Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 10
1.1 Общая характеристика флавоноидов и их классификация 10
1.2 Содержание, распределение и метаболизм флавоноидов в растениях и почве 15
1.3 Функции флавоноидов в растениях 19
1.3.1 Роль флавоноидов в растительно-микробных отношениях 22
1.3.1.1 Влияние флавоноидов на полисахаридный состав поверхности бактериальной клетки 26
1.4 Бактерии рода Azospirillum как модельный объект исследования ассоциативных симбиозов 28
1.4.1 Гликополимеры поверхности азоспирилл, участвующие в формировании ассоциации с растениями 32
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 42
2.1 Объекты исследования 42
2.2 Приборы и материалы 44
2.3 Методы исследования 46
2.3.1 Исследование относительной гидрофобности поверхности
бактериальных клеток 46
2.3.2 Измерение ориентационных спектров клеток Azospirillum 46
2.3.3 Выделение углеводсо держащих компонентов внешней мембраны бактерий 47
2.3.4 Выделение О-специфических полисахаридов 48
2.3.5 Хроматографические методы
2.3.5.1 Гель-фильтрация 48
2.3.5.2 Газо-жидкостная хроматография 49
2.3.6 Колориметрические методы 49
2.3.6.1 Определение содержания углеводов в ЛПС 49
2.3.6.2 Определение концентрации белков по методике Бред форд
2.3.6.3 Определение 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты 50
2.3.6.4 Определение общего фосфора по методу Беренблюм и Чейн
2.3.7 ЯМР-спектроскопия 51
2.3.8 Электрофорез в полиакриламидном геле 52
2.3.9 Иммунохимические методы исследования 52
ГЛАВА 3 Исследование влияния флавоноидов растений на свойства поверхности бактерий рода azospirillum 53
3.1 Обоснование выбора бактериальных культур и флавоноидов 53
3.2 Выбор эффективных концентраций флавоноидов по отношению к микроорганизмам 55
3.3 Исследование свойств поверхности азоспирилл, выращенных в присутствии флавоноидов 68
3.4 Исследование свойств поверхности A brasilense SR55, выращенных в присутствии корневых экстрактов 75
ГЛАВА 4 Исследование состава и структуры гликополимеров поверхности a.lipoferum Sp59b и A. Brasilense SR55, выращенных в присутствии флавоноидов 78
4.1 Выделение и очистка препаратов липополисахаридов и капсульных полисахаридов азоспирилл, выращенных в присутствии флавоноидов 78
4.2 Сравнительный анализ химического состава липополисахаридов 82
4.3 Исследование структуры О-специфических полисахаридов и состава капсульных полисахаридов бактерий A. lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии кверцетина 85
4.4 Исследование О-специфических полисахаридов бактерий
A. brasilense SR55, выращенных в присутствии флавоноидов 89
Заключение 93
Выводы 98
Список использованных источников
- Содержание, распределение и метаболизм флавоноидов в растениях и почве
- Выделение углеводсо держащих компонентов внешней мембраны бактерий
- Исследование свойств поверхности азоспирилл, выращенных в присутствии флавоноидов
- Исследование структуры О-специфических полисахаридов и состава капсульных полисахаридов бактерий A. lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии кверцетина
Содержание, распределение и метаболизм флавоноидов в растениях и почве
Наиболее богаты флавоноидами (до 30% сухого веса) растения семейств: сложноцветные, бобовые, зонтичные, губоцветные, розоцветные, гречишные, рутовые, березовые. Значительно реже флавоноиды встречаются в микроорганизмах, лишайниках и тканях животных (Блажей и Шутый, 1977; Запро-метнов, 1993; Корулькин и др., 2007). Халконы, флавонолы и флаваноны обнаружены у мхов, на основании чего было высказано предположение, что синтез веществ флавонового ряда возник в ходе эволюции из-за необходимо 16 сти защиты растений от УФ излучения (Stafford, 1991; Koes et al, 1994; Win-kel-Shirley, 2001; Weston, Mathesius, 2013).
Содержание флавоновых веществ в растениях зависит от множества внешних биотических и абиотических факторов и может отличаться качественно и количественно в разных органах в пределах одного растения (Bertin et al., 2003; Morgan et al., 2005). Качественный и количественный состав флавоноидов может варьировать в пределах одного органа (Yang and Crowley, 2000). Локализуются они, главным образом, в цветках, листьях и плодах, в меньшем количестве в стеблях и корнях (Запрометнов, 1993; Ко-рулькин и др., 2007). Наибольшее количество флавоноидов в растениях наблюдается в лепестках во время цветения (до 4% от сухого веса) (Шарова и Куркин, 2007; Куркин и др., 2010; Мартынов, 2011), а также в шелухе и семенной кожуре, что является одновременно фактором привлечения полезной почвенной микрофлоры и защиты от патогенных организмов на ранних этапах развития растения (Oomah and Mazza, 1996; Dietrych-Szostak and Oleszek, 1999; Shahidi and Naczk, 2006). Содержание флавоноидов в листьях резко повышается во время цветения, а с окончанием цветения наблюдается резкое уменьшение количества флавоновых веществ. Также наблюдается их накопление в клетках кончика корня и корневого чехлика, откуда они могут выделяться в окружающую среду (Bayliss et al, 1997; Mathesius et al, 1998; Weston and Matesius, 2013).
В растениях флавоноиды могут содержаться в свободном и связанном видах. Чаще всего они представлены О-, реже С-гликозидами (Salunkhe et al., 1982; Shahidi and Naczk, 2006; Корулькин и др., 2007).
Биосинтез, накопление и экскреция флавоноидов зависит от таких факторов, как этап онтогенеза, климат, наличие и доступность питательных веществ, состав микрофлоры, наличие патогенных организмов, структура фитоценоза (Cesco et al, 2012; Weston and Mathesius, 2013; Мартынов, 2011). Для ортилии однобокой {Ortilia secunda L. house) обнаружена положительная зависимость количества флавоновых веществ в растении от содержания фос 17 фора в почве (Andersen and Markham, 2006; Ломбоева и др., 2010). К накоплению полифенольных соединений в растении приводит недостаток или малая доступность бора. Повреждение тканей, воздействие патогенных или симбиотических микроорганизмов также стимулируют синтез и экскрецию флавоноидов (Lawson et al, 1996; Makoi and Ndakidemi, 2007). Если почва бедна азотистыми соединениями, уровень флавоноидов в корнях резко увеличивается, что, очевидно, является приспособительной реакцией для привлечения ассоциативных азотфиксирующих бактерий, которые позволяют восстановить азотный баланс растения (Andersen and Markham, 2006; Kong et al., 2007). Также на примере Lotus pedunculatus показано, что при высоком содержании азота в почве синтез флавоноидов прекращается, поскольку у растения отсутствует потребность в дополнительной азотфиксации (Pankhurst et al., 1979). Было показано, что привнесение в почву флавоноидов в концентрации 50 мг на г почвы приводит к увеличению численности аммонифицирующих бактерий в верхних слоях (Kong et al., 2007).
Молодые растения Centaurea maculosa при выращивании в жидкой среде выделяют более 80 мкг/мл флавоноидов при стандартных условиях и свыше 180 мкг/мл, если в среде культивирования присутствуют фрагменты клеточной стенки грибов (Bais et al, 2006).
Общее количество флавоноидов в агрономически значимых зерновых культурах (кукуруза, рис, овес, ячмень, пшеница, рожь) не превышает в среднем 1% от сухой массы (Shahidi and Naczk, 2006). Наиболее богатой фла-воновыми веществами зерновой культурой является гречиха: до 1.5% от сухой массы зерна (Oomah and Mazza, 1996). Наиболее распространенными флавоновыми веществами являются кверцетин, кемпферол и их производные (Chen and Geddes, 1945; McMurrough et al, 1983; Shahidi and Naczk, 2006; losQtetal, 2007).
Результаты анализов содержания флавоноидов в почве немногочисленны и противоречивы. Это объясняется тем фактом, что количество флавоно-вых веществ в почве зависит от множества факторов: климат, время года, тип почвы, растительный покров. Однако показано, что в среднем количество флавоноидов в почве не превышает 1 мМ (Gallet and Keller, 1999). Содержание фенольных соединений в почве варьирует от 0.1-0.9% для двудольных растений до 2.4-4.4% для однодольных. Так, например, райграс выделяет в ризосферу большее количество флавоноидов, чем клевер (Whitehead et al, 1979; Phillips et al., 1997; Makoi and Ndakidemi, 2007). Недавно высказано предположение, что количество флавоноидов в экторизосфере выше, что обуславливает аллелопатический эффект некоторых растений (Weston and Mathesius, 2013).
Максимальное содержание флавоноидов в почвах наблюдается в январе, что обусловлено поступлением полифенольных веществ в почву с отмирающими частями растений. В теплое время года повышается активность почвенной микрофлоры, в связи с чем, к сентябрю наблюдается спад и отмечается наименьшее количество веществ флавоновой природы в почве. Резкий спад количества полифенолов связывают также с выщелачиванием и потреблением растениями (Lodhi, 1975; Martin and Heider, 1976; Makoi and Ndakidemi, 2007).
Экскретируемые в почву флавоноиды подвергаются модификации и деградации. Нахождение флавоноидов в почве может продолжаться до 72 часов в зависимости от их структуры (Shaw and Hooker, 2008). Флавоноиды в стерильной почве сохраняются в неизменном количестве дольше, чем в нестерильной, предположительно из-за отсутствия микробной деградации. Активность флавоноидов в почве зависит от условий внешней среды. Они могут адсорбироваться на клеточной стенке растений и микробов или частицах почвы с помощью катион-связывающего сайта, и терять, таким образом, биодоступность (Shaw and Hooker, 2008; Hassan and Mathesius, 2012). В зависимости от модификаций, которые претерпевают флавоноиды, изменяются их физико-химические свойства. Так, например, гликозилирование флавоноидов увеличивает их подвижность и растворимость и, как следствие, биодоступность. Гликозиды флавоноидов быстро деградируются микроорганизмами и экзоферментами растений до их агликонов (Hartwig and Phillips, 1991; Новикова и Сидорова, 2007; Hassan and Mathesius, 2012). Ризобии расщепляют С-кольцо до резорцина, флороглюцинола, кофейной и и-кумаровой кислот. Псевдомонады в ходе метаболизма деградируют флавоноиды до щавелевоук-сусной и пирокатехиновой кислот, расщепляя А-кольцо (Rao and Cooper 1994). Ризобии могут модифицировать флавоноиды, индуцирующие nod-ген, превращая их в более или менее активные формы (Rao and Cooper, 1995).
Изучен путь катаболизма кверцетина у Pseudomonas putida PML2 (Pillai and Swamp, 2002). Кверцетин в ходе трехступенчатого процесса деградиру-ется до флороглюцинола и дигидроксикоричной кислоты, которые далее используются как субстраты и минерализуются в ходе Р-кетоадипинатного пути, широко распространенного среди почвенных микроорганизмов (Harwood and Parales, 1996; Shaw et al., 2006). Конечные продукты распада в ходе микробной деградации будут зависеть от структуры флавоноида. Для бактерий, расщепляющих А-кольцо, при наличии гидроксильной группы в положении 5, конечным продуктом будет резорцин, в случае наличия двух гидроксиль-ных групп в положениях 5 и 7, конечным продуктом будет флороглюцинол (Cooper, 2004).
Выделение углеводсо держащих компонентов внешней мембраны бактерий
Перед проведением анализа клетки отмывали трехкратным центрифугированием при 2800 х g в течение 5 мин, затем ресуспендировали в небольшом количестве дистиллированной воды (электропроводность 1.8 fiS/см). Для устранения конгломератов суспензию клеток вновь центрифугировали при ПО х g в течение 1 мин и использовали суспензию, оставшуюся в надо-садочной жидкости. Затем доводили оптическую плотность D67o подготовленной суспензии для каждого вида использованных микроорганизмов до 0.4-0.42. Измерение ОС клеток проводили при длине волны света 670 нм (относительно вакуума). Объем измерительной ячейки 1 мл. При работе использовали дискретный набор частот ориентирующего электрического поля: 750; 1000; 1450 и 2000 кГц. ОС представлялся в виде частотной зависимости разности значений оптической плотности суспензий SOD, измеренных при распространении пучка неполяризованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля. Эта разность была нормирована на значение оптиче 47 ской плотности при хаотической ориентации клеток (Мирошников и др., 1986; Bunin and Voloshin, 1996).
Бактерии осаждали из культуральной жидкости центрифугированием в течение 30 минут при 3000 х g. Капсулу смывали с поверхности клеток в течение 6 суток 0.15 М раствором NaCl с ежедневной заменой отмывающего раствора. Смытый в течение первых двух дней капсульный материал концентрировали, диализовали против дистиллированной воды через мембраны с пределом исключения 12-14 кДа в течение 48 часов.
Для получения ЛПС экстракцией по методу Вестфаля (Вестфаль и Янн, 1967) бактериальные клетки трижды обрабатывали ацетоном, высушивали на воздухе и измельчали до порошкообразного состояния. Экстракицю проводили при 68-70С в 45%-ном водном растворе фенола в течение 45 минут. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и диализовали 5 суток против проточной воды, концентрировали и освобождали от примесей белков и нуклеиновых кислот, добавлением 40%-ной трихлоруксусной кислоты до рН 2.7 с последующим центрифугированием и повторным диализом. Экстракт концентрировали и лиофилизировали.
ЛПС, выделенные из выращенных в присутствии кверцетина бактериальных клеток, подвергали дополнительной процедуре очистки. К раствору ЛПС(5 мг/мл) приливали НС1 (25%) до конечного значения рН 1.0. Из полученного раствора пятикратным объемом этилацетата экстрагировали модифицированные флавоноиды (Shao et ah, 2005). Водный слой повторно обрабатывали этилацетатом, а органический - водой. Объединенные водные фракции концентрировали, центрифугировали и подвергали гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-50 (Таблица 3). Фракции, выходящие с нулевым объемом колонки и содержащие углеводы, объединяли, концентрировали и лио филизировали.
Для проведения электрофореза ЛПС экстрагировали в соответствии с методикой (Leive et ah, 1968). Бактериальные клетки трехкратно ресуспенди-ровали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (г/л): К2НР04 - 1.24, КН2Р04 -0.39, NaCl - 8.8 - с последующим центрифугированием (13000 х g5 15 мин). Из бактериальной массы экстрагировали ЛПС в течение 15 мин буфером следующего состава: трис 0.1 М, ЭДТА 10 мМ, фенилметилсульфоксид 0.1 мМ (2% раствор в спирте), тритон Х-100 1%, Н20 - до 10 мл, рН 8.05-8.5. Образцы депротеинизировали. Для этого к экстракту добавляли равный объём раствора протеиназы К (1 мг/мл) (Sigma, США), инкубировали 20 минут при 37С, затем 1 час при 60С и центрифугировали 10 минут при 13.000 об/мин.
Разделение смесей гликополимеров проводили гель-фильтрацией на колонках при условиях, указанных в таблице 3. Таблица 3 - Хроматографические колонки и условия разделения препаратов
Название матрицы Размеры колонки,СМХСМ Элюирующий буфер Скоростьэлюции,мл/мин V0, мл
Состав и соотношение ЖК липида А проводили методом ГЖХ метиловых эфиров ЖК (МЭЖК). Метилирование ЖК липида А выполняли согласно методике, описанной в работе (Mayer et al., 1985). Идентифицикацию проводили по эталонным образцам фирмы Sigma (США) в процентах от суммы всех МЭЖК. Программирование температурного режима осуществляли в интервале от 130 до 250С со скоростью нагрева 4С/мин. Температура испарителя 250С, температура детектора 270С, скорость газа-носителя (Не) 1.3 см3/мин; сброс 1:50.
Подготовку образцов нейтральных моносахаридов проводили в соответствии с методикой (Sawadecker et al., 1965). Идентификацию моносахаридов проводили в градиенте температуры от 160 до 290С со скоростью нагрева 7С/мин. Относительное содержание Сахаров определяли по соотношению площадей соответствующих пиков по показаниям прибора.
Определение содержания углеводов в ЛПС проводили по следующей методике: к 0.5 мл раствора, содержащего ЛПС, добавляли 0.5 мл 5% раство 50 pa фенола и 2.5 мл H2S04 КОнц- Оптическую плотность продуктов реакции измеряли при длине волны 490 нм (Dubois et al, 1956). Стандартную кривую строили с применением глюкозы.
Метод основан на окрашивании белка красителем кумасси G-250 и обладает очень высокой чувствительностью; с его помощью можно определить белок в количестве от 0.1 до 0.05 мкг (Bredford, 1976). К 1 мл образца, содержащего до 50 мкг белка, добавляли 1 мл раствора кумасси G-250 в 3% над-хлорной кислоте. Через 30 минут измеряли поглощение при 595 нм. Стандартную кривую строили по бычьему сывороточному альбумину.
Определение КДО проводили по стандартной методике: 6 мг ЛПС растворяли в 3 мл воды, добавляли 0.2 Н H2S04. Реакционную смесь нагревали 30 минут при 100С, затем охлаждали и центрифугировали 5 минут при 13000 об/мин. 0.5 мл надосадочной жидкости переносили в другую пробирку, добавляли 0.25 мл 0.04 М НЮ4 в 0.125 Н H2S04 и оставляли на 20 минут. Затем добавляли 0.25 мл 2.6% раствора NaAs02 в 0.5 Н НС1. Приливали 0.5 мл 0.6% раствора тиобарбитуровой кислоты. Смесь нагревали 15 минут при 100С и добавляли 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Поглощение измеряли при длине волны 548 нм (Karkhanis et al., 1978).
Исследование свойств поверхности азоспирилл, выращенных в присутствии флавоноидов
Концентрации флавоноидов, вызывающие изменения в ЛПС азоспирилл, сопоставимы с литературными данными о содержании отдельных флавоноидов в ризосфере некоторых растений. Так, например, количество катехина вблизи корней Centaurea maculosa составляет 0.39 мг на грамм почвы (Shaw et al., 2006); количество фенольных соединений вблизи корней разных сортов пшеницы достигает 0.1 мг на грамм почвы (Bertin et al., 2003). Также существует предположение, что вблизи корня - в зоне непосредственного контакта микроорганизма и растения - наблюдается наиболее высокая концентрация флавоновых веществ (Hassan and Mathesius, 2012).
Полученные результаты, коррелирующие с литературными данными, свидетельствуют о возможности протекания подобных модификаций глико-полимеров поверхности азоспирилл в условиях in vivo. Модификации состава и структуры гликанов поверхности азоспирилл являются результатом изменения экспрессии генов и, как следствие, изменения метаболизма. Поэтому нами были проведены эксперименты по исследованию электрофоретических профилей белков поверхности бактерий, как индикаторов произошедших изменений на примере A. brasilese SR55 и A. lipoferum Sp59b.
Анализ электрофоретических профилей полипептидов A. brasilese SR55 показал, что под влиянием различных концентраций флавоноидов происходят изменения в составе полипептидов поверхности бактериальной клетки (Рисунок 9). Присутствие в среде флавоноидов приводило к появлению белков с большей молекулярной массой, чем в составе контрольного образца, о чем свидетельствовало наличие полос в области 90 кДа.
Как видно из рисунка 9, различные концентрации флавоноида приводили к изменению пептидных профилей. Наиболее интенсивное накопление разных полипептидных фракций наблюдалось при концентрациях рутина от 31.25 до 500 мкМ. 2 3 4 5 6 7 8 М, кДа
Дальнейшее увеличение содержания рутина в среде культивирования приводило к концентрационно зависимому снижению количества белка.
Результаты исследований белков поверхности A. lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии обоих флавоноидов, также показали появление новых дополнительных фракций и концентрационно зависимое перераспределение полипептидных фракций в электрофоретических профилях. На основании полученных данных электрофоретического анализа углеводных и белковых компонентов поверхности азоспирилл для дальнейшей работы были выбраны эффективные концентрации флавоноидов, которые вызывали изменения биополимеров поверхности бактерий: 1 мМ кверцетина и 0,5 мМ рутина для A. lipoferum Sp59b; 62.5 мкМ кверцетина и 125 мкМ рутина для A. brasilense SR55; 62.5 мкМ кверцетина и 31.25 мкМ рутина для A. brasilense Sp245; 62.5 мкМ для каждого из исследуемых флавоноидов для A. brasilense Sp7.
Исследование свойств поверхности азоспирилл, выращенных в присутствии флавоноидов Выявление под влиянием флавоноидов модификаций электрофоретиче-ских профилей экстрактов ЛПС и белков, которые являются основными компонентами внешней мембраны, позволило предположить наличие изменений физико-химических свойств поверхности этих бактерий.
Была исследована динамика роста и подвижность микроорганизмов в присутствии флавоноидов. Методом микроскопии в темном поле было выявлено, что присутствие в среде выращивания флавоноидов не влияло на подвижность бактерий.
Состав и структура представленных на поверхности бактерий полимеров может изменяться в зависимости от возраста культуры (Del Gallo and Haegi, 1990; Dufrene and Rouxhet, 1996). При анализе кривых роста исследуемых штаммов, выращиваемых в присутствии эффективных концентраций флавоноидов, установлено, что задержки роста под влиянием флавоноидов не происходит (Рисунок 10). Это свидетельствует о том, что контрольные и опытные культуры находятся на одной фазе роста.
Для оценки влияния флавоноидов на микробные клетки нами был использован метод электрооптического (ЭО) анализа клеточных суспензий. 2-.
Проведенные ранее эксперименты с различными бактериальными культурами и действующими агентами (лектины, антитела, антибиотики, ксенобиотики, бактериофаги) показали, что варьирование величины электрооптической экстинкции (ЭОЭ) происходит только при специфическом взаимодействии этих веществ с клетками (Bunin and Voloshin, 1996; Гулий и др., 2008). Исследование ЭО свойств клеток, выращенных в присутствии флавоноидов, может дать возможность не только выявить сам факт влияния флавоноидов на поверхность микроорганизмов, но и по уровню изменения величины ЭО параметров количественно оценить воздействие флавоноидов на бактериальные клетки.
Поскольку все биологические объекты несут заряды, при наложении электрического поля происходит электрическая поляризация клеточных структур. В образование индуцированного диполя под воздействием ориентирующего поля вносят вклад различные компоненты клетки. Использование ориентирующих спектров, полученных в диапазоне частот: 740, 1000, 1450, 2000, 2800 кГц - обусловлено тем, что при этом основной вклад в образование диполя вносят макромолекулы, экспонированные во внешнее пространство, а также структурные компоненты внешней мембраны.
Эксперименты показали, что в исследуемом диапазоне частот регистрируются достоверные изменения величины ЭО сигнала суспензий клеток всех исследуемых нами бактериальных культур после выращивания в присутствии флавоноидов (Рисунок 11).
Для удобства представления экспериментальных данных была использована величина ЭО сигнала при частоте ориентирующего поля 1000 кГц. Как видно из рисунка 11, наибольшие изменения наблюдались при культивировании штамма A. brasilense Sp7 (Рисунок 11). При выращивании данной культуры в присутствии кверцетина и рутина обнаружено снижение величины ЭО сигнала суспензии клеток на 35 и 65% соответственно. Это свидетельствует об изменении величины заряда поверхности клеток, который обусловлен особенностями состава и структуры, представленных на поверхности полимеров. Тестирование изменений антигенных свойств бактерий, культивируемых в присутствии кверцетина, проводили методом иммунодота и ИФА с использованием поликлональных кроличьих Ат к ЛПС внешней мембраны исследуемых бактерий. Анализ антигенных свойств экстрактов бактерий A. lipoferum Sp59b проводили с Ат как к ЛПС (Атлпс), так и к ЛПБК (АТЛПБК) данной культуры.
Исследования показали, что ЛПС интактной культуры A. lipoferum Sp59b (7ITICsp59b), используемый нами в качестве препарата сравнения, взаимодействовал только с Атдпс данного штамма (Рисунок 12), что согласуется с выявленными ранее отличиями в структуре мембранных и капсульных глико-полимеров A. lipoferum Sp59b (Смолькина и др., 2010). В то же время Атдпс A. lipoferum Sp59b проявляли низкий уровень сродства к препарату ЛПС культуры, выращенной в присутствии флавоноида (7inCsP59b+Q), в отличие от Атлшк, которые позволили его визуализировать. Это может свидетельствовать об изменении структуры экспонированных в окружающую среду О-анти-генов бактерий как результат действия кверцетина.
Исследование структуры О-специфических полисахаридов и состава капсульных полисахаридов бактерий A. lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии кверцетина
В образцах JIIICSRSS+R И JIQCSRSS+Q наблюдалось увеличение количества 3-ОН-С14:0 и 3-ОН-С16:0 кислот, а также снижение количества кислоты С 18:1. Более выраженные изменения в составе ЖК JIIICSRSS происходили при выращивании бактерий в присутствии рутина.
Преобладающими во всех экспериментальных образцах оказались 3-гидроксиалкановые кислоты. Их доля составила 55-65% от общего количества идентифицированных в составе липида А кислот, что коррелирует с литературными данными о содержании гидроксикислот в липиде А грамотри-цательных бактерий (Красикова и др., 1989; Игнатов и др., 2009).
Суммарное содержание других идентифицированных ЖК, которые не представлены в таблице (ундекановая, тетрадекановая, октадекановая), не превышало 5% от общего количества ЖК. Так как доля каждой из них не превышает 1%, высока вероятность того, что они входят в состав фосфоли-пидов внешней мембраны и экстрагируются вместе с ЛПС.
Исследование структуры О-специфических полисахаридов и состава капсульных полисахаридов бактерий A. lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии кверцетина OnCSp59b+Q получали мягкой кислотной деградацией с последующей гель-хроматографией продуктов на колонке с Sephadex G-50.
Исследование методом ГЖХ ацетатов полиолов и (R)-2-октилгликозидов, полученных после полного гидролиза, показало, что ОП-CsP59b+Q состоит из L-Rha и D-Glc, находящихся в соотношении 2.7 : 1. Анализ ГЖХ-МС частично метилированных ацетатов полиолов позволил идентифицировать в его составе \,5-ди-0-аптш1-2,Ъ,А,6-тетра-0-метилглюцитол, 1,2,3,5- е /?а-0-ацетил-4-0-метилрамнитол и 1,3,5-три-О-ацетил-2,4-ди-(9-метилрамнитол. Таким образом, повторяющиеся звенья OnCsP59b+Q построены из остатков 3-замещенной Rha, 2,3-дизамещенной Rha в точке ветвления и терминального остатка Glc, что существенно отличается от состава ОПС бактерий штамма Sp59b, выращенных без кверцетина (Смолькина и др., 2010), но совпадает с составом их КПС. 13С-ЯМР спектр OnCSp59b+Q (Рисунок 21) содержал сигналы различной интенсивности, что, вероятно, обусловлено их нестехиометрическим О-ацетилированием, что подтверждалось наличием сигнала СН3 О-ацетильной группы при 21,8 м.д. Для доказательства этого предположения OnCSp59b+Q был О-дезацетилирован обработкой NH4OH и полученный полисахарид был исследован методами ЯМР-спектроскопии.
В С-ЯМР спектре присутствовали сигналы четырех аномерных атомов углерода при 102.5-105.1 м.д., 17 атомов углерода моносахаридных циклов в области 62.8-81.3 м.д., а также трех метальных групп (С-6 Rha при 18 м.д.). Отсутствие сигналов в области 82-88 м.д., характерных для фуранозидов, свидетельствовало о том, что все остатки моносахаридов находятся в пи-ранозной форме. Соответственно, в спектре -ЯМР присутствовали сигналы четырех аномерных протонов при 4.67-5.15 м.д., а также сигналы группы протонов моносахаридных остатков при 3.35-4.49 м.д. и трех СН3-групп рамноз при 1.27-1.33 м.д. Таким образом, 13С и !Н ЯМР спектры OiTCSp59b+Q были идентичны таковым для капсульного полисахарида этих микроорганизмов (Смолькина и др., 2010), а, следовательно, и структуры их повторяющихся звеньев совпадали, что хорошо коррелирует с результатами иммуно-дота ЭДТА-экстрактов ЛПС (Рисунок 12).
В литературе в настоящее время имеется большое количество данных о наличии Rha в составе полисахаридсодержащих полимеров поверхности бактерий, вступающих в различные взаимоотношения с корнями растений (Gaur et al, 1998; Molinaro et al, 2003; Здоровенко и др., 2007). В частности, для ризобий показано, что флавоноиды растения-хозяина индуцируют синтез бактериями ЛПС, отличных по степени полимеризации О-цепи с повторяющимся звеном, представленным рамнаном (Broughton et al., 2006).
Основной стратегией поведения азоспирилл в отличие от ризобий является колонизация поверхности корня, однако в состав гликополимеров их поверхности также входит D- и L-Rha, что может указывать на тот факт, что этот моносахарид играет важную роль при формировании растительно-микробных симбиозов и ассоциаций. Также показано, что дезоксисахара, входящие в состав гликанов бактерий, повышают гидрофобность поверхности, что способствует адсорбции бактерий на поверхности корня. Установлено, что под влиянием ЛПС A. brasilense Sp245, повторяющееся звено которого представлено линейным пентарамнаном, наблюдается усиление синтеза белков апопласта пшеницы, что указывает на участие ЛПС в установлении взаимодействия между растением и микроорганизмом (Ignatov et al., 1995; Магогаеґйг/., 1995).
В свою очередь, анализ моносахаридого состава KQCSp59b+Q выявил присутствие значительного количества D-Gal (Рисунок 22), в отличие от состава препарата КПС, представленного глюкорамнаном с соотношением компонентов 1 : 3 (Смолькина и др., 2010). По результатам ГЖХ количество D-Gal приблизительно равно содержанию D-Glc.
Возрастание доли Gal (на 40% от контрольного значения) ранее показано для ЭПС A. brasilense Cd, выращенных в присутствии корневых экссудатов пшеницы. Более значительное возрастание количества Gal в составе ЭПС этих бактерий (в 8 раз относительно контрольного значения) наблюдалось при выращивании их в условиях «солевого стресса» при повышенном содержании NaCl в среде культивирования (Fischer et al., 2003; Nagarajan et al., 2007).
