Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Микробиометод в системе экологизированной защиты растений 8
1.2. Bacillus thuringiensis как агент микробиологической защиты растений 15
1.2.1. Экологическая ниша Bacillus thuringiensis 15
1.2.2. Факторы токсичности Bacillus thuringiensis 18
1.3. Кристаллические дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis 19
1.3.1. Формирование включений 19
1.3.2. Морфология и ультраструктура кристаллов 23
1.3.3. Белки кристаллов 25
1.3.4. Структурно-функциональная организация молекул эндотоксинов 30
1.3.5. Генетический контроль токсинообразования 32
1.3.6. Действие дельта-эндотоксинов на целевые объекты 36
2. Объекты и методы исследования 49
3. Результаты и их обсуждение 61
3.1. Дельта-эндотоксины как фактор антибиотической активности Bacillus thuringiensis 61
3.2. Влияние дельта-эндотоксинов на окислительный синтез АТФ бактериальными клетками 75
3.3. Специфика функционирования окислительных систем эндоток-синоустойчивых вариантов Pseudomonas syringae 99
3.4. Фитозащитная активность дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis 106
Выводы 133
Литература 134
Приложения 160
- Микробиометод в системе экологизированной защиты растений
- Экологическая ниша Bacillus thuringiensis
- Дельта-эндотоксины как фактор антибиотической активности Bacillus thuringiensis
- Влияние дельта-эндотоксинов на окислительный синтез АТФ бактериальными клетками
Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия особо остро стоит проблема экологической безопасности технологий, применяемых в агропромышленном комплексе для повышения урожайности и улучшения качества продукции. Одним из решений данной проблемы является ужесточение требований к химическим препаратам и частичная замена их биологическими средствами. В России, однако, при очевидном сокращении объёмов производства пестицидов (с 215 тыс. тонн в 1985 году до 9,7 тыс. тонн в 2000 году) внедрение в сельскохозяйственную практику альтернативных технологий крайне невелико (не более 0,5% от общего объёма использования пестицидов) (Захаренко, 2003; Монастырский, 2003). Применяемые на сегодняшний день биопрепараты производятся преимущественно на основе целых культур микроорганизмов и содержат помимо действующего начала примесь спор, вегетативных клеток, токсинов, что нежелательно с экологической точки зрения. В этой связи особенно перспективно создание средств на основе выделенных и очищенных биологически активных веществ.
Одним из таких агентов являются кристаллические дельта-эндотоксины, продуцируемые аэробной спорообразующей бактерией Bacillus thuhngiensis. Дельта-эндотоксины представляют собой семейство гомологичных белков, оказывающих избирательное действие на насекомых и практически неактивных в отношении теплокровных организмов (Bravo, 1997). На сегодняшний день рынок биопрепаратов на 90-95% представлен спорово-кристаллическими комплексами B.thuringiensis (Вершинина, Алимова, 2000). Создание препаратов на основе чистого эндотоксина позволило бы обеспечить снижение токсической нагрузки на агроценозы.
Некоторые штаммы B.thuringiensis описаны как активные против фитопа-тогенных бактерий и грибов (Marrone et al., 1999; Кандыбин, Смирнов, 1999; Смирнов, 2000; Климентова, 2001). Антимикробная активность показана также для дельта-эндотоксинов B.thuringiensis (Егоров и соавт., 1990; Юдина, Егоров, 1996; Юдина, Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003). Вышеиз-
5 ложенное позволяет рассматривать кристаллические белки в качестве перспективного агента защиты растений от бактериозов. Это, однако, требует детального изучения антибиотической активности дельта-эндотоксинов и их эффективности против бактериозов культурных растений.
Цель и задачи исследования.
Целью работы явилось установление и анализ антибиотического действия дельта-эндотоксина B.thuringiensis на фитопатогенные бактерии различных таксономических групп, а также оценка особенностей фитозащитной активности этого агента.
В соответствии с обозначенной целью нами были поставлены следующие задачи:
установить чувствительность некоторых грамположительных и грамотри-цательных фитопатогенных бактерий к дельта-эндотоксинам B.thuringiensis;
исследовать действие эндотоксинов на респираторную активность тест-культур и окислительный синтез АТФ бактериальными клетками;
оценить влияние состава питательной среды на восприимчивость бактерий к действию дельта-эндотоксина B.thuringiensis;
изучить роль сукцинатдегидрогеназы как одного из ключевых ферментов дыхательной цепи в эндотоксин-резистентности бактерий (на примере рода Pseudomonas);
в лабораторно-вегетационных опытах показать антибиотическое действие дельта-эндотоксинов на возбудителей бактериозов огурца, овса и фасоли;
изучить влияние эндотоксинов на развитие растений и их устойчивость к заболеваниям (на примере проростков овса).
Научная новизна результатов исследований. Впервые установлено ин-гибирующее действие дельта-эндотоксина на рост пяти штаммов фитопатогенных бактерий в условиях олиготрофности. Показано, что грамположительные бактерии высокочувствительны к низким концентрациям дельта-эндотоксинов. Однако для этих культур характерен вторичный рост. Развитие грамотрица-тельных бактерий подавлялось только в присутствии высоких концентраций
раствора кристаллов, вместе с тем вторичного роста культур в этом случае не происходило.
Показана зависимость активности окислительных систем фитопатоген-ных бактерий от качественного состава питательной среды. Впервые проведено изучение влияния дельта-эндотоксинов B.thuringiensis subsp.kurstaki, штамм Z-52 на респираторную активность бактериальных клеток в различных условиях инкубирования: в олиготрофной синтетической среде, евтрофной среде Сабуро, в олиготрофной среде, лимитированной по ионам Си (II).
Установлено угнетающее влияние эндотоксина на потребление неорганического фосфата бактериальными клетками, свидетельствующее о подавлении этим агентом окислительного синтеза АТФ.
Показано, что устойчивые к действию эндотоксинов диссоцианты P.syringae обладают повышенной активностью сукцинатдегидрогеназы по сравнению со средней активностью фермента, характерной для данных культур.
Установлена способность дельта-эндотоксинов подавлять бактериозы растений (овса, огурца, фасоли) и оказывать иммунизирующее действие (на овес).
Практическая значимость работы. Полученные результаты, демонстрирующие антибактериальное и фитопротективное действие дельта-эндотоксинов B.thuringiensis, могут быть использованы при создании средств защиты растений и технологии их практического применения.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы плодородия почв на современном этапе развития» (Пенза, 2002), VII и VIII Пущинской Международной школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пу-щино, 2003; 2004), V Международной конференции «Математическое моделирование физических, экономических, технических и социальных систем и процессов» (Ульяновск, 2003), Региональной научно-практической конференции молодых учёных «Актуальные проблемы современного здравоохранения и экологии» (Ульяновск, 2003), Всероссийской научно-практической конферен-
7 ции молодых учёных «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, 2004), XIII Международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции и применение» (Казань, 2005).
Публикации. По материалам конференций опубликовано 14 работ.
Структура и объём диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальных глав, выводов и приложений общим объёмом 172 страницы компьютерного набора. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 28 рисунками. Список литературы включает 265 наименований, в том числе 134 наименования на иностранном языке.
Микробиометод в системе экологизированной защиты растений
Преимущества микробных препаратов. В последнее время в сельскохозяйственной практике наметился переход к экологически обоснованной стратегии защиты растений. Возросший интерес к этому направлению обусловлен, прежде всего, достаточно глубоко изученной и хорошо освещенной в литературе проблемой негативных последствий химизации сельского хозяйства (Ябло-ков, 1988; Голышин, 1992; Федоров, Яблоков, 1999; Надыкта, Исмаилов, 1999; Малинин и соавт., 1995; Коваленков, Соколов, 1999). Так, многие авторы, помимо прямого токсического воздействия пестицидов на нецелевые объекты и агроэкосистемы в целом, отмечают формирование у вредных организмов резистентности к химическим средствам, а также сукцессию вредителей (смену форм, доминирующих в данном регионе). В последнем случае ранее не доминировавшие вредители и патогены трансформируются в экономически значимые (Коваленков, Соколов, 1999; Новожилов, 2003). При этом нет никаких оснований ожидать, что эти виды в обозримом будущем возвратятся в свои прежние экологические ниши, тем более что бессистемные химические обработки для них уже не являются серьёзным сдерживающим фактором.
Эти и многие другие факторы заставили ряд хозяйств сократить использование пестицидов, что, однако, ставит вопрос об их замене альтернативными технологиями.
Среди альтернативных подходов особое место занимает микробиологическая защита растений. Метод основан на использовании микроорганизмов (бактерий, грибов, актиномицетов) для контроля численности вредителей, подавления болезней, регуляции качественного и количественного состава микрофлоры почв и стимулирования роста культурных растений. Перспективность этого направления определяется целым рядом причин.
Во-первых, микроорганизмы представляют собой наиболее разнообразную в генетическом отношении и физиологически наиболее лабильную группу организмов. Вследствие этого биотехнологические продукты, созданные на основе микробов, способны функционировать в достаточно жестких условиях: в кислых, щелочных, аридных и переувлажненных почвах, а также антропоген-нонарушенных территориях (Соколов- и соавт., 2002). В ряде случаев микро-биометод позволяет достичь качественного состава агроценозов, обеспечивающего их саморегуляцию в течение длительного времени, подобно функционированию естественных систем (Дергтярева и соавт., 2003). Таким образом, активное изучение компонентов естественной микрофлоры и их использование в сельскохозяйственной практике может не только не наносить вреда окружающей среде, но и играть роль природоохранного фактора.
Во-вторых, микроорганизмы являются продуцентами многих хозяйственно полезных соединений: ферментов, антибиотиков, токсинов. Существующие технологии позволяют в лабораторных условиях получать эти продукты в больших объёмах и по сравнительно низкой цене. Как правило, для получения таких препаратов требуются малотоннажные производства на небольших (пилотных) заводах или даже в лабораторных условиях (Третьяков, 1995; Захарен-ко, 2003).
Активное внедрение микробиометода в сельскохозяйственную практику позволяет уже в настоящее время ограничить использование химических средств лишь теми случаями, когда вредители и патогены представляют собой реальную экономическую опасность. Если же поражение растений не превышает экономического порога, а также в случаях, когда защиту можно осуществить альтернативными методами, применение химических препаратов может и должно быть исключено (Габдуллин, 2003).
Применение биопрепаратов особенно актуально в защищенном грунте, водоохранных и курортных зонах, при выращивании культур, используемых для диетического и детского питания, а также в загрязнённых регионах (Слобо-дянюк и соавт., 1995; Захаренко, 2003).
Перечисленные факты указывают на перспективность производства и использования биопрепаратов, в том числе микробного происхождения. Современные направления микробиологического метода защиты растений. На сегодняшний день микробиологический метод развивается в основном в трёх направлениях: разработка микробных инсектицидов, получение биофунгицидов и микробиологическая стимуляция роста растений (Вершинина, Алимова, 2000; Дятлова, 2001).
К потенциальным агентам биологической защиты растений предъявляют достаточно жесткие требования. Такие микроорганизмы должны быть безопасны для теплокровных организмов, полезных насекомых и вместе с тем эффективно подавлять вредителей и патогенов даже при низких концентрациях. Кроме того, большое внимание уделяется генетической стабильности антагонистов, способности расти на дешевых средах, совместимости с химическими препаратами. При отборе потенциальных биоагентов учитывают также их фитотоксич-ность, так как некоторые бактерии, подавляющие гнили растений и плодов, сами являются фитопатогенами или близки им в систематическом отношении (Коробко, 1997).
Лишь немногие из известных активных антагонистов соответствуют столь высоким требованиям. Кроме того, поиск потенциальных биоагентов, а вместе с этим и расширение спектра микробных препаратов, затруднён главным образом недостаточной изученностью взаимосвязи между средой обитания антагонистов, их действием на вредителей и особенностями протекания паразитического процесса. Так, известно около 8 тыс. видов фитопатогенных микробов, а мировой ассортимент микробиологических средств защиты растений включает не более 150 наименований (Новожилов, 2003). По данным О.А.Монастырского (2003) доля биологических средств в защитных мероприятиях составляет в мире не более 2% от общего использования пестицидов, а в России - около 0,5%.
Экологическая ниша Bacillus thuringiensis
B.thuringiensis - грамположительные аэробные спорообразующие бактерии, характерным признаком которых является способность продуцировать комплекс кристаллических белков (дельта-эндотоксинов). Это свойство отличает B.thuringiensis от родственной ей B.cereus (Азизбекян, Смирнова, 1988).
Первое упоминание о Bacillus thuringiensis связано с именем японского исследователя Ишивато, который выделил данную бактерию из личинок тутового шелкопряда и назвал ее Bacillus sotto (Вершинина, Алимова, 2000). Позднее было описано целое семейство штаммов этой бактерии, каждый из которых характеризовался своим спектром восприимчивых насекомых (Berliner, 1915; Steinhaus, 1951).
Дифференциация B.thuringiensis на варианты, каждый из которых патогенен по отношению к узкой группе насекомых, является удобным способом для внутривидовой классификации этой бактерии. В зависимости от объекта подавления, различные изоляты B.thuringiensis классифицируют на пять патотипов: специфичный к чешукрылым патовар A (yar.berliner, dendrolimus или sotto, gal-leriae, kurstaki, thuringiensis), двукрылым патовар В (var.israelensis), жесткокрылым патовар С (var.tenebrionis или morrisoni), одновременно активные против чешуекрылых и двукрылых {var.aizawai) и патотип, активность которого пока не установлена (var.dakota) (Вершинина, Алимова, 2000; Бурцева и соавт., 2001).
Множественная активность некоторых подвидов B.thuringiensis несколько затрудняет их идентификацию. В этом случае более удобной оказалась схема, предложенная в 1962 году в институте Пастера (Париж). Она основывается на определении структуры жгутикового антигена в сочетании с некоторыми фи-зиолого-биохимическими тестами (Бурцева и соавт., 2001). Такой подход позволил определить около 50 серотипов B.thuringiensis. В ряде случаев для внутривидовой систематики B.thuringiensis оказалась удобной специфика роста этой бактерии на разных типах питательных сред. На эмпирически подобранных средах был исследован характер роста и описана гетерогенность некоторых подвидов B.thuringiensis. Так, например, выявлена дифференциация B.thuringiensis ssp.kurstaki на морфовары R, X, М, г, m, ml. Морфологические варианты B.thuringiensis различались между собой по целому ряду физиолого-биохимических свойств, а также инсектицидности и специфичности к насекомым (Бурцева и соавт., 2001).
Были предприняты достаточно успешные попытки использовать в систематике B.thuringiensis морфологические особенности белковых кристаллов. Было показано, в частности, что подвид B.thuringiensis ssp.kurstaki диссоциирует на варианты, продуцирующие крупные, ромбовидные кристаллы, содержащие включения (кристовар К-1), и варианты, продуцирующие кристаллы правильной ромбической формы, не превышающие по своему размеру споры (кристовар К-73) (Бурцева и соавт., 2001).
Традиционно B.thuringiensis рассматривали в качестве специфического энтомопатогена, однако в последнее время полагают, что данные бактерии относятся к группе почвенных микроорганизмов, которые в отличие от облигат-ных почвенных обитателей, успешно существуют в различных экологических нишах. B.thuringiensis высевается преимущественно из погибших насекомых, однако бактерии обнаруживаются также и на поверхности зелёных листьев, в листовом опаде, в пресных водоёмах и т.п. Более того, спектр подвидов, выделяемых из почвенных образцов оказывается гораздо шире качественного состава B.thuringiensis, выделенных из насекомых (Степанова и соавт., 1996).
В последнее время активно изучаются закономерности распространения подвидов B.thuringiensis в различных биотопах и связь экологии этого микроорганизма с его биологической активностью.
Многие авторы отмечают, что изоляты, полученные из почв, как правило, не образуют кристаллических включений, либо образуют мелкие кристаллы и в небольшом количестве. Такие образцы, как правило, не токсичны (Бурцева и соавт., 2001). Кроме того, у ряда культур группы B.thuringiensis показана потеря токсинообразования при длительном пребывании в почве. При этом серологические характеристики изолятов сохраняются (Кольчевский, Лескова, 1985).
Серологические свойства изолятов B.tharingiensis, полученных из различных источников, позволяют утверждать, что почвы особенно богаты штаммами подвида karstaki, а из пресноводных водоёмов и морской воды высевается преимущественно подвид israelemis. Кроме того, из абиотических источников были выделены кристаллообразующие формы с неопределённой систематической принадлежностью. Включения таких бактерий содержали белковые компоненты, не свойственные каким-либо из описанных штаммов, и препараты этих кристаллов не были токсичны для известных тест-объектов (Степанова и соавт., 1996).
Была проанализирована хозяйская специфичность кристаллообразующих изолятов B.thuringiensis. Ранее полагали, что подвиды, полученные из определённых видов насекомых, токсичны именно для данной группы организмов (Зурабова и соавт., 1988). Однако другие исследователи отмечают отсутствие строгой корреляции между источником выделения B.tharingiensis и их биологической специфичностью (Степанова и соавт., 1996). Так, штамм, выделенный из восточной плодожорки и синтезирующий кристаллы, по форме и белковому составу близкие кристаллам подвида tenebrionis (патовар С), оказался токсичным не только для личинок колорадского жука, но и целого спектра чешуекрылых. Среди сапрофитных штаммов (выделенных из различных типов почв, донного ила пресноводных водоёмов, из морской воды) так же обнаружены бактерии, проявляющие множественную биологическую активность.
Дельта-эндотоксины как фактор антибиотической активности Bacillus thuringiensis
Существует представление об участии в антибактериальной активности В.thuringiensis дельта-эндотоксинов. При этом, как полагают, спектр токсин-восприимчивых микроорганизмов достаточно широк и помимо грамположи-тельных бактерий, а включает также грамотрицательные Escherichia coli, Er-winia carotovora, Xanthomonas campestris (Юдина и соавт., 1988; Климентова, 2001).
Однако, природа антагонистического действия В.thuringiensis недостаточно исследована, не установлен также полный круг чувствительных микроорганизмов. Нами было проанализировано возможное участие дельта-эндотоксинов в антибиотической активности В.thuringiensis.
Многие авторы отмечают использование щелочных растворов (рН 12 и выше) как один из способов быстрого и полного растворения кристаллов В.thuringiensis (Честухина и соавт., 1977). Проведённый нами контроль с помощью светового микроскопа щелочной экстракции эндотоксинов показал, что использование 0,05 М NaOH позволяет достичь практически полного растворения кристаллов в течение 1 часа.
Полученные таким образом растворы содержали несколько белковых компонентов. На рис.3.1 представлена типичная картина электрофоретического разделения белков. Преобладающей является фракция с Mr 120-140 кДа (49,3-51,7%). Полоса, соответствующая этому белку оказалась слегка раздвоенной, что может указывать на неоднородность данного компонента. Вслед за указанной фракцией располагалась целая группа полос различной интенсивности, молекулярный вес белков которой варьировал в пределах 65-80 кДа. По данным денситометрии общее содержание этих компонентов в растворе составляет около 45%. Наконец, около 3-10% приходится на долю белка с Mr 55-65 кДа. Полоса, соответствующая данному белку, была однородной, что свидетельствует и об однородности указанной фракции. Другая причина появления в растворах фракций II и IV может быть связана с гидролизом щелочнолабильных связей, характерных для молекул дельта-эндотоксинов (Lecadet, 1966; Кукси, 1976).
Таким образом, растворы кристаллов В.thuringiensis subsp.kurstaki, штамм Z-52 представляют собой многокомпонентные системы, включающие 3-4 белковые фракции с различными электрофоретическими характеристиками.
В последние десятилетия антибактериальная активность дельта-эндотоксинов В.thuringiensis привлекает большое внимание. Однако, результаты такого рода экспериментов зачастую противоречивы. Некоторые исследователи отмечают селективность антибиотического действия отдельных компонентов кристаллов. Например, фракция с Mr около 60 кДа обладала активностью как по отношению к грамположительным бактериям, так и грамотрица-тельной E.coli, а белок с Mr 1 кДа действовал только на некоторые грамположительные бактерии и не влиял на рост E.coli (Юдина и соавт., 1988). Следует отметить, что многие авторы, исходя из факта поликомпонентности кристаллов В.thuringiensis, полагают, что совокупность всех белков, составляющих кристалл, по спектру биологической активности и силе действия превосходит отдельные фракции. Такое явление связывают с синергическим влиянием дельта-эндотоксинов (Van Frankenhuyzen et al., 1993; Poncet et al., 1995). Это мнение вполне согласуется с данными Юдиной и соавт. (1988) о том, что комплекс белков, составляющих кристалл, по отношению к микроорганизмам не проявляет высокую специфичность, характерную для инсектицидного действия. По отношению к одному и тому же тест-микроорганизму различные по происхождению кристаллы, как правило, различаются лишь силой антибиотического влияния.
Вышеперечисленное даёт основание предположить, что использование в дальнейших исследованиях растворов, содержащих всю совокупность токсичных фракций, наиболее оправдано, так как должно приводить к эффективному подавлению микроорганизмов.
Методом диффузии в агар нами была оценена антибактериальная активность дельта-эндотоксинов B.tlntringiensis в отношении штаммов P.syringae pv.pisi 16, P.syringae pv.lachrymam 23, P.syringae pv.striafaciens 9, C.insidiosum 14, C.michiganense 7. Ранее эти тест-бактерии были протестированы в условиях культивирования на среде РПА, где оказались устойчивыми к действию дельта-эндотоксинов (Климентова, 2001).
Диффузионный метод является одним из стандартных способов количественного учёта действия антибиотиков. Метод позволяет одновременно и в единых условиях оценить активность различных концентраций действующего вещества, характер действия антибиотика (бактерицидное или бактериостати-ческое), выявить концентрации, оказывающие максимальное ингибирующее действие на тест-микроорганизм, и минимальные концентрации, обладающие антибиотической активностью. Кроме того, диффузионный метод позволяет количественно сравнить микроорганизмы по чувствительности к ингибирую-щему агенту, а также оценить активность токсина в сравнении с известными антибиотиками.
Влияние дельта-эндотоксинов на окислительный синтез АТФ бактериальными клетками
Действие дельта-эндотоксинов на окислительную активность. Выявленное антибиотическое действие дельта-эндотоксинов B.thuringiensis, зависящее от условий культивирования микроорганизмов, ставит вопрос о природе данного явления. Анализ литературных данных указывает на то, что кристал лические белки являются цитостатиками, вызывающими деэнергизацию клеток-мишеней. Одним из возможных механизмов деэнергизирующего действия эндотоксинов, как полагают, заключается в разобщении окислительного фос форилирования и дыхания (Каменёк, 1998). Вполне вероятно, что антибактери альное действие этих агентов будет во-многом определяться особенностями энергетического обмена тестируемых бактерий., .
В последнее время некоторые исследователи придают большое значение изменчивости физиологического состояния фитопатогенных микроорганизмов и влиянию на этот процесс условий внешней среды. Известно, в частности, что для подавляющего большинства возбудителей инфекционных болезней растений характерна смена двух фаз -биотрофии (размножения) и некротрофии (выживания), в процессе которых происходит изменение в работе различных жизненных функций, в том числе и ферментативного аппарата. Полагают, что таким образом фитопатогенные микроорганизмы адаптируются к морфо-физиологическим особенностям своих «хозяев» (Чулкина, 1990).
Анализ условий обитания фитопатогенов в почве, на остатках пораженных растений и растениях в период развития заболевания показал, что пораженные растения обеспечивают наиболее благоприятные условия для развития и массового размножения фитопатогенов. Больные растения являются своего рода источником инфекции.
Напротив, почвы, остатки пораженных растений и посевной материал наименее благоприятны для патогенной микрофлоры. В этих условиях микроорганизмы не способны активно размножаться, находятся в состоянии анабиоза и адаптированы для перемещения к новым (здоровым) растениям. Следует отметить, что вторая фаза жизненного цикла паразитов малоизученна. Вместе с тем, именно в этот период фитопатогены-наиболее уязвимы (Чулкина, 1990). Вполне вероятно, что в фазу некротрофии фитопатогенные микроорганизмы будут особенно восприимчивы деэнергизирующим агентам, в том числе и к дельта-эндотоксинам В. thuringiensis.
В лабораторных условиях нами была проведена оценка влияние качественного состава питательной среды на активность окислительных систем фито-патогенных бактерий. Изучение окислительной активности бактерий проводили с использованием в качестве тест-объектов штаммов P.syringae pv.lachrymans 23, P. syringaepv.striafaciens 9 и C.sepedonicum 1. Бактерии относятся к группе облигатных аэробов.
Полученные результаты показали, что состав среды культивирования оказывает существенное влияние на развитие и свойства окислительных систем тест-микроорганизмов. Так, на сбалансированной евтрофной среде РПА в логарифмическую фазу развития для бактерий свойственны высокоактивные терминальные оксидазы (табл.3.3). На это указывает быстро развивающаяся окраска колоний в присутствии тетраметил-р-фенилендиамина. Высокая активность окислительных систем сочеталась с интенсивным ростом микроорганизмов. Уже через 4-6 часов на поверхности питательной среды происходило отчётливое формирование, колоний микроорганизмов. Известно, что в условиях культивирования на богатых органических средах в логарифмическую фазу развития бактериальные клетки активно окисляют субстраты и синтезируют АТФ (Акименко, 1989).
Иная картина отмечена в случае роста на олиготрофной среде №1, где появление колоний отмечали только через 1,5-2 суток. Низкая скорость роста была особенно характерна для штамма C.sepedonicum 1. Медленный рост тест-бактерий сочетался с низкой оксидазной активностью клеток. В этом случае отчётливая окраска колоний формировалась в течение 45-60 с. Следует отметить, что низкая активность окислительных систем была характерна также для стареющей культуры (стационарная фаза) в условиях роста на РПА. Замедленная тест-реакция свидетельствует о том, что окисление субстратов клетками происходит менее интенсивно, чем в условиях роста на РПА.
Следует отметить, в олиготрофных условиях бактерии оказались способны формировать устойчивые к ингибиторам дыхательные цепи. Как показали результаты наших наблюдений, при росте на среде №1 с добавлением сульфида Na отчётливая окраска колоний в присутствии тетраметил-р-фенилендиамина формировалась в течение 10 с, то есть значительно быстрее, чем это требуется для положительной реакции.
Напротив, при добавлении сульфида Na к среде РПА бактерии не индуцировали цитохромоксидаз, о чём свидетельствует отсутствие характерного окрашивания колоний (табл.3.3). При этом рост микроорганизмов был существенно угнетён, по сравнению с контрольным ростом бактерий на РПА.
Следует отметить, что бактерии так же не обладали цитохромоксидазной активностью при культивировании на олиготрофной среде, лимитированной по Си (среда №2). Вероятно, это свидетельствует о неспособности микроорганизмов синтезировать гемовые оксидазы в условиях роста на несбалансированных средах.
Как следует из анализа литературных данных, в отсутствие цитохромоксидаз бактерии могут окислять субстраты при участии оксидаз негемовой при роды, что, однако, сопровождается снижением степени сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования (Акименко, 1989).
Приведённые данные свидетельствуют о высокой лабильности окислительных систем бактерий, что, в свою очередь, может отражать адаптацию микроорганизмов к возможным изменениям естественных условий. Низкое содержание доступных для бактерий веществ, либо несбалансированный состав питательного субстрата в природных условиях, очевидно, провоцируют переход активно растущих микроорганизмов в фазу некротрофии. Таким образом, большой интерес представляет изучение восприимчивости окислительных систем к действию эндотоксинов при инкубировании бактерий в различных питательных средах.
Известно, что в первые минуты воздействия разобщающих агентов происходит компенсаторное стимулирование респираторной активности чувствительных клеток. Аналогичные симптомы должно иметь и действие на бактерии дельта-эндотоксинов В. thuringiensis.
Как показывает анализ литературных данных, типичная картина влияния эндотоксинов на респираторную активность чувствительных клеток наблюдается в присутствии низких концентраций действующих веществ (Travers et al., 1976 а; Каменёк, 1998). Полагают, что под воздействием высоких концентраций эндотоксинов функциональные изменения окислительных систем происходят настолько быстро, что их не удаётся зафиксировать. Поэтому для исследования влияния токсина на потребление кислорода бактериями нами была выбрана такая концентрация раствора эндотоксинов, чтобы конечное содержание действующих веществ в инкубационной среде оказалось сравнительно низким (0,15 мг/мл).
Как показали результаты наших исследований, при инкубировании бактерий в среде №1 в первые минуты воздействия дельта-эндотоксинов В.thuringiensis происходит резкое усиление респираторной активности тест-культур. Напротив, в евтрофных условиях (среда Сабуро), а также при инкубировании на среде №2 окислительные системы бактерий не проявляли выраженной чувствительности к эндотоксинам. .
