотрицательностью, чем атом азота, то это приводит к поляризации связи N-0. Частично положительный заряд атома азота вместе с его высокой электроотрицательностью делает нитрогруппу легко восстанавливаемой (Preuss, Rieger, 1995). Поэтому редукция по крайней мере одной нитрогруппы у ароматического кольца широко распространена среди большинства организмов.
В течение нескольких десятилетий, вплоть до 1995 г, внимание исследователей было обращено на последовательное восстановление нитрогрупп ТНТ по схеме:
Продукты двухэлектронной редукции одной из нитрогрупп ТНТ -нитрозо-динитротолуолы экспериментально никем не были обнаружены, тем не менее они, как правило, включаются в обобщенные схемы трансформации ТНТ как наиболее вероятные метаболиты на пути 2е" восстановления. Напротив, моноаминопроизводные, а именно 2-амино-4,6-динитротолуол (2-АДНТ) и 4-амино-2,6-динитротолуол (4-АДНТ), а также диаминопроизводные - 2,4-диамино-6-нитротолуол (2,4-ДАНТ) и 2,6-диамино-4-нитротолуол (2,6-ДАНТ) - в подавляющем большинстве работ рассматривались как мажорные продукты на пути трансформации ТНТ (Montpas et al., 1997; Tharakan, Gordon, 1999; Esteve-Nunez et al., 2000; Идентификация этих метаболитов базировалась на сочетании тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Именно последний метод позволил анализировать метаболиты ТНТ без предварительной экстракции этих нестойких соединений.
Уже в 1997-1998 гг последовали сообщения, утверждавшие представление о ГАДНТ как универсальных метаболитах на пути превращения ТНТ. Доказательством этого было, в частности, обнаружение способности гомо- и гетероферментативных лактобацилл Lactobacillus plantarum и Lactobacillus fermentum, соответственно, количественно превращать ТНТ в сумму изомерных ГАДНТ (Наумов с соавт., 1999). Представление о ГАДНТ как основных универсальных микробных метаболитах ТНТ было экспериментально обосновано с привлечением широкого круга микроорганизмов (Зарипов с соавт., 2004).
При восстановлении нитрогрупп ТНТ редукция первой нитрогруппы обычно протекает гораздо быстрее остальных. Конверсия нитрогруппы в аминогруппу уменьшает электронный дефицит ароматического кольца, и, следовательно, более низкий окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) необходим для редукции остальных нитрогрупп этой молекулы. Поэтому для образования 2,4,6-триаминотолуола (ТАТ) необходимы значения ОВП в пределах -200 мВ, что наблюдается только в строго анаэробных условиях (Hofstetter et al., 1999):
По мнению Аверилла (Averill, 1995), редукция нитрогрупп нитроароматических соединений (Ar-NC ) бактериями сходна с восстановлением нитрита при денитрификации по механизму двухэлектронного переноса. В пользу этого говорит тот факт, что и NO2" и Ar-NC 2 содержат азот в одинаковой степени окисления (+3), хотя распределение валентных электронов атома азота делает Ar-N02 более сходным с нитратом, чем с нитритом. В ТНТ нитрогруппы в пара положении легче восстанавливаются, чем орто нитрогруппы (Hawaii et al., 1998; Borch et al.,2005).
Нитрогруппа ТНТ также может быть восстановлена по механизму одноэлектронного восстановления, что ведет к формированию нитроанионного радикала. Этот радикал - возможное промежуточное соединение, образуемое при восстановлении нитрогруппы в нитрозогруппу. Он может реагировать с молекулярным кислородом с образованием супероксид-аниона, что ведет к образованию исходного нитроароматического соединения. Ферменты, катализирующие эту реакцию, известны как кислород-чувствительные нитроредуктазы, они обнаружены у бактерий Clostridium spp (Angermaier, Simon, 1983) и Escherichia coli (Peterson et al., 1979).
Небиологическое восстановление нитрогрупп до соответствующих аминов может протекать в осадках и почвах (Haderlein, Schwarzenbach, 1995; Haderlein et al., 2000).
Источники и условия выделения микроорганизмов
Для скрининга микроорганизмов, способных к гидридному восстановлению ароматического кольца ТНТ в сочетании с его денитрацией, использовали 428 изолятов, предварительно полученных в НИЛ ЭББ КГУ при посевах воды водоемов - рек Волги и Казанки (в пределах города Казани), активного ила аэротенков, очищающих сточные воды химического и нефтехимического комплексов, незагрязненных черноземных почв, нефтезагрязненных почв нефтедобывающего региона Татарстана, замазученных торфяников Западной Сибири, твердых отходов нефтехимии, на агаризованные среды: мясо-пептонный агар для аэробных гетеротрофов и среду Сабуро для дрожжей.
Предварительный скрининг чистых культур изолятов на способность трансформировать ТНТ по альтернативным путям осуществляли с использованием десятикратно разбавленных мясо-пептонного бульона и жидкой среды Сабуро, содержащих ТНТ в концентрации 0.22 мМ. О функционировании того или иного пути свидетельствовало характерное окрашивание сред: темно-красное в случае гидридного пути, ведущего к образованию 3-Н -ТНТ, и светло-зеленое в случае мононитровосстановления, сопряженного с аккумуляцией ГАДНТ. Содержание нитрит- и нитрат-ионов оценивали (как указано ниже) у тех штаммов, которые продуцировали ТНТ-гидридные комплексы.
2. Выделение и идентификация дрожжей
Родовая и видовая принадлежность дрожжей, выделенных в результате вышеуказанного скрининга, была проведена с использованием определителя Барнета (Barnett et al., 1983). Все физиолого-биохимические тесты проводили в соответствии с данными литературы (Бабьева, Голубев, 1979; Barnett et al., 1983). Видовая принадлежность дрожжей была уточнена по результатам секвенирования D2 региона большой субъединицы рРНК в лаборатории MIDILABS (www.midilabs.com).
3. Культивирование дрожжей в отсутствие и в присутствии ТНТ
Эксперименты по динамике трансформации ТНТ проводили со штаммами дрожжей: Yarrowia lipolytica AN-L15, выделенным из загрязненных нефтью торфяников (Лангепас, Западная Сибирь), и Geotrichum candidum AN-Z4, выделенным из нефтешлама - отхода нефтехимического предприятия "Нижнекамскнефтехим" (Нижнекамск, Татарстан). В отдельных опытах использовали Candida spp. AN-L7, AN-L13, AN-L14, AN-L20 -изоляты, выделенные в прежней работе (Zaripov et al., 2002) из нефтезагрязненных торфяников Западной Сибири.
Культуры дрожжей поддерживали в аэробных условиях на агаризованной среде Сабуро, содержащей (г/л дистиллированной воды): глюкозу - 10.0, пептон - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaCl - 0.25, агар -20.0. Для изучения трансформации ТНТ использовали синтетическую среду, содержащую: глюкозу - 28 мМ, (NH SC - 7.6 мМ, MgS04 - 2 мМ. Фосфатный буфер (рН от 6.0 до 7.0) стерилизовали отдельно и вносили перед инокуляцией в конечных концентрациях 16-192 мМ. ТНТ вносили из расчета 440 мкМ в растворе этанола (0.8 мл 95.6% этанола в 50 мл среды). В отсутствие ТНТ (контроль) в состав синтетической среды также входил этанол в том же количестве. рН среды измеряли на рН метре Accumet, Model 50.
При изучении динамики превращения ТНТ дрожжи предварительно культивировали в жидкой среде Сабуро с соответствующим рН (Y. lipolytica AN-L15 в течение одних, G. candidum AN-Z4 - двух суток), клетки осаждали центрифугированием при 8000g в течение 5 мин на центрифуге Sorvall instruments RC5C и дважды отмывали фосфатным буфером (с соответствующими рН и М) с последующей инокуляцией синтетических сред с теми же рН и М в конических колбах на 250 мл при объеме среды 50 мл. Культивировали в аэробных условиях во встряхиваемых колбах (150 об/мин) на G24 Environmental Incubator shaker (New Brunswick scientific, USA), в статических (без встряхивания) и строго анаэробных условиях (в анаэробном боксе) при 30С. Исходная оптическая плотность клеток после инокуляции дрожжей соответствовала Абоо 0.2. Пробы для химических анализов и построения кривых роста отбирали каждые 6 часов.
При проведении экспериментов руководствовались методическим пособием под редакцией Прескота (Prescott, 1975).
4. Световая микроскопия При микроскопировании клеток дрожжей применяли микроскоп Nikon Eclipse Е-800, оснащенный охлажденной CCD флюоресцентной камерой и програмным обеспечением MetaVue (Universal Imaging Corporation).
5. Определение способности дрожжей утилизировать нитриты и нитраты
Способность дрожжевых штаммов Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4 использовать нитриты и нитраты в качестве единственных источников азота была испытана на синтетической среде следующего состава (мМ): глюкоза - 28; MgS04 - 2; Na2HP04 - 9.8; КН2Р04 - 6.2 (рН 7.0). В качестве потенциальных источников NCV и N(V в среду вносили либо NaN02 в конечной концентрации 3.8 мМ, либо NaNC 3 в количестве 7.8 мМ. Клетки дрожжей вносили в среду до конечной Абоо 0.05 и культивировали аэробно во встряхиваемых колбах (150 об/мин) при 30С.
Выделение и идентификация микроорганизмов, способных к редукции ароматического кольца ТНТ
Скрининг на способность трансформировать ТНТ по пути его гидридного восстановления позволил ранжировать широкий круг микроорганизмов с точки зрения встречаемости этой биохимической активности. Обобщенные результаты скрининга приведены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, испытанные изоляты сгруппированы, исходя из источников их выделения. Подавляющее большинство (426 из 428) изолятов, независимо от их происхождения, атаковали ТНТ только по пути нитровосстановления, и лишь два штамма дрожжей (идентифицированные как Yarrowia lipolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4) проявили в качестве доминирующего механизма альтернативную биохимическую активность, хотя и менее выраженную по сравнению с таковой Candida sp. AN-L13 в плане гидридного восстановления ТНТ (Зарипов с соавт., 2002; Zaripov et al., 2002).
Для сравнительного анализа продукции нитрит- и нитрат-ионов на синтетической среде с ТНТ были привлечены все дрожжи, восстанавливающие ТНТ по ароматическому кольцу, включая 4 изолята, выделенные ранее из торфяников (Zaripov et al., 2002): Candida spp. AN-L7, AN-L13, AN-L14, AN-L20. При этом наибольшая аккумуляция нитрит- и нитрат-ионов, освобожденных из молекулы ТНТ, выявлена у штаммов AN-L15 и AN-Z4, что и предопределило их выбор в качестве моделей для последующих экспериментов.
Колонии одного из дрожжевых штаммов, обозначенного AN-L15, при рассеве на агаризованной среде Сабуро пастообразные, складчатые, кремового цвета. Световой микроскопией показано, что данная культура представлена овальными дрожжевыми клетками, размножающимися почкованием (рис. 5А). С возрастом они образуют хорошо развитый псевдомицелий и истинный мицелий, не распадающийся на артроспоры. Баллистоспоры, телейтоспоры, хламидоспоры и базидиоспоры не обнаружены.
Физиолого-биохимические исследования показали наличие у выделенного штамма слабой уреазной активности и отсутствие способности сбраживать сахара, синтезировать крахмалоподобные вещества, утилизировать нитриты и нитраты, D-галактозу, L-сорбозу, D-глюкозамин, D-рибозу, D-ксилозу, Ь-,Б-арабинозу, сахарозу, мальтозу, а,а-трегалозу, мелибиозу, лактозу, рафинозу, инулин, крахмал, ксилит, L-арабинит, метанол, креатин, креатинин. Реакция с диазониевым синим В отрицательна. Изученная культура оказалась способной к росту на глицерине, эритрите, D-манните, D-глюконате, сукцинате, цитрате, этаноле, L-лизине.
На основе вышеприведенных признаков культура AN-L15 была отнесена к Yarrowia lipolytica (Бабьева, Голубев, 1979; Barnett et al., 1983; Spencer, Spencer, 1997).
Рассев на агаризованной среде Сабуро второго дрожжевого штамма AN-Z4, способного к редукции ароматического кольца ТНТ, сопровождался ростом белых кожистых матовых колоний с ризоидным краем. Данная культура образует ветвящийся истинный септированный мицелий, распадающийся на артроконидии; почкование отсутствует, телеморфное состояние не обнаружено (рис. 5Б).
Физиолого-биохимические исследования показали неспособность данного штамма разлагать мочевину, сбраживать сахара, образовывать крахмалоподобные вещества, утилизировать нитриты и нитраты, D-глюкозамин, L-арабинозу, сахарозу, мальтозу, а,а-трегалозу, мелибиозу, лактозу, рафинозу, инулин, крахмал, эритрит, ксилит, L-арабинит, метанол, креатин, креатинин. Реакция с диазониевым синим В отрицательна. Штамм оказался способным к росту на D-галактозе, L-сорбозе, D-ксилозе, глицерине, D-манните, сукцинате, цитрате, этаноле, L-лизине.
По совокупности дифференциально-диагностических тестов (Бабьева, Голубев, 1979; Barnett et al., 1983) штамм AN-Z4 нами был отнесен к Geotrichum candidum.
Принадлежность обоих штаммов дрожжей к указанным видам была уточнена по результатам секвенирования D2 региона большой субъединицы рРНК в лаборатории MIDILABS (www.midilabs.com).
2. Трансформация ТНТ штаммом Y. lipolytica AN-L15 2.1. Конверсия ТНТ в аэробных условиях роста при рН6.0 Согласно нашим предварительным данным о зависимости трансформации ТНТ штаммом Y. lipolytica AN-L15 от концентрации ионов водорода в ростовой среде, охарактеризовали влияние рН ростовой среды в пределах 6.0-7.0 и молярности K-Na-фосфатного буфера в диапазоне 16-192 мМ.
На рис. 6 приведены ВЭЖХ-хроматограммы, полученные при анализе пробы, содержащей обнаруженные продукты трансформации ТНТ штаммом AN-L15 в условиях начального рН 6.0 за исключением гидроксиламино-мононитротолуолов (ГАМНТ). На хроматограммах показано разделение всех обнаруженных в данной работе восьми ТНТ-гидридных комплексов, ГАДНТ и 2,4-ДНТ. ГАМНТ не представлены на хроматограммах, так как они никогда не наблюдались совместно со всеми гидридными комплексами исходного ксенобиотика; их хроматографические характеристики приведены в табл. 2.
Стабильность С-3 моногидридного комплекса ТНТ
На основе проведенного широкого скрининга микроорганизмов из различных антропогенных и природных экониш были выделены 428 изолятов, из которых только 2 штамма дрожжей, идентифицированные как Y. lipolytica AN-L15 и G. candidwn AN-Z4, оказались способными к альтернативным направлениям трансформации ТНТ с доминированием гидридного восстановления ароматического кольца ТНТ и продуцирующие относительно наибольшее количество NO2" и NO3". Результаты проведенного скрининга свидетельствуют об уникальности гидридного механизма восстановления ТНТ, включающего деградацию образовавшихся ТНТ-гидридных комплексов, что несвойственно для подавляющего большинства испытанных микроорганизмов.
Несмотря на длительную историю изучения механизмов превращений ТНТ организмами разного эволюционного уровня, концепция биотрансформации ТНТ еще далека от завершения. Совершенствование этой концепции в решающей степени зависит от методического уровня детекции интермедиатов превращения этого токсиканта.
Применение нового ВЭЖХ-диодного метода позволило идентифицировать интермедиа обоих путей восстановления ТНТ штаммами Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4. Так, если нитроредукция вела к образованию гидроксиламино-динитротолуолов и амино-динитротолуолов, то в результате гидридного восстановления бензольного кольца исходной молекулы наблюдалась временная аккумуляция восьми ТНТ-гидридных комплексов.
Анализ фрагментов, образовавшихся при химической ионизации органических интермедиатов ионной структуры, позволил дифференцировать их следующим образом, в зависимости от m/z главных ионов: с m/z 227 (1-ЬГ-ТНТ, 3-Н -ТНТ и два его изомера), с m/z 228 (3,5-2Н -ТНТ) и с m/z 230 (три изомера З -гЬГ-ТНТТҐ).
В данной работе впервые обнаружены следующие гидридные комплексы: 1-ЬГ-ТНТ, два изомера 3-ЬГ-ТНТ и 3,5-2Н -ТНТ, определены их спектральные и хроматографические характеристики; изучена стабильность всех ВЭЖХ-очищенных гидридных форм ТНТ в абиотических условиях (буферный раствор, рН 7.0).
Проведенные нами исследования выявили способность изученных дрожжей не только к синтезу ТНТ-гидридных комплексов из ТНТ, но и к осуществлению их более глубокой деструкции с освобождением азота в виде нитрит- и нитрат-ионов. Впервые предложена схема, включающая три потенциально возможных пути деградации ТНТ в направлении его минерализации. Первый путь основан на разложении 3-РГ-ТНТ при одновременном формировании 2,4-ДНТ, второй - на деструкции 1-Н -ТНТ, третий - на деградации одного из изомеров 3,5-2Н -ТНТ"Н+. Все три механизма обеспечивают частичное освобождение углеродного скелета ТНТ от азотсодержащих заместителей, сопровождающееся выделением в среду нитрит- и нитрат-ионов. Данная схема впервые основана на сочетании биологической и абиотической трансформации всех восьми ВЭЖХ-очищенных ТНТ-гидридных комплексов.
Установлена способность Y. lipolytica AN-L15 к синтезу сукцината, цитрата и пирувата, a G. candidum AN-Z4 - сукцината, цитрата и изоцитрата, что сопряжено со снижением внеклеточного рН. Подкисление среды до рН ниже 4.2 выявлено в качестве условия окисления нитрит-иона дрожжевыми клетками и превращения С-3 моногидридного комплекса ТНТ в динитротолуол.
Дрожжи Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4, выделенные нами из нефтезагрязненных торфяников и отходов нефтехимии - нефтешламов, относятся к числу доминирующих микроорганизмов в этих антропогенных местообитаниях. Способность выживать и доминировать в таких экстремальных условиях, в сочетании с уникальным механизмом деградации ТНТ, делает данные микроорганизмы перспективными с точки зрения биоремедиации промышленных отходов, загрязненных взрывчатыми веществами.
