Введение к работе
- 1 -Актуальность проблемы. С развитием генетической инявнерии и биотехнологии стало возможным по-новому решить задачу защиты полезных растений от насекомых. Как известно, насекомые-вредители наносят огромный ущерб сельскому хозяйству. В последние 20 лет широкое распространение получило использование препаратов на основе Bacillus thuringiensis для защиты растений от насекомых-вредителей. Эти препараты безопасны для человека и животных, быстро разрушаются в почве. Кроме того, они эффективны против вредителей, на которых, не действуют химические инсектициды. Однако существуют недостатки в их применении: слишком узкий спектр действия бактерий, высокая стоимость препаратов на основе' В. thuringiensis, их ограниченная стабильность в почве.
В связи с этим появляются идеи о введении генов дельта-эндотоксинов В. thuringiensis в другие микроорганизмы, а также в растения. К началу нашей работы появились единичные сообщения о возможности создания растений, которые могут защитить сами себя от некоторых насекомых-вредителей. Настоящая работа посвящена разработке системы зашиты растений от поражения насекомыми путем создания новых видов растений, содержащих в своем геноме гены дельта-эндотоксинов В. thuringiensis.
Дедь и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование экспрессии гена дельта-эндотоксина В. thuringiensis var. berliner (bt) в клетках грансгенных растений табака. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. конструирование рекомбинантных шнзмид с полно-размерным' и делеционкыми вариантами гена bt под контролем-"лолуиндуцибелъного промотора ТИ'; 2. анализ экспрессии инсектицидных белков в трансгенных растениях Nlootіana tabacum; 3. создание конструкций с геном bt под контролем конститутивного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (ВВДК), пригодных для трансформации широкого круга растений.
Научная новизна и практическая ценность работы. Сконструированы плазмиды, содержащие-полный и делеционныз варианты гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis var. berliner под контролем полуиндуцкбельного промотора 1' из TR-ДНК Ti-плаамиды. Эти конструкции при введении их в клетки табака придали транс-
- 2 -генным растениям способность подавлять некоторых вредителей, таких как табачный гриле, непарный шелкопряд, колорадский жук и паутинный клещ. Показана зависимость инсектицидной активности растений от количества токсина в иг клетках и числа копий гена Ы на геном. Инсектицидные свойства передавались потомству и носили такой же характер, как и у поколения F0. Кроме того получены конструкции с укороченным геном токсина под контролем 35S промотора, использованные для трансформации табака, сахарной свеклы и хризантем. Таким образом, заложены основы создания универсальной системы защиты растений от насекомых-вредителей путем экспрессии в растениях гегерологичных белков, обеспечивающих устойчивость к насекомым.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были долоиены и обсуидены на Всесоюзной конференции "Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями" (Пущино, 1989), на выставке "Биотехнология в СССР" (Белград, Югославия, 1990), на Первой международной конференции молодых учених "Проблеми и мзтоды в молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии" (Каварна, Болгария, 1990), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1990), на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993), на заседаниях Ученого Совета ИБФМ РАН.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 6 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 184 наименования.
