Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Bacillus thur1ngiensis как объект биотехнологии 8
1.2. Систематика и экология в. thuringiensis 10
1.3. Факторы патогенности влcillus thuring1ensis 13
1.4. Кристаллические дельта-эндотоксины 16
1.5. Действие дельта-эндотоксинов на целевые объекты 34
2. Материалы и методики исследований 43
2.1. Культивирование и идентификация микроорганизма 43
2.2. Клеточные культуры 44
2.3. Получение препаратов дельта-эндотоксина 44
2.4. Спектральное изучение дельта-эндотоксина 46
2.5. Методы световой микроскопии 46
2.6. Биохимические методы исследования .'47
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Цитопатическая активность дельта-эндотоксина bacillus thuringiensis 55
3.2. Микроскопическое изучение действия дельта-эндотоксина на клеточные культуры тканей 61
3.3. Действие дельта-эндотоксина на содержание ионов в клетках перевиваемых линий 66
3.4. Действие дельта-эндотоксина на дыхательную активность и синтез атф в клетка 78
3.5. Влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза 85
3.6. поДтверждение разобщающего действия дельта-эндотоксина bacillus thuringiensis Методами ик- и ямр-спектроскопии 90
Заключение 95
Выводы 100
Список цитируемой литературы 101
- Bacillus thur1ngiensis как объект биотехнологии
- Факторы патогенности влcillus thuring1ensis
- Получение препаратов дельта-эндотоксина
- Микроскопическое изучение действия дельта-эндотоксина на клеточные культуры тканей
Введение к работе
Актуальность темы: Bacillus thuringiensis является широко распространенной в природе кристаллофорной спорообразующей бактерией. Известны ее энтомопатогенные свойства и промышленные препараты на основе бактерии являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.
Известно, что основным действующим началом В. thuringiensis, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является дельта - эндотоксин, продуцируемый ею. Показана также антимикробная активность дельта-эндотоксинов B.thuringiensis для различных бактерий и микроскопических грибов (Юдина и Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003; Каменек и соавт., 2005). Отмечали кроме того селективное ингибирующее действие белков кристаллов subsp. thuringiensis на развитие опухолевых клеток млекопитающих, в том числе человека (Prasad & Shethna, 1976; Ito et al., 2004). Эндотоксины предпочтительно убивали раковые клетки НеР, не оказывая влияния на развитие нормальных клеток. Все это дает основание предположить, что В. thuringiensis и её кристаллический дельта-эндотоксин являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности самых различных организмов.
Создание и применение средств на основе дельта-эндотоксина позволило бы не только обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, но и, возможно, решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Прежде всего, разработать препаративные формы, обладающие антимикробной и противораковой активностью и не токсичные для нормальных клеток. Их разработке должны предшествовать исследования, выполненные на культурах клеток.
В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов. Установлено, что
дельта-эндотоксины способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Изучены особенности механизма действия на насекомых, включая клеточные культуры. Отмечается нарушение транспорта ионов, активирование АТРаз, снижение синтеза АТФ на фоне усиления потребления кислорода, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; Himeno et al., 1985; Каменек, 1998). Проведены также исследования влияния на млекопитающих кристаллов белкового дельта-эндотоксина, которые подтвердили, что эти белки и продукты их расщепления не токсичны и не аллергенны для теплокровных организмов (Киль и Надыкта, 2002). Вышесказанное позволило определить цель и задачи исследования.
Цель настоящего исследования - охарактеризовать по морфологическим и биохимическим параметрам этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto и выявить особенности механизма его действия на клетки перевиваемых линий HeLa, В16 и L1210.
Основные задачи исследования:
Выявить общее цитопатическое действие дельта-эндотоксина и охарактеризовать силу его эффекта по отношению к клеткам перевиваемых линий HeLa, В16\\Ы210.
Определить влияние дельта-эндотоксина на ионный гомеостаз клеточных линий, установив факт нарушения транспорта основных неорганических ионов (К+, Na+, Са2+ и Mg2) вследствие изменения активности основного ионного транспортера - К+, Naf- АТФазы.
Установить возможность действия дельта-эндотоксина как агента, разобщающего дыхание и фосфорилирование в клетках перевиваемых культур.
4. Проанализировать влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза в
клетках HeLa согласно показателям активности основных ферментов
гликолиза — 3-фосфоглицерат дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы.
5. Охарактеризовать ранние и поздние этапы действия дельта-
эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto.
Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено изучение влияния дельта-эндотоксина В. thuringiensis на клетки перевиваемых культур {HeLa, L1210, В16). Показано, что изученные культуры отличаются по чувствительности к токсину. Установлена прямо пропорциональная зависимость их чувствительности от времени контакта с токсином и его концентрации.
Показано, что действие дельта-эндотоксина на культуры раковых клеток, аналогично таковому для клеток кишечника и культур насекомых. Установлено нарушение работы ион транспортирующей Mg~ -зависимой АТРазной системы, результатом которого является пассивный нерегулируемый приток ионов натрия и воды в клетку и, как следствие, вакуолизация мембранных структур. Показана первичность активирования фермента (в течение первых 10 мин) по отношению к изменению концентраций ионов, которое начиналось только через 10-15 мин.
Установлено, усиление клеточного дыхания в течение первых 10 минут воздействия дельта-эндотоксина на фоне резкого снижения синтеза АТР, которое, вероятно, связано с разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания, приводящего к деэнергизации митохондрий и клеток в целом.
Установлено начальное усиление гликолиза, очевидно связанное с необходимостью компенсации снижения синтеза АТР в ходе окислительного фосфорилирования, за счет аэробной, а при дальнейшей деэнергизации клетки, и снижении потребления кислорода анаэробной стадии гликолиза. Это подтверждает динамика изменения активности 3-фосфорглицерат
дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы, ферментов катализирующих из ключевых стадий гликолитического процесса.
Установлено, что нарушение транспортных функций клеточных мембран и, вслед за этим, их целостности вызывает выход лактат дегидрогеназы во внеклеточную жидкость и значительное повышение содержания лактата в ней.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы при разработке препаративных форм для лечения различных форм онкологических заболеваний человека и домашних животных, а так же при оценке безопасности применения эндотоксинсодержащих пестицидов. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе как вносящие вклад в представления о механизмах действия бактериальных токсинов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1 .Цитопатический эффект дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. sotto связан с изменением структуры клеток (нарастающая вакуолизация с последующим разрушением), пропорционален его концентрации и времени контакта с клетками перевиваемых культур. Эффективность действия токсина различается по силе для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток В16 и Ы210.
Действие дельта-эндотоксина характеризуется нарушением транспорта ионов К+, Na+, Са+ и Mg~+ через цитоплазматическую мембрану клеток, которому предшествует значительная(до 6,8 раз) активация Mg~ -зависимой К , Na+- АТФазы.
Дельта-эндотоксин угнетает синтез АТФ на фоне активации дыхания, действуя на культуры клеток аналогично разобщителям процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.
Проявлением действия дельта-эндотоксина является интенсификация гликолиза в клетах HeLa на начальном этапе и активация 3-фосфоглицерат
дегидрогеназы с последующим ее угнетением, сменяемым активацией характерного для анаэробного режима гликолиза фермента — лактат дегидрогеназы.
5. Разрушению клеток под действием дельта-эндотоксина предшествует, деэнергизация митохондрий, снижение потребления кислорода, активациея анаэробного пути гликолиза, нарушение целостности мембран и выход лактат дегидрогеназы во внеклеточную среду.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (Ульяновск, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); Всероссийской школе-семинаре молодых ученых и специалистов по актуальным проблемам «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2004 - 2006); Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов (Москва, МГУ, 2007); Регионального научного семинара Министерства образования РФ «Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), межкафедральных семинарах экологического факультета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского госуниверситета (2003 - 2008).
Публикации результатов исследований. Основные положения опубликованы в 14 работах.
Объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного набора, включает 12 таблиц и 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, материалов и методов исследований, результаты исследований и их
обсуждение с учетом существующих в литературе данных, заключения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы содержит 272 источника, в том числе 91 — на русском языке.
Bacillus thur1ngiensis как объект биотехнологии
В настоящее время В. thuringiensis рассматривают, прежде всего, как наиболее важный агент биологического происхождения для регуляции численности насекомых-вредителей. Применение биопрепаратов особенно актуально в защищенном грунте, водоохранных и курортных зонах, при выращивании культур, используемых для диетического и детского питания, а также в загрязнённых регионах (Слободянюк и соавт., 1995; Габдуллин, 2003; Захаренко, 2003).
К потенциальным агентам биологической защиты растений предъявляют достаточно жесткие требования. Такие микроорганизмы должны быть безопасны для теплокровных организмов, полезных насекомых и вместе с тем эффективно подавлять вредителей и патогенов даже при низких концентрациях, не проявлять фитотоксичности, быстро разрушаться в окружающей среде и так далее (Глик и Пастернак, 2002; Коробко, 1997; Монастырский, 2003; Новожилов, 2003). В настоящее время в разных странах производятся многочисленные промышленные препараты на основе В. thuringiensis для применения против различных вредителей на разных видах растений (Гулий и соавт, 1982; Вершинина и Алимова, 2000; Захаренко, 2003).
В 80-е годы расширилось поле исследований генетической инженерии. Первыми растениями, экспрессирующими токсины В. thuringiensis, стали табак и томаты. В 1997 году только в США хлопок, кукуруза и картофель со встроенными генами В. thuringiensis занимали около 10 млн акров земли. Эти культуры также были привлечены к широкому коммерческому использованию в разных странах мира (Frutos et al., 1999).
Вместе с тем в последние годы открылись новые возможности применения данной бактерии и ее токсинов. Показана антимикробная активность дельта-эндотоксинов В. thuringiensis для различных бактерий и микроскопических грибов (Егоров и соавт., 1990; Юдина, Бурцева 1997; Кандыбин и Смирнов, 1999; Климентова, 2001; Тюльпинёва 2003; Кандыбин, 2003; Каменек и соавт.,). Штаммы В. thuringiensis запатентованы как средства контроля ряда грибных и бактериальных фитопатогенов (Marrone et al., 1999).
Известны токсины, которые оказывают токсическое действие по отношению к различным отрядам насекомых, клещей и нематод - вредителей растений и паразитов животных, ингибирующих рост опухолевых клеток (Edwards et al., 1990). Отмечали кроме того селективное ингибирующее действие белков кристаллов subsp. thuringiensis на развитие опухолевых клеток млекопитающих, в том числе человека (Prasad & Shethna, 1976; Tto et al., 2004). Эндотоксины предпочтительно убивали раковые клетки НеР, не оказывая влияния на развитие нормальных клеток. Все это дает основание предположить, что В. thuringiensis и ее кристаллический дельта-эндотоксин являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности самых различных организмов.
Показано, что некоторые подвиды бактерии проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов, в том числе и фитопатогенных (Егоров с соавт., 1990; Юдина, Бурцева 1997; Кандыбин, Смирнов, 1999; Климентова, 2001; Тюльпинёва 2003; Кандыбин, 2003; Каменек и соавт., 2005). Это позволяет расширить область практического применения В. thuringiensis.
Изучена патогенность В. thuringiensis для крыс, мышей, кроликов, свиней, кур, цыплят, форели, карпа, окуня, полезных насекомых. На основании этих исследований сделано заключение об отсутствии токсичного действия В. thuringiensis для данных объектов (Кандыбин, 1989). Эксперименты подтвердили также, что белки кристаллов и продукты их расщепления не токсичны и не аллергенны для теплокровных организмов (Хеймпел, 1976; Киль и Надыкта, 2002).
Отсутствие патогенности у штаммов В. thuringiensis послужило основанием для присвоения им Управлением по контролю качества продовольствия и лекарственных средств США статуса вполне безопасных организмов (Харвуд, 1992). Ниже будет приведён обзор наиболее значимых достижений в исследованиях природы и биологической активности В. thuringiensis и её дельта-эндотоксинов.
В. thuringiensis — грамположительные аэробные спорообразующие бактерии, способные продуцировать комплекс кристаллических белков (Азизбекян и Смирнова, 1988).
Впервые данную бактерию из личинок тутового шелкопряда выделил Ишивата и назвал ее Bacillus sotto (Вершинина и Алимова, 2000). Позднее было описано целое семейство штаммов этой бактерии, каждый из которых характеризовался своим спектром восприимчивых насекомых (Berliner, 1915; Steinhaus, 1951). Было предложено группировать все образующие параспоральные кристаллы линии под названием Bacillus thuringiensis (Delaporte and Beguin, 1955; Heimpel and Angus, 1958).
В зависимости от объекта подавления различные изоляты В.thuringiensis классифицируют на пять патотипов: специфичный к чешукрылым патовар А (yar.berliner, dendrolimus или sotto, galleriae, kurstaki, thuringiensis), двукрылым патовар В (yar.israelensis), жесткокрылым патовар С {var.tenebrionis или morrisoni), одновременно активные против чешуекрылых и двукрылых (var.aizawai) и патотип, активность которого пока не установлена (yar.dakota) (Вершинина и Алимова, 2000; Бурцева и соавт., 2001).
Факторы патогенности влcillus thuring1ensis
Наиболее полно изучено действие В. thuringiensis на чувствительных насекомых (эпидемиологические факторы, специфика патогенеза и т.п.). Энтомоцидность В. thuringiensis обусловлена способностью вида продуцировать комплекс токсинов. Бактериальные токсины представляют собой специфические продукты метаболизма, выполняющие разнообразные физиологические и экологические функции. Токсины, поражающие насекомых, классифицируют по-разному. В зависимости от характера локализации в бактериальной клетке выделяют эндо- и экзотоксины, по отношению к температуре — термолабильные и термостабильные, по структуре - пептиды и полипептиды, гликопротеины, нуклеозиды и т.п. К числу бактериальных токсинов энтомоцидного действия относят также ферменты лецитиназу, протеазу, гиалуронидазу, фосфатазу (Кандыбин, 1989).
Считают, что основным фактором энтомопатогенности В. thuringiensis являются параспоральные кристаллические белки (дельта-эндотоксины), остальные метаболиты, а также споры бактерии лишь усиливают активность кристаллов (Каменёк, 1998).
В настоящее время обнаружены и достаточно подробно описаны такие биологически активные соединения В. thuringiensis как а-экзотоксин, р-экзотоксин, лецитиназа или фосфолипаза С, вегетативные инсектицидные белки, протеазы, бактериоцины (турицины) (Ивинскене, 1987; Ikezava, Taguchi, 1981; Schnepf et al., 1998; Честухина и соавт., 1977; Честухина, 1990; Fedhila et al., 2002; Pendleton, 1973; Vidaver, 1983; Бурцева и соавт., 2001). Все эти соединения наряду с эндотоксинами определяют биологическую активность В. thuringiensis.
Споры В. thuringiensis. Было обнаружено, что чистые споры не вызывали паралича у гусениц тутового шелкопряда при пероральном введении, тогда как при инъекции в гемолимфу наблюдалась септицемия (Angus, 1954). Это позволило сделать вывод, что токсичность зависит от количества токсического кристалла и не зависит от количества спор. Однако в более поздней своей работе этот же автор высказывает более осторожное мнение о том, что возможно и споры играют определенную роль (Ангус, 1968). Другими исследователями (Mohd-Salleh and Zeurs, 1982 Somerville et. al., 1970; Burges et. al., 1976) было установлено, что чистые споры В. thuringiensis не патогенны для гусениц стеблевого кукурузного мотылька, но добавка спор к чистым кристаллам токсина увеличивает вызываемую ими смертность, причем удалось продемонстрировать, что одни споры также способны вызвать гибель гусениц. Это связано с тем, что споры содержат кристаллоподобное вещество, которое разлагается в среднем отделе кишечника и оказывает на него токсическое действие. В настоящее время накоплен достаточно обширный материал, показывающий связь между белком кристаллов и материалом споровых оболочек (Delafield et. al., 1968; Somerville and Pockett, 1975; Lecadet and Dedonder, 1972; Ribier, 1971; Lecadet et. al., 1972; Ribier and Lecadet, 1973; Herbert and Gould, 1973). Было обнаружено, что токсины споры и кристалла имеют общие антигены, и что токсин споры локализуется в экзоспориуме и оболочке споры (Somerville and Pockett, 1975). Локализация токсичности в экзоспориуме была подтверждена и другими исследователями (Scherrer et. al., 1974).
Инсектицидные токсины В. thuringiensis. Фосфолипаза С (фосфатидилхолин — холинфосфогидролаза) — токсин, является ферментом, воздействующим на многие типы клеток. Первичной мишенью являются фосфолипиды мембран, следствием воздействия - литические или некротические эффекты. Токсин воздействует на молекулу лецитина с образованием диглицерида и фосфорилхолина (Ивннскене, 1987). Вероятно данный фермент является полиморфной системой, аналогично тому, как это имеет место у В. cereus (Макарюнайте, 1985). Очищенный препарат фосфолипазы С не проявлял выраженной токсичности при введении его лабораторным мышам (Ивннскене, 1987). Тот факт, что не все подвиды В. thuringiensis и не в любых условиях продуцируют фосфолипазу С, а также очень ограниченный круг восприимчивых насекомых, куда входит лишь незначительное число представителей чешуекрылых, которые, как известно, наиболее восприимчивы ко всему комплексу В. thuringiensis, свидетельствует о том, что данный токсин не является основным, ответственным за патогенность бактерии, однако, в определенных условиях усиливает действие комплекса других токсинов. ос-Экзотоксин или термолабильный экзотоксин. Совместно с фосфолипазой в конце логарифмической фазы роста В. thuringiensis продуцирует термолабильный экзотоксин - вещество, токсичное для мышей. (Ивинскене, 1984).
Токсичность для теплокровных животных проявляется только при парэнтеральном введении и составляет 1000 мкг белка на мышь. Механизм действия и строение токсина не выяснены.
Р-Экзотоксин. «Мушиный фактор», фактор Мак-Конелла и термостабильный экзотоксин, который выделяется бактериальной клеткой в культуральную среду в активную фазу вегетативного роста токсина (Лескова и Рыбина, 1987; Faust,. 1984; Heimpel, 1967). Он стабилен при нагревании, нелетуч, растворим в воде, способен к диализу, поглощает свет в области 260 нм. Этот токсин является аналогом аденозинмонофосфорной кислоты, в котором рибоза в свою очередь связана с глюкозой, присоединенной к дикарбоксильной частице (алларовой кислоте) с замещением в последней фосфатного остатка (Sebesta et al., 1969).
Получение препаратов дельта-эндотоксина
Использовали следующие штаммы различных подвидов В. thuringiensis: kurstaki Z-52, alesti 204, sotto 617, galleriae 69-6 и thompsoni, продуцирующие дельта-эндотоксины, токсичные для чешуекрылых (патотип А) и кодируемые генами cry 1-класса (Hofte & Wliiteley, 1989). Культуры получены из ФГУП ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва).
Поверхностное культивирование осуществляли в термостатах при 27С в чашках Петри на агаризованной питательной среде №14 следующего состава (%): кукурузный экстрат - 0,7; глюкоза - 1; пептон - 0,5; хлористый натрий -0,2; магний сульфат - 0,01; натрий кислый фосфорнокислый однозамещенный -0,3; калий кислый фосфорнокислый двузамещенный - 0,3; агар-агар — 15-20. рН был равен 7,2-7,5. Культуру высевали на полупроницаемую целлофановую пленку, помещенную на поверхность питательной среды.
Качество выращенной культуры и оценку кристаллообразования проводили согласно принятой методике (Лескова и соавт., 1984; Кольчевский и соавт., 1987).
Просмотр в мазках при увеличении 400-900х позволяет различить споры бактерии по сильному преломлению света. При необходимости мазки окрашивали. Проводили окрашивание карболовым фуксином по Цилю, в результате которого кристаллы окрашивались в красный цвет, споры оставались неокрашенными с красной каймой, вегетативные клетки — красные. При окраске черно-синим нафтолом по Смирнову споры приобретали розовый цвет, кристаллы — от синефиолетового до черного, вегетативные клетки -лиловый.
В результате трехцветной окраски по Логинову и Смирновой (смесью 5% раствора малахитового зеленого, уксусно-ацетонового раствора амидо — черного 10 Б и нейтрального красного) с последующим микроскопированием при бледно — голубом светофильтре споры были окрашены в изумрудно зеленый цвет с красным ободком, кристаллы - в сине-фиолетовый или черный, вегетативные клетки — в красно-коричневый или розовый (Лескова и соавт., 1984; Кольчевский и соавт., 1987).
Определение количества микробных тел осуществляли подсчетом в камере Горяева или спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 400 и 500 нм (Штерншис, 1976).
Тест-объектами служили культуры перевиваемых линий клеток В16 (меланома мышей), Ы210 (лимфоидная лейкемия кроликов) и HeLa (рак шейки матки женщины). SDLd (перевиваемая культура клеток кишечника непарного шелкопряда). Линии клеток выращивали на питательной среде Грейса с добавлением телячьей сыворотки при рН=7.2. Титр культур составлял 1 млн. клеток на 1 мл суспензии.
Биомассу В. thuringiensis, содержащую кристаллы эндотоксинов и споры продуцента, отмывали от компонентов питательной среды и водорастворимых токсинов. Для этого биомассу суспензировали в дистиллированной воде, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант, содержащий водорастворимые токсины, отбрасывали. Осадок ресуспен-зировали и вновь центрифугировали при 500 об/мин. При этом осаждали элементы твердой питательной среды, а супернатант содержал споры и кристаллы. Очистку повторяли. Степень очистки спорово-кристаллических комплексов оценивали при помощи световой микроскопии. Кристаллы отделяли от спор последовательно, путём флотации и экстракции в двухфазной системе: хлороформ — водный раствор Na2S04- Для этого к очищаемой суспензии прибавляли равный объем четыреххлористого углерода и 1%-ный Na2S04, из расчета 7 мл на каждые 10 мл суспензии. Смесь интенсивно перемешивали механической мешалкой до образования устойчивой эмульсии и оставляли расслаиваться. После расслаивания тщательно отбирали водную фазу, содержащую в основном кристаллы. Последнюю процедуру повторяли дважды. Чистоту суспензии кристаллов контролировали под микроскопом — она содержала менее 1% спор.
К полученной суспензии добавляли равный объем хлороформа, интенсивно перемешивали до образования устойчивой эмульсии и оставляли до полного расслаивания. Верхняя мутная (водная) фаза содержала кристаллы и, как показало микроскопическое исследование, была практически свободна от спор. Концентрация полученной суспензии определяли спектрофотометрически (Штерншис, 1976). Выход кристаллов от исходного количества составлял около 20%.
Выделение и очистка дельта-эндотоксина. Щелочной гидролиз кристаллов осуществляли по методике Кукси (Cooksey, 1968). Для этого 6 мг кристаллов растворяли при постоянном перемешивании в 3 мл 0,04 н NaOH в течение 1 ч при 30 С. После этого нерастворившийся материал осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин. К надосадочной фазе по каплям при постоянном перемешивании добавляли концентрированную уксусную кислоту до достижения рН 4,4. Смесь оставляли на 30 мин при 0 С для окончательного формирования осадка, который удаляли центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин.
Щелочной раствор дельта-эндотоксина подвергали диализу и доводили дистиллированной водой до необходимой концентрации, затем снижали рН до 7,8 осторожным титрованием 0,1 н НС1.
Доочистку и стерилизацию дельта-эндотоксина осуществляли микрофильтрацией (диаметр пор 0,4 мкм). Во всех экспериментах использовали свежеприготовленные растворы кристаллов.
Микроскопическое изучение действия дельта-эндотоксина на клеточные культуры тканей
В ходе исследования, проведенного на клетках культуры HeLa, было установлено, что первые изменения клеток по сравнению с нормой (рис. 3.2.1) наблюдались уже через одну минуту после начала инкубации клеток с раствором дельта-эндотоксина во всех проведенных сериях опытов (рис. 3.2.2). Клетки начинали вакуолизироваться через этот промежуток времени, что отчетливо показывала световая микроскопия. Степень вакуолизации возрастала с увеличением продолжительности инкубации и была пропорциональна концентрации дельта-эндотоксина. Так, если при использовании концентрации 100 мкг/мл через 1 мин было вакуолизировано до 90% всех клеток, и появились первые разрушенные, то при 50 мкг/мл до 50% . Через 15 мин во всех сериях опытов вакуолизация достигала 100%, и размеры клеток значительно увеличились (рис. 3.2.3). В это же время нарастают признаки разрушения клеток. Через 30 мин инкубации в серии с использованием концентрации токсина 100 мкг/мл не обнаруживается ни одной целой клетки (рис. 3.2.4). Такая же картина наблюдалась через 2 часа инкубации с концентрацией токсина 50 мкг/мл.
На представленных микрографиях видно, что кроме появления большого числа вакуолей, наблюдаются и такие признаки нарушения структуры клеток, как истончение клеточной мембраны и зернистость ядер.
В контроле, где клетки инкубировались в том же растворе, что и в опытах, только в отсутствие дельта-эндотоксина, каких-либо изменений в структуре клеток обнаружено не было (рис. 3.2.1).
Нами была проведена также количественная оценка вакуолизации клеток в разных сериях опытов, результаты которой представлены в таблице 3.2.1. Данные результаты, безусловно, не могут рассматриваться как абсолютные характеристики, так как часть клеток смывается с пластинки при фиксации, однако они все же позволяют сделать определенные количественные сравнения.
Полученные данные позволяют констатировать наличие прямо пропорциональной связи с концентрацией дельта-эндотоксина и временем его контакта с клетками (инкубации).
Такая значительная вакуолизация клеток вероятнее всего является следствием нарушения активного транспорта ионов, и прежде всего натрия, концентрация которого в норме во внутриклеточной среде должна быть ниже, чем во внеклеточной. Откачивание ионов натрия из клетки осуществляется системами активного транспорта их против градиента концентрации. Следствием нерегулируемого притока этих ионов в клетки является поступление в нее значительных количеств воды, что и приводит к сильной их вакуолизации. Полученные результаты согласуются с данными литературы, так как нарушение ионного транспорта может быть следствием как формирования ионспецифических каналов-пор (ЕИаг, 1994), так и деэнергизации клетки в результате разобщения процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Каменек, 1998). Это, как следствие, должно неизбежно привести к нарушению двух наиболее энергозависимых функций клетки: синтеза нуклеиновых кислот и белков и транспорта веществ через биологические мембраны. Нарушение же транспорта, особенно ионов, влечет за собой нарушение транспорта воды и вызванные им вакуолизацию, набухание и лизис клеток.
Ранее аналогичные исследования проводили только на клетках кишечного эпителия и культурах клеток насекомых (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1979; Каменек и Харина, 1984; Каменек, 1998). Авторы отмечали, что изменения, возникающие в названных клетках под действием дельта-эндотоксинов различных подвидов Bacillus thuringiensis изменения аналогичны описанным в настоящем разделе.
Для разрешения существующих в литературе противоречий и получения более полной картины действия дельта-эндотоксина на систему ионного транспорта через цитоплазматическую мембрану, проведены измерения уровней концентрации ионов в различные моменты времени после начала действия токсина. Данные, представленные в таблицах 3.3.1 и 3.3.2, показывают, что, начиная с 15 минут после добавления токсина, значительно изменялась концентрация всех определяемых ионов в клетках HeLa. Наибольшие отклонения от нормы наблюдали в концентрации Na4-ионов, причем степень повышения уровня зависела от количества добавляемого токсина. Максимальное увеличение составляло 203% через 30 мин для 100 мкг/мл токсина и 182% через 1 ч для 50 мкг/мл. Существенно снижалась концентрация ионов К+, достигая 61% от исходного значения через 30 мин для 100 мкг/мл и 60% через 1 ч для 50 мкг/мл. Для Mg отмечено снижение до 78% через 30 мин для 100 мкг/мл и 71% через 1 ч для 50 мкг/мл, соответственно. Концентрация ионов Са , наоборот, повышалась через тот же период времени до 130 и 136%, соответственно.
Изменение концентрации ионов отмечено и в случае менее чувствительных к дельта-эндотоксину культур Ы210 и В16.
Данные, представленные в таблицах 3.3.3 и 3.3.6, показывают, что, начиная с 30 минут после добавления токсина, значительно изменялась концентрация всех определяемых ионов в клетках В16. Наибольшие отклонения от нормы наблюдали в концентрации ионов Na , причем степень повышения уровня зависела от количества добавляемого токсина. Максимальное увеличение составляло 132% через 180 мин для 100 мкг/мл токсина и 170% через 180 мин для 50 мкг/мл. Существенно снижалась концентрация ионов К+, достигая 80% от исходного значения через 30 мин для 100 мкг/мл и 68% через 1 ч для 50 мкг/мл. Для Mg2+ отмечено снижение до 83% через 30 мин для 100 мкг/мл и 75% через 1 ч для 50 мкг/мл, соответственно.
