Введение к работе
Актуальность темы. Одними из наиболее эффективных и широко применяемых биопестицидов для борьбы с вредными насекомыми являются препараты на основе споро-кристаллического комплекса и отдельных параспоральных белков (Cry- и Cyt- белков, 8-эндотоксинов) грамположительной спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis. Преимуществами биопестицидов на основе В. thuringiensis по сравнению с химическими инсектицидами являются высокая специфичность действия, отсутствие загрязняющих остатков и сравнительно низкая стоимость процедур, требуемых для регистрации их в качестве средств защиты растений (Вершинина, Алимова, 2000). Кроме того, Cry-гены введены в целый ряд растений для их защиты от вредных насекомых (генно-модифицированные Bt-растения).
Сведения о действии Zft-растений и биоинсектицидов на основе различных компонентов В. thuringiensis на нецелевые объекты носят противоречивый характер. С одной стороны, литературные данные свидетельствуют об абсолютной экологической безопасности данных препаратов в рекомендуемых дозах, неактивности их компонентов в отношении теплокровных (Кандыбин, 1989; Головко и соавт., 1993; Киль, Надыкта, 2002). С другой стороны, определенные штаммы данного микроорганизма содержат гены, ответственные за образование энтеротоксинов, вызывающих отравление с диарейным синдромом, и гемолизина, гомологичного гемолизину II В. cereus и сходного с ним по свойствам (Hansen et al,. 1998; Perani et al, 1998; Gaviria Rivera et al, 2000; Helgason et al, 2000; Imre et al, 2005).
Некоторые штаммы В. thuringiensis описаны как антибиотически активные против грибов и бактерий, способные проявлять бактериостатическое или бактерицидное действие (Авторские свидетельства Н.С. Егорова и соавт., № 1367491 и № 1420947, 1987 и 1988 годов; Юдина и соавт., 1988; Юдина и Егоров, 1996; Юдина и Бурцева, 1997; Кандыбин и Смирнов, 1999; Смирнов, 2000; Юдина, 2006; Marrone et al, 1999).
Известно, что белковые токсины способны оказывать влияние на микроорганизмы, входящие в состав нормального микробиоценоза кишечника: вызывать появление новых патогенных и условно-патогенных штаммов, изменять биологические свойства отдельных представителей микробиоты, селективно ингибировать или, напротив, усиливать их рост, обусловливать дисбиотические нарушения (Барановский и Кондрашин, 2000; Лобзин и соавт., 2003; Костюкевич, 2007).
При токсикологической оценке, гигиеническом нормировании и регламентации производства и применения биопрепаратов изучение
бактериоценоза желудочно-кишечного тракта животных представляется весьма важным и актуальным, так как в организм животных и человека Сгу-белки могут попадать перорально, вместе с пищей, прежде всего - с продуктами, содержащими генетически модифицированные Bt растения.
Цель исследования. Целью данного исследования явилась оценка влияния дельта-эндотоксинов В. thuringiensis subsp. kurstaki, являющихся основным действующим началом ряда биопестицидов, применяющихся в защите растений, на микроорганизмы биотопа прямого отдела толстого кишечника мышей при их пероральном введении in vivo.
Были поставлены следующие задачи:
Выявить изменение характера поведения и симптомов проявления дисбактериоза у белых мышей при пероральном введении дельта -эндотоксинов В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52.
Определить влияние дельта - эндотоксинов на изменение состава и численности микробиоты прямого отдела толстой кишки животных.
Изучить особенности микробного пейзажа толстого кишечника мышей при экспериментальном дисбактериозе, обусловленном действием высоких доз дельта-эндотоксинов.
Рассмотреть особенности межбактериальных взаимодействий в условиях формирующегося патобиоценоза толстого кишечника под влиянием бактериальных токсинов.
Выявить изменение персистирующих и патогенных свойств ряда бактерий, входящих в состав биотопа толстого кишечника мышей при экспериментальном дисбактериозе: антилизоцимную (АЛА), антиинтерфероновую (АИА) активности и адгезивные свойства.
Научная новизна работы. Впервые изучено действие дельта-эндотоксинов В. thuringiensis на кишечную микробиоту. Показано, что пероральное введение растворов дельта-эндотоксинов В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе от 1 до 50 мг/кг веса животных в течение 28 суток не оказывает существенного влияния на изменение состава и численности микробиоценоза толстого кишечника белых мышей. Высокие дозы дельта-эндотоксинов (100 мг/кг веса животных) вызывают развитие дисбиотических изменений в толстом кишечнике белых мышей, изменение характера межмикробных взаимодействий и усиление факторов патогенности и персистирующих свойств условно-патогенных бактерий уже с первой недели применения.
Практическая значимость работы. Полученные результаты, демонстрирующие действие дельта - эндотоксинов В. thuringiensis subsp. kurstaki в отношении микробиоты желудочно-кишечного тракта теплокровных
животных, могут быть использованы при контроле регламента производства и биологической активности промышленно выпускаемых биопестицидов, разработке норм и доз их безопасного применения и при оценке степени токсичности генетически модифицированных Zft-растений в отношении теплокровных животных и человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
Пероральное введение растворов дельта-эндотоксинов В. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 в дозе от 1 до 50 мг/кг веса белых мышей в течение 28 суток не оказывает значимого влияния на изменение состава и численности микробиоценоза толстого кишечника.
При применении дельта-эндотоксинов в дозе 100 мг/кг веса уже на первой неделе эксперимента происходит развитие дисбиотических изменений в толстом кишечнике белых мышей: происходит структурная перестройка микробиоценоза, чаще выявляются гемолитические штаммы видов Escherichia coli и Staphylococcus aureus, проявляющие антагонистическое действие в отношении ряда микроорганизмов, наблюдается увеличение степени патогенности и персистирующих свойств штаммов некоторых видов условно-патогенных микроорганизмов.
Работа выполнена на экологическом факультете ФГБОУ ВПО УлГУ при частичной поддержке гранта МО РФ аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» по проекту № 2.1.1/2275 «Разработка теоретических основ экологически безопасного регулирования численности вредных организмов дельта -эндотоксинами Bacillus thuringiensis» и гранта ФЦП, гос. контракт № 02.740.11.5230.
Личный вклад автора - участие в практическом решении всех поставленных задач, анализе и обобщении полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на всероссийских и международных научных конференциях и симпозиумах разных уровней: «Проблемы защиты растений в условиях современного сельскохозяйственного производства» (ВИЗР, Санкт-Петербург, 2009); «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета» (Казань, КГУ), «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (МГУ, Москва, 2009); «Ломоносов -2010» (МГУ, Москва, 2010), «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (МГУ, Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав: обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, а также выводов, списка используемых литературных источников и приложений. Работа изложена на 163 страницах, содержит 11 таблиц, 11 рисунков и 9 приложений. Список использованных литературных источников включает 308 наименований, в том числе 209 зарубежных.
