Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
Краткая характеристика цитохромов Р45 0 7
Суперсемейство цитохромов Р45 0 7
Подсемейство цитохромов Р450 2В 9
Анализ кристаллической структуры CYP2B4 10
«Открытая» конформация CYP2B4 10
«Закрытая» конформация CYP2B4 14
Предпосылки к моделированию пространственной структуры Р450 17
Методы моделирования цитохромов Р450 20
Цели и задачи молекулярного моделирования Р450 20
Основные этапы моделирования пространственной структуры белка погомологии 21
Проблемы моделирования Р45 0 по гомологии 24
Критерии оценки успешного моделирования Р450 по гомологии 28
Методы проверки правильности моделей Р450 30
Объекты и методы 34
Аппаратное обеспечение...ГГ. 34
Программное обеспечение 34
Информационные ресурсы 34
Сравнение кристаллических структур CYP2B4 из PDB 36
Моделирование пространственной структуры цитохрома CYP2B4 37
Уточнение модели CYP2B4 38
Верификация модели CYP2B4 40
Моделирование известных мутантов CYP2B4 41
Моделирование новых мутаций CYP2B4 43
Результаты и обсуждение 45
Анализ существующих кристаллических структур CYP2B4 45
Компьютерное моделирование трехмерной структуры CYP2B4 по гомологии 50
Моделирование трехмерной структуры CYP2B4 по гомологии 50
Верификация модели трехмерной структуры CYP2B4 53
Сравнение модели с «закрытой» конформацией CYP2B4 57
Сравнительное моделирование пространственных структур микросомальных
цитохромов Р450 62
Модели трехмерной структуры CYP2B4 62
Модели трехмерной структуры представителей CYP2C 64
Модели трехмерной структуры CYP3A4 67
Выявление общих закономерностей среди моделей 69
Оценка возможных перспектив по моделированию цитохромов Р450 по
существующим прототипам 74
Прогнозирование изменения сродства CYP2B4 к цитохром Р450 редуктазе при точеном мутагенезе , 77
Заключение 81
Выводы 83
Список литературы 84
- «Открытая» конформация CYP2B4
- Проблемы моделирования Р45 0 по гомологии
- Моделирование известных мутантов CYP2B4
- Анализ существующих кристаллических структур CYP2B4
Введение к работе
Цитохромы Р450 (Р450) - ферменты, присущие почти всем живым существам и окисляющие как эндогенные, так и экзогенные низкомолекулярные органические соединения, работающие в сложном взаимодействии с другими белками в рамках монооксигеназных систем. Отличительной особенностью Р450 является многообразие молекулярных механизмов функционирования. Кроме того, широкая субстратная специфичность и перекрестная стереоселективность между семействами затрудняют детальное изучение механизмов функционирования этих ферментов. Одной из причин трудностей изучения механизмов функционирования является отсутствие данных о структуре большинства Р450.
В последние годы в связи с развитием вычислительных и биоинформмационных технологий экспериментальное изучение подобных систем всё чаще дополняется вычислительным экспериментом, оперирующим виртуальными моделями белков. Применение методов компьютерного моделирования помогает понять механизмы работы ферментов и планировать экспериментальную работу наиболее рациональным способом. Ранее неоднократно проводились работы по моделированию пространственной структуры Р450 и их взаимодействия с лигандами, исследовалась субстратная специфичность, поиск потенциальных ингибиторов. Работы выполнялись как с белками с известной трехмерной структурой, так и с виртуальными моделями, построенными на основании сходства с известными Р450. Исследование взаимодействия Р450 с белками партнерами требует создания более точных моделей, а так же их надежной верификации. В первую очередь это касается укладки поверхностных наиболее вариабельных участков белковой глобулы. Сложившаяся в последние годы ситуация с пополнением белкового банка Protein Data Bank (PDB) структурами P450 (как бактериальных, так и микросомальных) позволяет по-новому взглянуть на проблему моделирования трехмерной структуры Р450. В настоящей работе сделана попытка анализа известных структур микросомальных Р450, выявления их особенностей и границ применения для них метода моделирования по гомологии.
Наличие в мировой научной литературе данных о поверхностных мутациях CYP2B4 и влиянии их на взаимодействие с редокс-партнерами, определило выбор данного белка как рабочего молекулярного объекта для построения для моделирования и построения регрессионных уравнений, использование которых позволило бы планировать эксперимент по изменению свойств фермента заданным образом.
Цель работы
Оценка границ применимости метода моделирования пространственной структуры цитохромов Р450 по гомологии и использования моделей для прогноза изменения свойств поверхности белков на примере CYP2B4.
Основные задачи
Создать компьютерную модель пространственной структуры CYP2B4 кролика и проверить ее соответствие экспериментальным данным;
Оценить границы применимости метода моделирования пространственной структуры белков по гомологии на примере 2-го и 3-го семейств цитохромов Р450;
Создать модели мутантов CYP2B4 кролика с известными значениями JQ комплексов с цитохром Р450-редуктазой для оценки влияния точечных замен на изменение свойств поверхности ;
Разработать корреляционные уравнения, позволяющие предсказывать влияние генетических модификаций аминокислотной последовательности CYP2B4 на сродство к цитохром Р450-редуктазе;
Провести поиск новых генетических модификаций, которые могут влиять на сродство CYP2B4 к цитохром Р450-редуктазе.
В результате выполнения работы впервые осуществлен систематический анализ результатов молекулярного моделирования по гомологии при использовании в качестве прототипов Р450 с разной степенью идентичности путем их сопоставления с рентгенострукгурными данными о пространственной структуре микросомального CYP2B4. Удалось выявить области систематических расхождений (N-концевой фрагмент, свободные петли между а-спиралями В, В', С и D, сегмент F-G и р-тяж на С-конце), которые одновременно являются наиболее подвижными в белковой глобуле по данным молекулярной динамики и анализа температурного фактора. Показано, что при моделировании CYP2C5, CYP2C8 и CYP2C9 выбор прототипа в пределах данного подсемейства слабо влияет на характеристики конечной модели.
Впервые показана возможность построения непротиворечивых регрессионных уравнений, описывающих влияние точечных замен на сродство CYP2B4 к цитохром Р450 редуктазе.
«Открытая» конформация CYP2B4
В 2003 году была получена первая пространственная структура CYP2B4 (индекс PDB 1Р05) [Scott Е.Е. at al 2003]. Для получения водорастворимой формы CYP2B4 с целью последующей кристаллизации у природного белка был удален мембранный домен (ЛЗ-21) и заменены 8 N-концевых аминокислотных остатков (Е2А, G22K, Н23К, Р24Т, K25S, A26S, Н27К, R29K). Метод выделения и очистки модифицированного белка, сходный с методом, примененным ранее для очистки CYP2C5 [Wester M.R. et al, 2003], позволил получить кристаллы белка. Трехмерная структура была установлена с разрешением 1,6 Л с использованием замен па основе структуры CYP2C5 (индекс PDB 1N6B) [Wester M.R. et al, 2003]. Формирование открытой «впадины» CYP2B4 (IPOS)
CYP2B4 был закристаллизован в виде димера, что является характерной особенностью данной структуры. Вследствие этого между а- и р-домєнами возникает открытая гидрофобная «впадина» (рисунок 2А). Протяженный мотив, содержащий гидрофобные спирали F и G одной молекулы, частично занимает гидрофобную «впадину» второй молекулы. Между His226 одной молекулы и атомом железа гема другой образована межмолекулярная координационная связь. Таким образом, с помощью остатков Ser213yr230 в димере сформирована закрытая гидрофобная поверхность межмолекулярного взаимодействия.
Впадина глубиной около 15 А сформирована спиралями F, F , G и G с одной стороны и спиралями В и С и петлями между ними с другой стороны. Перемещение консервативных элементов вторичной структуры, приводящее к образованию открытой «впадины», не нарушает общей архитектуры фолда Р450, демонстрируемой как растворимыми бактериальными цитохромами, так и микросомальным CYP2C5. Сопоставление пространственной структуры CYP2B4 с известными структурами Р450 подтверждает ее наибольшее сходство с CYP2C5 (рисунок 2Б). Основные различия структур CYP2C5 и CYP2B4 описаны в спиралях и петлях, образующих «впадину» последнего. «Впадина», подобная имеющейся в CYP2B4, наблюдается так же в структуре бактериального CYP154C1 из Streptomyces coelicolor A3 (2) (рисунок ЗА) [PodustL.M .et ей., 2003]. Обе впадины возникают в результате контакта между остатками спиралей В и G. Большая глубина «впадины» у CYP2B4 по сравнению с CYP154C1 (около 10 А), по-видимому, связана с большей длиной петли между спиралями F и G. Не смотря на то, что в строении спиралей F, F и G у CYP2C5 и CYP2B4 наблюдается много различий (рисунок ЗБ), в целом единая пространственная структура сохраняется. В CYP2B4 остатки спиралей F и G отгибаются от спирали В и образуют «крышу» активного центра. Кроме того, G спираль в CYP2B4 расположена почти перпендикулярно к плоскости гема, в то время как в CYP2C5 поднимается под меньшим углом (рисунок ЗБ). Остатки спиралей F , G и G изолируют активный центр CYP2C5 с незначительным количеством воды внутри так, что взаимодействие с ним возможно только через узкий канал, определяемый размерами и формой связываемого лиганда. Таким образом, структуры CYP2B4 (1Р05) и CYP2C5(1DT6) представляют собой принципиально различающиеся «открытую» и «закрытую» конформации Р450 эукариот.
Дно «впадины» CYP2B4 сформировано спиралью С и предшествующей ей петлей. Общие для всех Р450 вторичные структуры (в том числе, спирали В и С) сохраняются. Тем не менее, имеются значительные различия в третичной структуре вследствие расположения спиралей В и С и взаимного влияния свободных петель (рисунок ЗБ). В CYP2B4 спираль В , которая почти перпендикулярна к плоскости гема и занимает пространство, занятое в CYP2C5 спиралью F, взаимодействует с N-концевыми структурами. В CYP2C5 спираль В ориентирована под углом примерно 45 к плоскости гема и взаимодействует с остатками спиралей G и F через одиночные вандерваальсовы контакты. Свободная петля между спиралями В и С имеет вытянутую форму как в CYP2C5, так и в CYP2B4, и представляет собой один из участков с наибольшим значением температурного В-фактора, что свидетельствует о повышенной подвижности данного участка. В «открытой» конформации CYP2B4 изменение положения спиралей С и G приводит к снижению компактности глобулы белка и значительному увеличению доступной для растворителя гидрофобной поверхности, что, по-видимому, способствует спонтанной димеризации белка в растворе.
Пространственная ориентация гема и спиралей I и L строго консервативна у всех представителей суперемейства Р450. Эти элементы вторичной структуры не заменимы при образовании активных форм кислорода на 6-ой координационной связи железа гема. Сравнение структур CYP2B4 и CYP2C5 выявило различия во взаимодействии отдельных аминокислотных остатков и гема в результате изменения положения спирали С. Кроме того, спираль I в структуре CYP2B4 демонстрирует отчетливый изгиб около гема, аналогичный изгибу спирали І, в комплексах бактериальных цитохромов с азолами.
Особенно это характерно для CYP51 [Podust L.M. et ah, 2001], Меньший изгиб был выявлен в спирали I у CYP2C5 в комплексе с лигандом [Wester M.R. el ah, 2003]. Взаимодействие CYP2B4 (IPOS) средокс партнерами и лигандами
Обилие данных о поверхностных мутациях белков семейства 2В, а также данных о структуре CYP2C5 и бактериальных Р450 позволило авторам кристаллической структуры CYP2B4 предположить, что описываемый белок формирует так же и «закрытую» конформацию. Это предположение было подтверждено позже с получением второй структуры CYP2B4 (индекс PDB 1SUO) [Scott Е.Е. et ah, 2004]. Известно, что изменение положения спирали С в «открытой» конформации CYP2B4 меняет аминокислотный состав вероятного места взаимодействия с P450R и Cyt b$ [Bridges A. et ah, 1998]. Проксимальная поверхность Р450 демонстрирует сильный положительный электростатический потенциал в районе спирали С и примыкающей простетической группы. По сравнению с CYP2C5 перемещение спирали С в CYP2B4 незначительно уменьшает положительный электростатический потенциал на проксимальной поверхности, взаимодействующей с отрицательно заряженной поверхностью цитохром P450R и/или Cyt Ь$. Однако, в «открытой» конформации остатки Argl22 и Phel26 спирали С, участвующие в связывании CYP2B4 с редокс партнерами [Bridges A. et ah, 1998], значительно смещены по сравнению с «закрытой» конформацней CYP2C5. Кроме того, экспериментально показано, что остатки С-конца спирали С или между спиралями С и D, участвующие в связывании редокс партнеров (Argl33, Phel35, Metl37 и Lysl39), формируют компактную петлю в «закрытой» конформации CYP2C5. Положение спирали С в «закрытой» конформации CYP2B4 [Scott Е.Е. et ah, 2004] сходно с положением в структуре батериального CYP102, полученного в комплексе с редокс-партнерами на проксимальной поверхности. Авторы кристалла предположили, что «закрытая» конформация CYP2B4 взаимодействует преимущественно с P450R.
Проблемы моделирования Р45 0 по гомологии
Непростой сам по себе этап моделирования свободных петель значительно усложняется из-за уменьшения числа и длины SCR, что приводит к необходимости моделирования чрезмерно длинных петель. Анализ найденных в белках из PDB различных фрагментов требует дополнительной экспертной оценки, основанной на экспериментальных данных о структурных особенностях Р450, учете расположения и взаимного влияния петель друг на друга. В настоящее время появилась возможность построения участков петель с помощью методов моделирования структуры белка de novo, основанных на выборе подходящего варианта петли среди набора случайно построенных конформаций с учетом расчетных энергетических параметров [Huang X., 1994]. Однако данный подход также требует тщательной экспертной оценки и глубокой оптимизации методами энергетической минимизации и моделирования молекулярной динамики [Koehl P., Levitt М., 1999; Fiser A. et ah, 2000; Das В., Meirovitch H, 2001]. Моделирование мембранного якоря
Проблема моделирования мембранного якоря является, несомненно, самой сложной, Это обусловлено следующими причинами: 1. Среди немногочисленных известных структур мембранных белков (около 30 структур в PDB [Berman Н.М. et ah, 2000]) нет мембранных участков, имеющих высокую гомологию с мембранными якорям Р450. Это связано с трудностями кристаллизации белков, содержащих значительные гидрофобные фрагменты в своем составе. Обычно такие фрагменты удалены исследователями на стадии синтеза белка. Этот факт значительно ограничивает применимость метода моделирования по гомологии для решения данной задачи. 2. Возможно создание «мозаичной» модели мембранного якоря в виде комбинации небольших фрагментов, построенных по гомологии с различными гидрофобными фрагментами из разных белков в PDB (преимущественно фрагменты, расположенные внутри белковых глобул). Однако при этом подходе, как правило, возникает неоднозначность модели, обусловленная различными вариантами комбинирования фрагментов. Т.о. результат моделирования в значительной степени зависит от процедур поиска и выбора гомологичных фрагментов. Получаемые варианты модели являются практически равновероятными и окончательный выбор должен базироваться на сверке модели с экспериментальными данными о мембранной топологии моделируемого Р450. Это могут быть данных о локализации белка в мембране (одностороннее или трансмембранное расположение мембранной части), данные об аминокислотной последовательности мембранного якоря, данные о местах действия протеаз, данные о химических модификациях, результаты точечного мутагенеза и т.д. 3. Конформация боковых групп аминокислотных остатков в мембранном якоре обусловлена их взаимодействием с липидным бислоем. Следовательно, для их корректного моделирования требуется сложная молекулярная система в виде модели фрагмента липидной мембраны, разделяющего две водные фазы. Создание подобных модельных систем представляет собой отдельную сложную задачу, для решения которой требуются специальные программные средства и большие вычислительные мощности. Глубокая оптимизация модели
Первоначально построенная модель является предварительной и содержит много неточностей. Поэтому для получения более реалистичной модели требуется выполнение нескольких этапов ее одоводки» (уточнения). Два первых этапа уточнения- это ликвидация стерических конфликтов и энергетическая оптимизация. В результате получается формально правильная модель, не имеющая грубых ошибок. Однако точность построения поверхностных петель остается довольно низкой. Данная проблема является общей для моделирования различных белков. Считается, что для окончательного уточнения модели необходимо выполнить ее глубокую оптимизацию путем моделирования длительной молекулярной динамики в водном окружении с многократной энергетической оптимизацией. Эти процедуры позволяют получить более стабильную, сбалансированную со средой структуру. Однако существует ряд трудностей. Так как общее число атомов в системе может достигать 105 (с учетом полноатомной модели белка и окружающей ее молекул воды), то для выполнения подобных процедур требуются большие вычислительные мощности и очень много вычислительного времени. В ходе моделирования молекулярной динамики конформация белка удаляется от стартовой (в основном за счет движения петель и их конформационных изменений). Изменения контролируются по средней величине среднеквадратичных отклонений (RMS) позиций Са атомов относительно их стартовых положений. В дальнейшем траектория изменения структуры выходит на плато, что свидетельствует о ее относительной стабилизации, однако наблюдаются тепловые колебательные движения некоторых ее подвижных элементов (преимущественно тех же петель). В результате модель может быть представлена в виде набора равновероятных структур и возникает проблема выбора одной из них в качестве конечной. Необходимо отметить, что остается открытым вопрос об адекватности глубоко оптимизированной модели структуре белка в растворе. В кристалле у белка возникают значительные ограничения для ряда подвижных элементов. Более того, упаковка белка в кристалле может приводить к тому, что некоторые петли принимают позиции и конформации не характерные для них в растворе. Так, в контрольных экспериментах по моделированию молекулярной динамики в водной фазе также наблюдается дрейф, когда в качестве стартовой структуры была взята кристаллическая структура белка из PDB. В тех случаях, когда структуру белка удается исследовать непосредственно в растворе с помощью метода ЯМР, как правило, наблюдается набор структур, отличающихся друг от друга позициями подвижных элементов.
Критерии оценки успешного моделирования Р450 по гомологии Эксперименты CASP В основе Интернет-экспериментов CASP (Critical Assessment of protein Structure Prediction) лежит идея проверки алгоритмов и точности методов молекулярного моделирования структуры белков путем сравнения кристаллических структур с компьютерными моделями одних и тех же белков [CASP experiment, http://predictioncenter.llnl.gov]. Для обеспечения объективности и достоверности экспериментов была предложена следующая схема: 1. экспериментаторы, у которых имеются еще неопубликованные данные о структуре новых белков, информируют об этом других участников эксперимента и размещают описание объектов (название, источник и аминокислотную последовательность белка) в Интернете на сервере организаторов эксперимента; 2. группы ученых, занимающиеся компьютерным моделированием, используя предоставленную информацию о последовательностях, создают компьютерные модели целевых белков и отправляют их на тот же сервер до момента публикации экспериментальных результатов; 3. группа независимых экспертов сравнивает модели целевых белков с экспериментальными данными о трехмерной структуре с использованием набора различных методов проверки и делает заключения.
Моделирование известных мутантов CYP2B4
Проведение молекулярной динамики в воде для мономера, взятого из соответствующего димеру файла 1Р05, продемонстрировало, что элементы вторичной структуры в процессе молекулярной динамики разрушаются. Это может означать, что данная форма не стабильна в водном растворе. Кроме того, в той же работе [Scott Е.Е. et al., 2003] имеется указание, что димерная форма существует не только при кристаллизации, но и в растворе. Димерная форма была реконструирована на основании данных из файла 1Р05 с помощью программы Deep View I Swiss-Pdb Viewer (http://www.expasv.org/spdbv/) и представлена на рисунке 10, Видно, что спирали G, G , F и F одной молекулы мономера располагаются в гидрофобной впадине другой.
В то же время, в данной форме His226 одной молекулы является аксиальным лигандом гема другой (т.е. образует координационную связь с атомом железа), препятствуя возможности проникновения в активный центр CYP2B4 других лигандов. Следовательно, данная форма не может нормально функционировать как цитохром Р450 и быть основой для дальнейших вычислительных экспериментов.
Пространственная структура «закрытой» конформации CYP2B41SUO в мономерной форме [Scott Е.Е. et ah, 2004] получена в комплексе с неспецифическим ингибитором Р450. Для сравнения «открытой» и «закрытой» конформации было выполнено их пространственное выравнивание, результаты которого представлены на рисунках 9 и 11. В данном примере использованы два способа выравнивания. Первый способ - общее выравнивание по всем идентичным аминокислотным остаткам (в случае одинаковых последовательностей просто по всем). Данный способ наиболее распространен в различных молекулярно-графических программах. Второй способ -выравнивание только по структурно-консервативным фрагментам. В случае обсуждаемых белков наиболее консервативными (в контексте пространственной укладки) участками являются аминокислотные остатки, отвечающие за формирование спиралей I, J и L и гем-пептида. В дальнейшей работе использовался именно второй способ выравнивания.
В случае сравнения двух форм CYP2B4 наибольшие различия обнаруживаются в областях, отвечающих за формирование вторичных элементов, находящихся на N-конце, формирующих сегмент FG, свободную петлю и спираль Н, а так же фрагмент Р-листа на С-конце.
Следует отметить, что аминокислотные последовательности обоих кристаллизованных белков отличаются от последовательности природного CYP2B4 на 8 и 9 аминокислотных остатков (соответствующие замены - Е2А, G22K, Н23К, Р24Т, K25S, A26S, Н27К, R29K и для мономерной формы H226Y). Модификация была проведена в основном с целью увеличения гидрофильности молекулы и во втором случае для снятия эффекта стабилизации димера за счёт функционирования His226 как аксиального лиганда гема. Кроме того, несколько отличались условия кристаллизации. Всё это, несомненно, повлияло на формирование элементов пространственной структуры.
В связи с вышесказанным, встаёт вопрос о соответствии пространственной структуры описанных форм структуре природного CYP2B4. Однозначного и должным образом аргументированного ответа нет, хотя из общих соображений они могут и должны различаться. Известно, что отличия в аминокислотных последовательностях CYP2B4 значительно варьируются (таблица 6). Например, CYP2B4 отличается от CYP2B5 кролика на 9/10/13 аминокислотных остатков, а от CYP2B6 человека на 35 аминокислотных остатков. В тоже время, последовательности нескольких форм CYP2B4 (CYP2B4B2 и CYP2B4B1) отличаются друг от друга на 6 аминокислотных остатков, т.е. на число остатков меньшее, чем в модифицированном CYP2B4. Следовательно, природный и модифицированный белки можно рассматривать, как разных представителей одного подсемейства, возможно, с разной пространственной структурой. Аналогичная вариабельность характерна (часто в большей степени) и для других семейств Р450, например, для 2С (таблица 7).
Следует также отметить, что ранее было экспериментально показано, что замена Н226А приводит к нарушению функционирования комплекса P450/P450R [LehnererM. et al., 2000]. По-видимому, этот остаток в числе других обеспечивает взаимодействие CYP2B4 с P450R за счет гидрофобных и электростатических сил и, предположительно, участвует в переносе электрона. Разумно предположить, что замена H226Y также вызовет изменения в функционировании комплекса P450/P450R.
Таким образом, встаёт вопрос о создании модели пространственной структуры CYP2B4, как средства для проведения дальнейших вычислительных экспериментов. Основное внимание следует уделить верификации модели и выявлению ограничений ее применения.
Компьютерное моделирование трехмерной структуры CYP2B4 по гомологии Моделирование трехмерной структуры CYP2B4 по гомологии
Создание трехмерной структуры CYP2B4 проводилось методом моделирования по гомологии. В качестве прототипа использовался CYP2C5 (код в PDB 1DT6). При выравнивании последовательностей CYP2C5 и CYP2B4 с помощью программы Composer, в CYP2B4 были выявлены 16 участков, определенные как структурно консервативные (SCR) (рисунок 12). Высокая степень идентичности последовательностей (51,0%) определяла значительную протяженность SCR, которые включали основные структурные элементы (сс-спирали и р-слои), характерные для всех Р450 [Ravichandran K.G. et al, 1993]. Следует отметить, что значительная часть N-концевой области также оказалась в составе SCR1 и SCR2 (рисунок 12), что не могло быть достигнуто ранее при использовании бактериальных Р450 в качестве белков-прототипов [Szklarz G.D. et al, 1995; IvanovA.S. et al, 1996]. Координаты Са-атомов для построения структурно-консервативной части модели CYP2B4 были взяты из гомологичных участков CYP2C5.
Большая протяженность SCR естественным образом имела своим следствием малую протяженность структурно-вариабельных участков (SVR) последовательности CYP2B4, не вошедших в состав SCR (длина SVR не превышала 30 остатков, для сравнения при моделировании на основе бактериальных Р450 максимально возможная длинна SVR 50-70 остатков). К тому же моделирование наи-более протяжённых SVR4 и SVR12 на участках Gln91-Argl20 (30 остатков) и Phe365-Leu392 (27 остатков) не вызвало затруднений, т.к. степень идентичности была достаточной для использования CYP2C5 в качестве источника трехмерных координат.
Анализ существующих кристаллических структур CYP2B4
Как уже отмечалось выше, использование в качестве прототипов для моделирования по гомологии белков из других семейств, вероятно, даёт спорный результат, хотя совершенно необязательно ошибочный. В любом случае, достоверность такого моделирования не может быть подтверждена объективными показателями, и использование таких моделей может быть рекомендовано только в случае их строгого соответствия экспериментальным данным о структурно-функциональных особенностях белков. В тоже время, использование в качестве прототипов белков из того же семейства даст сходные результаты с моделированием по представителям подсемейств. Однако, деление цитохромов Р450 на семейства и подсемейства, имеющее в основе своей сходство последовательностей, часто условно [Archakov АЛ., Degtyarenko K.N., 1993; Лисица А.В., 2002], а разброс идентичности в пределах подсемейств достаточно велик. Это было продемонстрировано расчетом идентичности при по парном выравнивании внутри подсемейств CYP2B и CYP2C (таблицы 6 и 7). Ранее было предложено проводить предварительную оценку не по идентичности, а используя расчет параметра значимости (X) при парном выравнивании. С помощью этого параметра была проведена оценка перспектив моделирования различных подсемейств цитохромов Р450 (таблица 14). Данные оценки моделирования на основе гомологии показывают, что для достижения удовлетворительного качества моделей микрососмальных Р450 в качестве белков-прототипов можно рекомендовать только микросомальные. Среди бактериальных цитохромов Р450 в основном прослеживается та же тенденция, но для них это правило не абсолютно. Прогнозирование изменения сродства CYP264 к цитохром Р450 редуктазе при точеном мутагенезе.
Для подбора корреляционных уравнений требовалось сначала рассчитать изменения параметров молекул при виртуальном точечном мутагенезе. Значения констант диссоциации комплексов с P450R для мутантаых CYP2B4 приведены в таблице 5 раздела «Материалы и методы». Следует отметить, что большинство представленных в таблице аминокислотных остатков находится вне описанных выше участков сомнительной достоверности и локализуются относительно компактно на поверхности CYP2B4 (рисунок 29). На основе полученной модели CYP2B4, используя виртуальные замены боковых радикалов соответсвующих аминокислотных остатков, были построены модели 14 мутантных белков CYP2B4 (R122A, R126A, R133A, F135A, М137А, К139А, К433А, R443A, R422A, F115A, Y190A, К276А, Н226А, Н335А, К421А, Y484A). Каждая модель пространственной структуры была оптимизирована с помощью молекулярной динамики в водном о кружении и последующей минимизацией потенциальной энергии. Учитывая, что исходная модель была подвергнута длительной молекулярной динамике, а как было известно из работы Bridges A. et al., 1998, описываемые точечные замены аминокислот не вызывают существенной перестройки структуры молекулы CYP2B4, процедура молекулярной динамики была сокращена до 10 пс (постоянная величина давления и температуры системы). Контроль на наличие стерических конфликтов и «непротиворечивости» укладки шёл на всех этапах при помощи модуля Protable (Sybyl, Tripos Inc.). Грубых ошибок выявлено не было. Таким образом, было получено 15 молекул, параметры которых, можно было использовать для построения регрессионных уравнений.
При подборе независимых переменных для всех молекул были проанализированы молекулярные поверхности доступные для растворителя (модуль MolCAD, Sybyl, Tripos Inc.) и рассчитаны интегральные молекулярные параметры липофильности и электростатики, описывающие изменение поверхностных свойств молекул белка. Для данных параметров рассматривались различные варианты, более подробно описанные в главе материалы и методы. Анализ полученных данных позволил выявить взаимосвязь между различными комбинациями расчетных параметров и константой диссоциации Kd (точнее величиной LKD). Из полученных уравнений следовало, что наибольший вклад в изменение Kj вносят изменения интегральных характеристик «липофильности» поверхности. Полученные уравнения внутренне согласованы и имеют хорошие параметры предсказания при процедуре скользящего контроля (рисунок 30, таблица 15). Следующим этапом стало предсказание точечных замен в аминокислотной последовательности CYP2B4, которые позволили бы изменять сродство белка к редуктазе заданным образом, например, увеличить. С этой целью было отобрано 38 аминокислотных остатков, расположенных поблизости от остатков, влияющих на связывание белка с редуктазой. Замены данных аминокислотных остатков были выполнены по схеме, представленной в таблице 5, их расположение на поверхности молекулы выделено на рисунке 29 желтым цветом. Всего было построено 94 мутантных CYP2B4. Моделирование, контроль качества и расчет параметров проводился аналогично мутантам из обучающей выборки. Оценка LKD проводилась по всем трём уравнениям, за результат принималось среднее, отклонения по предсказаниям обычно различались незначительно, что естественно, учитывая то, что уравнения построены на одних и тех же параметрах.
Анализ полученных значений LKD позволил выделить 18 аминокислотных остатков, изменение которых могут быть рекомендованы для экспериментальной проверки их влияния на сродство CYP2B4 к P450R, в том числе 8 замен для 3 остатков предположительно увеличивающих аффинность. Предлагаемые замены можно разделить на 3 группы (таблица 16). К первой группе относятся остатки, все замены которых могут приводить к значительному увеличению величины LKD или отрицательному влиянию на взаимодействие между CYP2B4 и P450R. Ко второй, остатки, замена которых также может снижать аффинность, но степень изменений зависит от типа замены. И, наконец, третью группу образуют уже упомянутые 8 замен увеличивающие аффинность. Локализация остатков на поверхности белка представлена на рисунке 31. Структурно аминокислотные остатки, с предсказанным значительным влиянием на аффиность CYP2B4 к редуктазе входят в состав спиралей В , С и D, а так же гем-пептида.
