Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Cry-белки Bacillus thuringiensis: молекулярная структура и механизм действия (обзор литературы) 10
1.1. Молекулярная организация Cry-белков 12
1.1.1. Первичная структура, филогенетическое родство, номенклатура 13
1.1.2. Пространствнная организация молекулы Сгу-белков 16
1.1.3. Ограниченный протеолиз Cry- белков 23
1.2. Механизм действия Cry-белков 25
1.2.1. Специфичность инсектицидной активности 25
1.2.2. Общая схема патогенеза 27
1.2.3. Ещё раз об активации протоксинов 29
1.2.4. Связывание Cry-белков с мембранами
кишечного эпителия чувствительных насекомых 30
1.2.5. Токсины В. thuringiensis способны образовывать поры или ионные каналы в искусственных и плазматических мембранах 33
1.2.6. Факторы, вызывающие гибель насекомых 34
1.3. Взаимоотношение структуры и функции в молекулах Cry-белков 36
1.4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых 40
1.4.1. Кадгериноподобный рецептор Cry 1-белков 40
1.4.2. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков 43
1.4.3. Элементы структуры Cry-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором 44
1.4.4. Доказательства участия кадгериноподобных рецепторов в токсическом эффекте Cry-белков in vivo 45
1.4.5. Токсин-связывающие свойства аминопептидазы N 46
1.4.6. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N 49
1.4.7. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Cry-белков 52
1.4.8. Другие кандидаты на роль рецептора Cry-белков 54
1.5. Москитоцидные токсины В. thuringiensis 55
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1. Выделение дельта-эндотоксинов 60
2.2. Определение концентрации белка 61
2.3. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков 61
2.4. Выращивание личинок комаров 63
2.5. Определение биологической активности 64
2.6. Методика электронно-микроскопического исследования 64
2.7. Приготовление гистологических препаратов для иммуноцитохимических и цитохимических исследований 65
2.8. Биотинилирование энтомоцидных белков 65
2.9. Проведение гистохимической реакции 66
2.10. Проведение иммуногистохимической реакции 67
2.11. Получение препаратов апикальных мембран
(ВВМ) кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi 67
2.12. Синтез аффинных сорбентов 68
2.13. Изучение белкового состава экстрактов мембранных белков, полученных с помощью различных детергентов 69
2.14. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков An. stephensi 69
2.15. Электрофорез 70
2.16. Лиганд-блоттинг 70
2.17. Изучение связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков An. stephensi с токсинами В. thuringiensis разной специфичности и продуктами ограниченного протеолиза москитоцидных елков Cryl 1А и Сгу4В 71
2.18. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции 71
2.19. Изучение обратимости связывания москитоцидных белков 71
2.20. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 72
2.21. Определение активности щелочной фосфатазы 72
Глава 3. Влияние энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp.israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на кишечный эпителий личинок комаров Aedes aegypti 73
3.1. Цели и объекты исследования 73
3.2. Определение диапазона эффективных концентраций кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А 74
3.3. Влияние кристаллов эндотоксина на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара Л. aegypti 78
3.4. Влияние индивидуальных токсинов на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti Ill
Глава 4. Гистохимическое изучение связывания эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Сгу4В с эпителиальными клетками средней кишки личинок комара A. aegypti 142
4.1. Схема эксперимента 143
4.2. Визуализация связывания москитоцидных белков с кишечным эпителием личинок A. aegypti 145
Глава 5. Выделение токсин-связывающих белков из мембран кишечного эпителия личинок An. stephensi 155
5.1. Белковый состав ВВМ кишечного эпителия личинок An. stephensi 155
5.2. Использование лиганд-блоттинга для обнаружения токсин-связывающего белка в экстракте ВВМ An. stephensi 158
5..3. Аффинная хроматография белков ВВМ кишечного эпителия личинок An.stephensi 160
5.4. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ
An. stephensi с токсинами Bacillus thuringiensis, обладающими раз личной специфичностью энтомоцидного эффекта 162
5.5. Обратимость связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ An. stephensi с Cry4Box 164
5.6. Гомологическая и гетерологическая конкуренция при взаимо действии эндотоксина Cryl 1А и Cry4Boxс 65 кДа- и 57 кДа-белками 164
5.7. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков с продуктами ограниченного протеолиза эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А 166
5.8. Определение N-концевой последовательности 57 кДа-белка из ВВМ Ли. stephensi 170
5.9. Определение фосфатазной активности в элюате, содержащем 65 кДа- и 57 кДа-белки из ВВМ An. stephensi 170
5.10. Растворимая форма 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ Ли. stephensi 171
Заключение 173
Выводы 176
Список литературы
- Ограниченный протеолиз Cry- белков
- Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков
- Влияние индивидуальных токсинов на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti
- Визуализация связывания москитоцидных белков с кишечным эпителием личинок A. aegypti
Введение к работе
Актуальность темы. Одними из самых перспективных биоинсектицидов являются препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (8-эндотоксинов), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleop-tera и Diptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства нецелевых объектов. В частности, токсины, продуцируемые Bacillus thuringiensis ssp. israelensis, убивают личинок многих видов комаров и мошек, но безвредны для всей остальной фауны водоёмов.
В основе биологического эффекта 5-эндотоксинов В. thuringiensis лежит их цито-патологическое действие на эпителиальные клетки кишечника насекомых. В свою очередь, специфичность этих белков определяется их взаимодействием с рецепторами, локализованными в апикальной мембране эпителиальных клеток. Изучение воздействия 8-эндотоксинов на кишечный эпителий, поиск и характеристика соответствующих рецепторов важны для понимания мехаїшзма действия и специфичности энтомоцидных белков, а также выяснения путей возникновения у насекомых-мишеней резистентности к препаратам В. thuringiensis. Вследствие этого работы по изучению взаимодействия эндотоксинов В thuringiensis с кишечным эпителием чувствительных насекомых необыкновенно актуальны.
До настоящего времени основная масса исследований, посвященных решению указанных проблем, была проведена для токсинов, активных против гусениц чешуекрылых (лепидоцидных белков). Москитоцидные токсины, например Сгу4В и CryllA из подвида Bacillus thuringiensis ssp. israelensis изучены значительно меньше.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было комплексное изучение энтомоцидного действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti (Culicidae; Diptera).
Для ее достижения были определены следующие задачи:
изучение цитопатологических изменений, происходящих в эпителиальных клетках личинок комаров (на примере личинок Ае. aegypti) под действием москитоцидных токсинов Сгу4В и Cryl 1 А, продуцируемых В thuringiensis ssp. israelensis;
идентификация сайтов связывания токсинов со стенкой кишечника личинок комаров;
выделение специфического рецептора (ов), ответственного за связывание токсинов
кишечным эпителием личинок An. stephensi. Научная новизна. В работе впервые: всесторонне изучено воздействие эндотоксинов Сгу4В и CryllA на эпителиальные клетки личинок Ае aegypti; с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов визуализировано место связывания этих белков с кишечным эпителием насекомого; выделены 65 и 57 кДа токсинсвязывающие белки из апикальных мембран эпителиальных клеток личинок An. stephensi; высказано предположение, что наряду с выделенными ранее в лаборатории химии белка ГосНИИгенетика токсинсвязывающими белками из Ае. aegypti, эти два белка образуют не описанный ранее класс рецепторов эндотоксинов Bacillus thurmgiensis.
Практическая ценность работы. Полученные данные о действии москитоцидных токсинов на кишечный эпителий личинок комаров и о природе рецепторов этих токсинов определяют направления дальнейших исследований механизма москитоцидного эффекта и возможные пути возникновения резистентных линий комаров. В свою очередь, эти исследования позволят в дальнейшем создать биоинсектициды нового поколения с существенно повышенной эффективностью биологического эффекта и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых.
Апробация работы, публикации. Основные положения диссертации представлены на конференции «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России» (Великий Новгород, 2000), II Республиканской научной конференции (Великий Новгород: НовГУ, 2002), на XXVII Межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященной памяти акад. Е.Н. Павловского (С.-Пб., 2000).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 6 научных работах, 3 из которых - в изданиях перечня ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 136 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Список цитированной литературы содержит 179 названий, из которых 7 - на русском языке.
Благодарности. За содействие в выполнении данной работы выражаю свою искреннюю благодарность: моим научным руководителям И.А. Залунину и СЮ. Чайке за чуткое научное руководство, дбн Д.П. Жужикову за рецензирование рукописи, всем сотрудникам Лаборатории химии белка ГосНИИгенетика и сотрудникам кафедры энтомологии МГУ, а также сотрудникам Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета за всестороннюю помощь в работе.
Ограниченный протеолиз Cry- белков
Эндотоксины В. thuringinsis функционируют в кишечнике насекомых и, следовательно, находятся под жёстким воздействием протеолитических ферментов. Структура Cry-белков обладает некоторыми отличительными особенностями, позволяющими не только сохранить биологическую активность в этом агрессивном окружении, но и использовать протеолиз для активации. Эндотокины с молекулярной массой 130-140 кДа являются проток-синами, активация которых сопровождается протеолизом С-концевой половины молекулы. Как правило, при активации протоксинов от их молекулы отщепляется также небольшой (20 - 30 аминокислотных остатков) N-концевой фрагмент молекулы (Nagamatsu et al., 1984).
Образующиеся в ходе протеолиза протоксинов истинные токсины в большинстве случаев устойчивы к дальнейшей деградации. Эта устойчивость обеспечивается интегральностью молекулярной структуры: домены тесно связаны друг с другом многочисленными нековалентными взаимодействиями, петли, соединяющие домены и различные элементы структуры внутри доменов, как правило, хорошо защищены от контакта с протеолитическими ферментами. Вместе с тем, ряд токсинов подвергаются дальнейшему проте-олизу. Чаще, это происходит с 65-70 кДа эндотоксинами. Имеющиеся примеры можно разделит на две группы. В первом случае протеолиз происходит по одной из петель, соединяющих а-спирали N -концевого домена. Так, трипсин гидролизует активированные токсины Сгу4А и Cry 4В, а химотрипсин и суб-тилизин гидролизуют активированный токсин Сгу9А до фрагмента с молекулярной массой 50 кДа (Angsuthanasombat et al., 1991, 1992,1993; Zalunin et al., 1998). В обоих случаях гидролизуемая связь находится в С-концевом районе петли, соединяющей пятую и шестую а-спирали. Эндотоксины СгуЗА (Caroll et al., 1989) и Cry2A (Nicholls et al., 1989) претерпевают гидролиз в районе петли, соединяющей 3-ю и 4-ю а-спирали. В определённых условиях протеиназы кишечного сока гусениц могут отщеплять al и а2а от токсина CrylAb (Miranda et al., 2001). Протеолиз эндотокина Cryl 1А осуществляется по другой схеме. Он гидролизуется в районе петли, соединяющей тяжи рЧ и (35 в домене II, так что в ходе протеолиза образуются две примерно равные половины молекулы (Dai and Gill, 1993; Revina et al., 2003). Как и в случае протеолиза, протекающего в пределах N-концевого домена, чувствительность петель, соединяющих (3-тяжи для действия протеиназ определяется их длиной и доступностью для контакта с протеолитическими ферментами (Revina et al., 2003).
Неодинаковые пути протеолиза истинных токсинов могут указывать на различия в механизме взаимодействия энтомоцидных белков с мембранами чувствительных клеток. Если это так, то приходится признать, что особенности структурной организации отдельных эндотоксинов как бы управляют правильным ходом активации этих белков в кишечнике.
Во многих случаях процессинг активированных токсинов не приводит к их существенной инактивации (Caroll et al., 1989; Zalunin et al., 1998; Revina et al., 2003). Часто это связано с тем, что после расщепления пептидной связи продукты ограниченного протеолиза могут оставаться связанными некова-лентными взаимодействиями и образовывать активный комплекс. Так, после гидролиза трипсином эндотоксин Cryl 1А сохраняет исходную биологическую активность. Токсичность исчезает после разделения продуктов протеолиза с помощью хроматографии, однако восстанавливается вновь при объединении последних (Revina et al., 2003).
Однако 50 к Да фрагмент токсина Сгу4В сохраняет биологическую активность даже после очистки от других продуктов гидролиза с помощью хроматографии (Zalunin et al., 1998).
В некоторых случаях протеолиз истинного токсина приводит к изменению спектра биологической активности. Так, эндотоксин Сгу2 после обработки химотрипсином приобретает цитолитическую активность, отсутствующую в исходном белке (Nicholls et al., 1989). Обработка эндотоксина Cryl Ab из штамма IC1 подвида aizawai кишечным соком личинок комара вызывала появление москитоцидной активности, отсутствующей у продуктов протеолиза этого белка кишечным соком гусеницы (Haider and Ellar, 1989). С другой стороны, имеются примеры, когда обработка кишечным соком москитов уменьшает биологическую активность эндотоксинов по отношению к этим насекомым. Так, фрагменты с молекулярной массой 48 и 49 кДа, полученные при обработке эндотоксина Сгу4В кишечным соком А. aegypti, существенно менее токсичны для этого комара, чем 50 кДа фрагмент, полученный при действии на тот же белок трипсином (Zalunin et al., 1998).
Cry-белки токсичны только для личинок насекомых из отрядов Lepi-doptera, Diptera, Hymenoptera и Coleoptera, а также нематод. Имеется несколько непроверенных сообщений о существовании Cry-токсинов, действующих на некоторых простейших, червей и клещей. Эти белки абсолютно безвредны для всех позвоночных и большинства беспозвоночных животных. Правда, не следует исключать возможности обнаружения в природе новых штаммов В. thuringiensis, продуцирующих токсины с необычной специфичностью. Кроме того, уже обнаружено большое количество Cry-белков, для которых природная мишень до сих пор не найдена, и токсинами их можно называть с определённой натяжкой.
Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков
После того как была разработана методика получения везикул апикальных мембран кишечного эпителия (brush border membrane vesicles, BBMV) (Wolfersberger, 1984) у исследователей появился удобный инструмент для изучения связывания токсинов с чувствительными мембранами. Эти эксперименты быстро выявили следующие основные черты такого связывания:
1) С мембранами связываются только активированные токсины (Hofinann etal., 1988).
2) Связывание высоко специфично. Токсины В. thuringiensis всегда связываются с BBMV из чувствительных к ним организмов. Наоборот, связывание с BBMV из нечувствительных организмов никогда не наблюдается. Так, например, токсины Cryl А взаимодействуют с мембранами из Н. virescens и М. sexta, но не связываются с BBMV из кишечника таракана, саранчи и ряда органов млекопитающих. В то же время, СгуЗА, безвредный для указанных видов гусениц, с их мембранами практически не связывается (Van Rie et al., 1989).
3) Связывание имеет насыщающий характер, т.е. при увеличении концентрации токсина связывание вначале увеличивается, но затем выходит на плато (Hofinann et al., 1988). Это свидетельствует о связывании с рецептором, поскольку концентрация последнего в мембранах не велика.
4) Связывание на первых порах имеет обратимый характер, но впоследствии начинает проявляться необратимая фаза связывания. Так, при взаимодействии Cryl Ab с мембранами P. brassicae связавшийся токсин не может быть вытеснен уже через 10 мин. Наличие необратимой фазы, по всей видимости, объясняется проникновением связавшегося белка в мембрану (Hofinann et al., 1988).
5) Один токсин может иметь как один, так и несколько сайтов связывания. Причём разные сайты могут быть близки по таким параметрам, как аффинность и концентрация мест связывания, или существенно различаться. Так Cry 1 Аа узнаёт на везикулах Н. virescens два сайта с близкой аффинностью, тогда как Cry 1С и Cry IE связываются с мембранами М. sexta и S. littura в двух сайтах, существенно различающихся по аффинности (Van Rie et al., 1990).
6) Разные токсины, обладающие активностью против данного насекомого, могут взаимодействовать с одним и тем же рецептором на его мембранах, или с разными. Экспериментально это наблюдается по конкурентному ингибированию связывания одного из токсинов, меченого какой-либо меткой, избытком немеченого варианта другого токсина. Так, было показано, что у BBMV Н. virescens имеется три сайта связывания с CrylA-белками: первый связывает все три токсина, второй CrylAb и CrylAc, третий только CrylAc (Van Rie et al., 1989). Токсины Cry 1С и Cry IE узнают сайт (сайты), отличные от сайтов связывания CrylAa (Van Rie et al., 1990) и сами связываются с разными сайтами на BBMV S. littoralis (Avisar et al., 2004).
Использование меченых токсинов позволило получить количественные характеристики связывания и попытаться с их помощью установить роль последнего в обеспечении специфичности действия Cry-белков. Изучение кинетики связывания первоначально опиралось на уравнение обратимой одностадийной бимолекулярной реакции: где Т и R означают токсин и рецептор, а к+1 и к. і - константы скорости реакции ассоциации и диссоциации, соответственно. При изучении зависи мости количества связавшегося токсина от его концентрации были рассчитаны величины Kd (концентрация токсина, при которой связывание метки достигает 50% от максимального), которая равна к.]/ k+i и Втах (максимальное количество связавшегося токсина на мг белка везикул). Если рецепторов несколько, то, вместо Втах, принято говорить о Rt-концентрации данного рецептора.
Оказалось, что различия в величинах этих параметров у разных пар токсин-мембрана не всегда количественно коррелировали с различиями в токсичности, выраженными в LC50 (концентрация токсина, при которой происходит гибель 50% насекомых).
Так, было показано, что Cryl Аа в 80 раз менее токсичен для Heliothis virescens, чем Cryl Ас. При этом BBMV из этого насекомого действительно хуже связывают Cryl Аа, чем Cryl Ас. Величина Kd в первом случае больше (т.е. аффинность хуже) в 1,5 раза, а концентрация сайтов связывания меньше в 3 раза, однако этого явно недостаточно, для того, чтобы объяснить столь большую разницу в токсичности. Ещё более разительный пример несоответствия данных по токсичности и по связыванию привёл Wolfersberger (1990). CryІАЬ в 400 раз токсичнее по отношению к Lymantria dispar, чем Cry 1 Ас. В тоже время, аффинность при связывании с BBMV этого насекомого у него в 10 раз хуже, при том, что значения Втах у двух токсинов очень близкие. Выявленные несоответствия заставили вспомнить о необратимой фазе связывания. Была предложена другая схема реакции: концентрация сайтов связывания; BS T - обратимо связанный токсин; BS - необратимо связанный токсин; к2 - скорость необратимого связывания (проникновения в мембрану). Было показано, что значения к2 лучше соответствуют токсичности, чем Kd, которую в новой терминологии принято называть К1/2 (Liang et al., 1995). Поскольку необратимая фаза связывания представляет собой интеграцию токсина в мембрану, то к2 в определённом смысле характеризует, насколько связывание с данным рецептором удобно для осуществления процесса интеграции токсина в мембрану. Заметим также, что в таком многостадийном и многофакторном процессе, как токсичность и не следует ждать точных количественных соответствий. Однако расчёт всех описанных констант объективно характеризует стадию связывания и широко используется в исследованиях.
Влияние индивидуальных токсинов на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti
По сравнению с контролем у опытных личинок обнаруживаются нарушения целостности эпителиального слоя. Во многих местах можно наблюдать разрывы между соседними клетками (рис. 35). Интересно, что на рис. 35 можно наблюдать одну из регенерационных эпителиальных клеток, для которых свойственно наличие относительно большого ядра.
Перитрофическая оболочка шириной 0.2 мкм не имеет отчетливо выраженных слоев, её электронная плотность уменьшена (рис. 36-38). На рис.38 хорошо видно, что перитрофическая оболочка смещена от эпителия средней кишки вглубь полости последней.
Апикальная поверхность эпителиальных клеток под действием токсина сильно видоизменяется, а микроворсинки размещены нерегулярно. Длина последних меньше (0.4 мкм), а диаметр больше (0.6 мкм), чем у контрольных личинок сходного возраста (рис. 39). На поверхности мембраны микроворсинок гликокаликс не обнаруживается.
Цитоплазма клеток средней кишки подвергается значительной дезинтеграции. Надъядерная область приобретает мелкогранулированный вид, цитоплазму клеток пронизывают многочисленные удлиненные лакуны, тянущиеся от базального лабиринта в направлении апикальной поверхности клеток (рис. 40, 41), формируются и многочисленные округлые вакуоли разного диаметра. В митохондриях происходит расширение крист, образуются пустоты (рис. 42). Меняется структура эндоплазматического рети-кулума и лизосом.
Действие кристаллов Bti (0,2 нг/мл) в течение 3 ч. При воздействии даже небольших концентраций (0.2 нг/мл) эндотоксина, но в течение 3 часов многие клетки лишаются микроворсинок (рис. 43). Многие цитоплазматические органеллы разрушаются (рис. 44). В клетках возникают большие разрывы (рис. 45-47). Наблюдаются изменения и в базальном отделе клеток, в частности происходит отслоение базальной мембраны. Окружающие среднюю кишку мышцы теряют свою правильную структуру, (рис. 48).
Действие кристаллов Bti (1 нг/мл) в течение 1 и 2,5 ч. В передней кишке в области кардиального отдела эпителиальные клетки покрыты слоем кутикулы толщиной 0.3 мкм (рис. 49,50). Рядом с клетками видны слои формирующейся перитрофической оболочки (рис. 51,52). В целом картина не отличается от той, что наблюдается в отсутствие токсина (данные не приводятся). Таким образом, каких-либо разрушений, вызванных воздействием кристаллов Bti, взятых в высокой концентрации, в течение длительного времени, в этом отделе кишечника не обнаруживается.
В средней кишке перитрофическая оболочка находится на разном удалении от микроворсинок эпителиальных клеток. Перитрофическая оболочка никогда полностью не разрушается, поэтому она отделяет содержимое кишечника от эпителиальных клеток (рис. 53). Между перитрофической оболочкой и эпителиальными клетками выявляются хлопьевидные частицы, природа которых нам неизвестна. Однако мы предполагаем, что это продукты распада микроворсинок и гликокаликса.
Действительно, на рис 53 хорошо заметно укорочение и уменьшение количества микроворсинок. У последних снижается количество микротрубочек, они теряют гликокаликс и размещены нерегулярно (рис. 54). Рисунок 60 иллюстрирует полную редукцию внутреннего содержимого микроворсинки.
Вакуоли базального лабиринта выстраиваются в длинные цепочки, простирающиеся от базального отдела клетки к апикальному (рис. 55, 56). Таким образом, базальный лабиринт практически достигает апикального отдела. Во многих местах базальная мембрана либо полностью разрушается, либо отходит от основания клеток (рис. 57). Регенерационные клетки, рас положенные в основании эпителиального пласта, отслаиваются от соседних клеток и сжимаются (рис. 58).
В тоже время, деградация микроворсинок уменьшается по направлению к заднему отделу средней кишки, что иллюстрируется рис. 59.
В заднем отделе средней кишки также происходят существенные изменения. Между отдельными клетками эпителиального пласта возникают разрывы (рис. 61). Цитоплазма эпителиальных клеток средней кишки и присутствующие в ней органеллы теряют свою обычную структуру (рис. 62, 63). Особенно сильно повреждается гранулярный эндоплазматический ретикулум. От митохондрий часто остается только остов, а их внутреннее содержимое подвергается деструкции. Во многих клетках область базального лабиринта приобретает повышенную электронную плотность (рис. 65).
Однако, микроворсинки сохраняют здесь свою вытянутую форму (рис. 64). Интересно, что микроворсинки в этом отделе кишечника существенно длиннее (в 3-4 раза), чем в других отделах (данные не приводятся). Возможно, что они несут несколько иную функцию и имеют другой состав плазматической мембраны, что, в конечном счёте, отражается на способности токсинов Bti делать в них поры.
В задней кишке (в области пилорического отдела и тонкой кишки) сохраняется обычная структура клеток. Здесь четко выражены митохондрии, мембраны гранулярного ретикулума, имеются небольшие вакуоли. Апикальная поверхность клеток представлена удлиненными цито-плазматическими тяжами, в которых размещены митохондрии удлинённой формы (рис. 66). Снаружи апикальная поверхность выстлана кутикулой, в которой хорошо различаются два слоя. Вблизи клеточной поверхности скапливаются остатки перитрофической оболочки (рис. 67).
Визуализация связывания москитоцидных белков с кишечным эпителием личинок A. aegypti
При хроматографии экстракта белков ВВМ An. stephensi на колонках с Сгу4В- и Cryl 1 А-сефарозой их большая часть не связывалась с сорбентами и выходила в проскоке (рис.132). В тоже время 1 М NaCl в обоих случаях элюировал пару белков с мол. массой 65 и 57 кДа, способных реагировать с биотинилированным токсином Cryl 1А в условиях лиганд-блоттинга (рис. 132).
По своей молекулярной массе эти белки близки к токсинсвязывающим белкам из A. aegypti (65 и 62 кДа) (Кригер и др., 1999). Похожей мол. массой обладают также рецептор эндотоксина В. sphaericus из кишечного эпителия личинок комара Culex pipiens (60 кДа) (Simpson, and Newcomb, 2000) и Cryl Ac-связывающий белок из гусеницы Heliothis virescens (68 кДа) (Banks et al., 2001). В тоже время основное большинство рецепторов лепидоцидных токсинов существенно отличаются по мол. массе (100-170 кДа у представителей класса аминопептидаз N (Спсктоге et al., 1998; Knight et al., 1994; Gill et al., 1995; Laemmli, 1970); Lorence et al, 1997) и 210 кДа у кадгериноподоб-ных белков (Valaitis et al., 1995 ).
Как было показано выше, эксперименты по лиганд блоттингу выявили в суммарном экстракте BBMV An. stephensi только один из этих компонентов, белок с мол. массой 65 кДа. Возможно, что 57 кДа белок является продуктом его ограниченного протеолиза, происходящего в ходе выделения.
Поскольку связывание с аффинным сорбентом происходит в условиях, близких к нативным, то можно сделать вывод, что выделенные нами белки способны связываться с токсинами не только в денатурированном (условия лиганд-блоттинга) но и в нативном состоянии.
Электрофоретический анализ фракций, полученных в ходе аффинной хроматографии белков ВВМ An. stephensi на сорбентах Сгу4В- и Сгу11А-сефароза. Электрофорезу в присутствии DS-Na подвергли следующие образцы: экстракт мембранных белков (дорожка 2); белки, не связавшиеся с Сгу4В - сефарозой (дорожка 3); фракции 1-4, элюированные 1М NaCI с Сгу11А-сефарозы (дорожки 4-7) или с Сгу4В-сефарозы (дорожки 8-11). Дорожка 1 содержит стандарты мол. массы. Гели проявляли с помощью Кумасси R-250 (а), или методом лиганд-блоттинга с использованием в качестве лиганда биотинилированного эндотоксина Сгу11А (б).
Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ An. stephensi с токсинами В. thuringiensis, обладающими различной специфичностью энто-моцидного эффекта.
Рецепторы токсинов, выделенные из различных видов насекомых, как правило, не связываются с Cry-белками, к которым данное насекомое устойчиво (Gill et al., 1995). Поэтому изучение специфичности связывания являет-ся важным этапом в доказательстве участия данного токсинсвязывающего белка в исполнении рецепторной функции in vivo. В условиях лиганд-блоттинга белки, элюируемые 1М NaCl как с CryllA-, так и с Сгу4В-сефарозы, одинаково реагируют и с Cry4Box и эндотоксином Cryl 1 А, взятыми в концентрации 4 мкг/мл (рис. 132, 133). В тоже время, они практически не взаимодействуют с биотинилированными CrylAox, обладающими лепидоцидной активностью и СгуЗА, действующим на личинок жуков, используемыми в концентрации 8 мкг/мл (рис. 133). Эндотоксин CytlA также не обладает способностью связываться с 65 кДа- и 57 кДа-белками из An. stephensi (рис. 133). Этому токсину свойственна высокая москитоцидная активность, однако ранее было высказано предположение (Crickmore et al., 19981), что при осуществлении своего токсического эффекта он не нуждается во взаимодействии с рецептором. Все эти результаты доказывают высокую специфичность, проявляемую 65 кДа- и 57 кДа-белками из An. stephensi при взаимодействии с токсинами В. thuringiensis. Ранее для 65 кДа- и 62 кДа-токсинсвязывающих белков из мембран A. aegypti было показано отсутствие взаимодействия с токсином CrylAb из ssp. alesti, не обладающим активностью против личинок комаров (Кригер и др., 1999).
Изучение специфичности связывания с 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ A. stephensi с эндотоксинами ВТ. Нитроцеллюлозные реплики, содержащие 65 кДа- и 57 кДа-бепки, элюированные с (1) Сгу4В- или (2) Сгу11А-сефарозы, инкубировали со следующими биотинилированными белками: (а) Cry4Box ; (б) эндотоксином Сгу11А; (в) смесью Cry1Aox из кристаллов ssp.kurstaki ; (г) эндотоксином СгуЗА; (д) эндотоксином CytIA Белки Сгу4В и Сгу11А использовали в концентрации 4 мкг/мл, белки Cry1 АЬ, СгуЗА и CytA-в концентрации 8 мкг/мл.
Если нитроцеллюлозные реплики, содержащие белки, элюируемые 1М NaCl с Cryl 1 А- или с Сгу4В-сефарозы, проинкубировать с биотинилирован-ным Cry4Box, а затем с избытком небиотинилированного варианта этого же токсина, то используемая система детекции не выявляет полос, соответствующих 65 кДа- и 57 кДа-белкам (рис. 134). Это говорит об обратимости связывания Cry4Box с изучаемыми мембранными белками.
Гомологическая и гетерологическая конкуренция при взаимодейст вии эндотоксина Cryl 1А и Cry4Box с 65 кДа- и 57 кДа-белками. Обработка нитроцеллюлозных реплик, содержащих белки, элюируемые 1 М NaCl с аффинных сорбентов, смесью биотинилированного Сгу4Вox и 10-кратного избытка его небиотинилированного варианта (гомологическая конкуренция) не приводит к последующей визуализации полос, соответствующих 65 кДа- и 57 кДа-белкам (рис. 134). Аналогичные результаты получаются, если проинкубировать эти же реплики со смесью биотинилированного Cryl 1А и 10-кратного избытка небиотинилированного Cryl 1А (рис. 134).
В условиях гетерологическои конкуренции, когда реплики обрабатывают смесью биотинилированных Cry4Box или Cryl 1А и 10-кратного избытка небиотинилированного гетерологического белка (соответственно, Cryl 1А или Cry4Box) проявления полос также не наблюдается. Эти результаты иллюстрируются (рис.134). Таким образом, изучение связывания выделенных нами из An. stephensi 65 кДа- и 57 кДа-белков с Cry4Box и Cryl 1 А, в экспериментах по гомологической и гетерологическои конкуренции показало следующее: 1) способность к связыванию с 65 к Да- и 57 кДа-белками не является следствием биотинилирования москитоцидных токсинов, поскольку предотвращается десятикратным избытком их небиотинилированных аналогов (рис. 134); 2) сравнение результатов экспериментов по гомологической и при изучении связывания Cry4Box с 65 кДа- и 57 кДа-белками из ВВМ A. stephensi. Нитроцеллюлозные реплики, содержавшие 65 кДа- и 57 кДа-белки, элюированные с Сгу4В-сефарозы (1) и с Сгу11А- сефарозы (2), инкубировали со следующими эндотоксинами или их смесями: (а) биотинилированным Cry4Box (4 мкг/мл); (б) смесью биотинилированного Cry4Box (4 мкг/мл) и небиотинилированного Cry4Box (40 мкг/мл); (в) смесью биотинилированного Cry4Box (4 мкг/мл) и небиотинилированного Сгу11А (40 мкг/мл). В случае (г) после обработки нитроцеллюлозного фильтра биотинилированным Cry4Box (4 мкг/мл) следовала его инкубация с десятикратным избытком небиотинилированного варианта этого же токсина.
