Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы: 7
2.1. Структуры и функции МАО АиБ 8
2.2. Субстраты и ингибиторы МАО 15
Субстраты 15
Ингибиторы 15
2.3. Компьютерные методы моделирования 22
Прямые методы конструирования лекарств 22
Непрямые методы конструирования лекарств 25
Применение компьютерных методов для моделирования лигандов 30
3 Объекты и методы 32
Объекты 32
Методы 32
4. Результаты 40
4.1. Построение 3D-QSAR и CoMFA моделей активных центров МАО АиБ . 40
4.2. Моделирование полости активного центра фермента 65
4.3. Поиск потенциальных ингибиторов МАО А методом молекулярного докинга в базе данных низкомолекулярных веществ 92
Обсуждение результатов 97
Выводы 104
Список литературы 105
- Структуры и функции МАО АиБ
- Построение 3D-QSAR и CoMFA моделей активных центров МАО АиБ
- Моделирование полости активного центра фермента
- Поиск потенциальных ингибиторов МАО А методом молекулярного докинга в базе данных низкомолекулярных веществ
Структуры и функции МАО АиБ
Моноаминоксидазы типа А и Б млекопитающих являются интегральными белками внешней мембраны митохондрий. Встраивание МАО Б в мембрану происходит по АТФ-зависимому механизму (Cesura, Pletscher, 1992). Известно, что МАО связывается с мембраной С-концевым доменом, который содержит гидрофобную область, примыкающую к положительно заряженным аминокислотам. В мембране МАО существует в виде димера, но для проявления активности in vitro достаточно наличия одной субъединицы (Cesura, Pletscher, 1992).
Моноаминоксидаза довольно широко представлена во многих тканях нервной системы и периферических органов. В одних тканях присутствуют обе формы МАО, а в других преимущественно или только одна форма. Например, человеческая плацента содержит в основном МАО А и незначительное количество МАО Б, лимфоциты и тромбоциты - только МАО Б (табл. 1). Содержание МАО А и Б может варьировать также в тканях одной системы. Так распределение МАО в тканях нервной системы показано в таблице 2. Иммуногистохимические исследования показали, что МАО А в основном локализуется в катехолэргических нейронах, тогда как МАО Б - в серотонинэргических (Kwanetal, 1992).
Сравнение аминокислотных последовательностей обеих форм МАО у различных классов (человек, корова, крыса) показало, что существует более высокая степень гомологии между ферментами одного типа из различных классов млекопитающих, чем у двух форм МАО из одного вида. Например, МАО Б человека и крысы имеют приблизительно 90% идентичных аминокислот, в то время как МАО А и МАО Б человека - только 70% (Powell, 1991).
При сопоставлении аминокислотных последовательностей МАО были обнаружены три высококонсервативные области, в которых идентичные для разных классов организмов аминокислоты, являются функционально важными (Powell, 1991):
1. Область нековалентного связывания ФАД: остатки 15-32 в МАО А и 6-23 в МАО Б у N-конца (так называемый Россмановский фолд) (Wouters, 1998). Эта консервативная область является общей для многих АДФ-, НАД- и ФАД-связывающих доменов различных белков. Она состоит из Р-структуры, а-спиральной последовательности, петли различной длины и второй р-складчатой структуры. Предполагают, что эти Рсф-структуры функционируют как "центры образования" для фолдинга целого домена. Во время синтеза белка этот участок, по-видимому, формируется первым, и последующие полипептидные спирали образуют домен связывания вокруг этого центра (Wierenga et al., 1986).
2. Функции второй консервативной области - остатки 187-228 в МАО А и 178-219 в МАО Б - пока еще не выяснены. Возможно, она принимает участие в формировании активного центра.
3. Область около С-конца: аминокислоты 389-458 в МАО А и 380-449 в МАО Б. Она включает в себя сайт ковалентного связывания кофактора флавина. Место прикрепления ФАД - остаток цистеина в позиции 406 для МАО А и 397 для МАО Б. Обе формы фермента имеют идентичные последовательности аминокислот, непосредственно примыкающих к ковалентно связанному флавину [Ser-Gly-Gly-Cys(FAD)yr] (Powell, 1991).
МАО Б содержит область нековалентного связывания ФАД (аминокислотные остатки 6-34), так называемый динуклеотид связывающий мотив. Особо важным является остаток глутамина (Glu34), расположенный на С-конце второй Р-складки. Этот остаток формирует водородные связи с гидроксигруппой рибозы ФАД (Zhou et al., 1995). Предполагают, что Glu34 необходим для первоначального нековалентного связывания ФАД и передачи его для ковалентного связывания с цистеином (Cys397) (Zhou et al, 1998), а также для поддержания необходимой в процессе окислительно-восстановительного цикла ориентации ФАД (Kwan et al, 1995). В последнее время, сравнивая последовательности с ферментами семейства оксидоредуктаз, эта же группа авторов обнаружила в МАО Б дополнительный ФАД-связывающий регион (остатки 222-227), который является высоко консервативным у различных видов (человек, бык и крыса). Предполагают, что ФАД связывается пошагово во время трансляции и фолдинга белка. На первом этапе Glu34 и тирозин (Туг44) посредством нековалентных связей обеспечивают топологическое размещение ФАДа. Далее ФАД передается в этот консервативный участок, где при помощи глицина (Gly 226) и аспартата (Asp227) обеспечивается последующее расположение ФАДа так, чтобы его 8-сс-метильная группа находилась в непосредственной близости к Cys397 для обеспечения ковалентного связывания (Zhou et al, 1998).
Существует еще один короткий участок (в МАО А он начинается с 438 аминокислотного остатка), который является общим и для других флавопротеинов, таких как НАДФН-цитохром Р-450 оксидоредуктаза и некоторых флаводоксинов, где он связывает фосфатный остаток ФМН. Этот участок консервативен в обеих формах МАО и, по-видимому, так же может взаимодействовать с фосфатной группой кофактора ФАД (Powell, 1991).
Путем создания химерных молекул (одна часть аминокислотной последовательности от МАО А, другая - от МАО Б) были выявлены важные для катализа области, определяющие субстратную и ингибиторную специфичность этих ферментов. Так, было обнаружено, что средняя часть аминокислотных последовательностей (с 220 по 400 остаток) может определять каталитическую активность по отношению к различным субстратам (Tsugeno et al., 1995), а области С-концевых остатков МАО А (402-527) и МАО Б (393-520) являются важными для проявления субстратной специфичности (Chen et al, 1996). Другими авторами было предположено, что домен, ответственный за субстратную специфичность МАО Б находится в области 152-366 аминокислот (Grimsby et al., 1996). Кроме того, было выявлено, что области вблизи N-конца (аминокислоты 1-45 и 1-36 в МАО А и Б, соответственно) хотя и не отвечают за проявление субстратной и ингибиторной специфичности, играют важную роль в катализе (Shih et al., 1998).
В последнее время были предприняты попытки обнаружить ключевые аминокислоты, ответственные за субстратную и ингибиторную специфичность. Путем точечного мутагенеза было обнаружено, что гистидин (His382) и треонин (Thrl58) могут являться остатками, важными в механизме катализа МАО Б (Cesura, 1998). Другими авторами было заявлено, что они обнаружили аминокислоты, ответственные за субстратную специфичность МАО крыс - фенилаланин (Phe208) в МАО А и изолейцин (Пе199) в МАО Б (Tsugeno, Ito, 1997). При замене этих аминокислот путем направленного мутагенеза в одной форме фермента на соответствующую аминокислоту из другой наблюдали изменение субстратной и ингибиторной специфичности мутантных молекул, которые приобретали некоторые свойства противоположного типа МАО (Tsugeno, Ito, 1997). Но позже, эти данные не были подтверждены группой Джин Ши, исследовавшей МАО А и Б человека (Geha et al., 2000а). Ими было показано, что мутация Phe208 на изолейцин в МАО А вызывала увеличение Кт не только для предпочтительного субстрата МАО Б фенилэтиламина (ФЭА), но и для специфического субстрата МАО А - серотонина. Замена же Не 199 на фенилаланин в МАО Б не влияла на сродство фермента к этим субстратам. Эта же группа авторов обнаружила в качестве ответственных за сродство к селективных субстратам (серотонину и ФЭА) и чувствительность к характерным ингибиторам (хлоргилину и депренилу для МАО А и Б, соответственно) другие аминокислоты: изолейцин (Ие335) в МАО А, и тирозин (Туг326) с МАО Б (Geha et al., 2000b). При замене этих аминокислот в одной форме МАО на соответствующие им в другой форме фермента наблюдали реципрокное переключение чувствительности мутантных ферментов к субстратам и ингибиторам. Однако, тот факт, что кинетические константы мутантных форм не были идентичны таковым у диких форм ферментов, позволило им предположить, что в определение субстратной и ингибиторной специфичности вовлечены и другие аминокислоты (Geha et al., 2000b).
Эти противоречия в определении "ключевых" аминокислот, а также подробный анализ данных Tsugeno и Ito (Tsugeno, Ito, 1997) позволили высказать сомнение, что одна аминокислота может определять чувствительность к характерным субстратам и ингибиторам таких ферментов с широкой специфичностью, как МАО А или Б (Веселовский и др., 1998; Медведев и др., 2001). Было высказано предположение, что аминокислоты, установленные этими группами авторов, входят в состав субстрат-связывающей области активных центров МАО, а различия в данных определяются незначительными различиями в структурах активных центров МАО крысы и человека (Медведев и др., 2001).
Построение 3D-QSAR и CoMFA моделей активных центров МАО АиБ
При исследовании структуры и свойств активного центра фермента методами 3D-QSAR и CoMFA для получения более полной его характеристики желательно использовать для анализа наборы соединений из различных химических классов. Это позволит, с одной стороны, получить более детальное представление о структуре активных центров ферментов (наборы из одного класса редко могут полностью охарактеризовать пространство вокруг этих молекул), а с другой - получить дополнительный критерий оценки правильности построенных моделей (распределение полей, полученных в разных 3D-QSAR анализах не должны противоречить друг другу).
Для анализа структур активных центров МАО А и Б методами 3D-QSAR с модулем CoMFA использовали следующие группы ингибиторов этих ферментов:
1) производные пиразинокарбазола,
2) производные индола и изатина,
3) производные карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида Р-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА).
Эти ингибиторы отличаются как механизмом взаимодействия с ферментом, так и конформационной подвижностью заместителей базовых структур, что в совокупности позволяет более полно описать структуры активных центров МАО А и Б.
Производные пиразинокарбазола. Соединения этого класса относятся к селективным прочносвязанным ингибиторам МАО A (Medvedev et al, 1994) с диапазоном ІСзо от 10"5 до 1(Г8 М для МАО А и от W3 до 10"8 М для МАО Б (табл. 4).
Все исследуемые молекулы, кроме Р12, имеют общую базовую структуру и отличаются друг от друга заместителем в 8 положении. Большинство этих молекул (за исключением молекул Р2, РЗ и Р15) имеют жесткие заместители. Конформационный анализ трех гибких соединений показал, что они могут иметь два основных типа конформаций (рис. 4): длинные вытянутые молекулы, когда заместитель располагается почти по прямой относительно базовой структуры (1) и короткие изогнутые, когда заместитель располагается под углом к плоскости базовой структуры (2). Присутствие данных соединений в растворе в обеих конформациях равновероятно, поэтому построение 3D-QSAR моделей активных центров МАО проводили для нескольких наборов ингибиторов, в которых соединения с гибкими заместителями были представлены в разных конформациях.
Для проведения 3D QSAR и CoMFA анализа этих наборов ингибиторов молекулы были выровнены по индольным кольцам, присутствующим во всех соединениях.
Статистические показатели моделей для МАО А и Б, построенных с использованием различных наборов конформаций для производных пиразинокарбазола с гибкими заместителями, представлены в таблице 7.
Статистически значимый квадрат коэффициента множественной корреляции (Rcv2) при скользящем контроле в модели активного центра МАО А был получен по набору, где гибкие молекулы находятся в вытянутых конформациях, после удаления из анализа 3 молекул. На рисунке 5 представлено распределение стерических полей для данной модели. Обращает внимание наличие стерического препятствия для длинных заместителей. В эту область попадает заместитель с самой длинной гибкой молекулы (Р15). Если в этой области пространства активного центра действительно находится стерическое препятствие, то связывание Р15 в вытянутой конформации маловероятно.
Использование в анализе всех гибких молекул в коротких конформациях приводит к ухудшению результатов анализа (табл. 7). Поэтому было предположено, что молекулы с гибкими заместителями скорее всего связываются с ферментом в вытянутой конформации, за исключением самой длинной из них (Р15). Так как это соединение проявляет высокую ингибиторную активность и, имея гибкий заместитель, может изменить свою конформацию и подстроиться под структуру активного центра. Для проверки этого предположения был сделан еще один набор молекул, где Р15 находилась в изогнутой конформации, а соединения Р2 и РЗ - в вытянутых. Полученная модель является наиболее взаимосогласованной, поскольку удовлетворительный результат R"cv при скользящем контроле получается без удаления молекул. На рисунке 6 показано распределение стерических полей, которое предполагает наличие довольно длинной полости в активном центре МАО А. Нахождение в ней узкого заместителя является благоприятным для проявления высокой ингибиторной активности.
Таким образом, для МАО А наиболее вероятной представляется модель, построенная по набору, где две гибкие молекулы в вытянутой конформации, а Р15 - в изогнутой. Распределение электростатических полей в модели для МАО А, построенной по этому набору молекул выявляет области благоприятные для положительных и отрицательных зарядов (рис. 7).
Для построения моделей активного центра МАО Б были использованы два набора ингибиторов, где все заместители гибких молекул находились либо в вытянутых, либо в изогнутых конформациях. В отличие от моделей активного центра МАО А для построения статистически значимых моделей для МАО Б было необходимо включить в анализ величины гидрофобности молекул.
3D-QSAR и СоМТА анализ активного центра МАО Б с использованием набора молекул, где гибкие соединения находились в вытянутых конформациях, значимый R2CV был получен при удалении 2 молекул. Распределение стерических полей показано на рисунке 8. Наиболее характерной особенностью в распределении полей является предсказание ограничения длины молекулы, сразу за которым расположен регион, благоприятный для наличия заместителя. Такая ситуация для активного центра фермента представляется маловероятной. Если учесть, что гибкие молекулы для МАО Б действительно проявляют более высокую ингибиторную активность, то логично было предположить, что они должны связываться в изогнутой конформации.
Распределение стерических полей в модели по набору соединений, в котором гибкие молекулы находятся в изогнутой конформации, представлены на рисунке 9. Оно предсказывает наличие благоприятной области для изогнутых заместителей и ограничение длины молекулы. Кроме того, статистические показатели 3D-QSAR модели для МАО Б с использованием данного набора гораздо выше, чем для модели, построенной по набору, где гибкие заместители находятся в вытянутых конформациях. На основании этого было предположено, что в активном центре МАО Б гибкие молекулы связываются в изогнутой конформации. На рисунке 10 представлено распределение электростатических полей для этой модели,
Проверку достоверности выбранных в качестве наиболее вероятных моделей активных центров МАО А и Б проводили по предсказанию ингибиторной активности для тетриндола. Экспериментальные и предсказанные величины ингибиторной активности этого тестового соединения представлены в таблице 8. Тетриндол может находится в двух конформациях, энергии которых близки, и присутствие в растворе обеих конформации равноверятно. Из таблицы видно, что конформер 1 лучше предсказывается для МАО А, в то время как для МАО Б более близкое значение к экспериментальному показывает конформер 2. Таким образом, полученные модели хорошо предсказывают активность новых соединений из того же химического класса соединений. В то же время можно предположить, что тетриндол взаимодействует с МАО А и Б в разных конформациях, которые являются более предпочтительными для определенного типа фермента.
Таким образом, модель активного центра МАО А по набору молекул, где две гибкие молекулы находились в вытянутой конформации, а самая длинная Р15 - в короткой изогнутой конформации, и модель активного центра МАО Б по набору, где все гибкие молекулы находились в изогнутых конформациях, являются наиболее вероятными и использовались на следующих этапах работы.
Моделирование полости активного центра фермента
Моделирование слепка активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой. Взаимодействие субстратов и конкурентных обратимых ингибиторов с ферментом подразумевает комплементарность структуры лиганда и его места связывания в активном центре (в том числе и стерическое соответствие). В случае фермента с широкой субстратной специфичностью соединения, относящиеся к различным химическим классам, по-видимому, могут взаимодействовать с функциональными группами, расположенными в разных участках активного центра. Поэтому можно ожидать, что совокупность поверхностей этих лигандов будет отражать структуру участка связывания субстратов/ингибиторов в активном центре. Тогда, пространственное совмещение лигандов друг с другом может достаточно полно описать структуру поверхности активного центра.
Для проверки этого подхода мы проанализировали структуру активного центра протеиназы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Выбор этого фермента был обусловлен тем, что для него известно большое количество трехмерных структур комплексов с различными ингибиторами. Ранее было показано, что ингибиторы этого фермента занимают в активном центре определенную область, взаимодействуя с одними и теми же функциональными группами (Wlodawer, Vondrasek, 1998). Было отобрано 18 ингибиторов протеиназы ВИЧ, для которых известны пространственные структуры их комплексов с этим ферментом (табл. 13).
В ситуации, когда отсутствует трехмерная структура фермента-мишени, а есть только информация о структурах и активностях его ингибиторов и субстратов, возникает проблема взаимного пространственного совмещения этих лигандов. Имитируя такую ситуацию, для определения правил выравнивания была построена фармакофорная модель для ингибиторов протеиназы ВИЧ. Построенная фармакофорная модель для этих ингибиторов состоит из двух фармакофорных точек: акцепторного атома - атома кислорода и фенольного кольца (рис. 19). Эти два элемента присутствуют во всех исследованных ингибиторах и их взаимное расположение жестко фиксировано. Они представляют собой основные группировки, определяющие связывание ингибиторов в активном центре (Wlodawer, Vondrasek, 1998).
На следующем этапе были проанализированы трехмерные структуры комплексов протеиназы ВИЧ с этими ингибиторами. На рисунке 20а представлен активный центр фермента, в котором все молекулы ингибиторов совмещены друг с другом в тех положениях, которые они занимают в трехмерных структурах комплексов. Видно, что молекулы ингибиторов хорошо совмещены, и найденные ранее фармакофорные точки совпадают между собой. На рисунке 206 показана структура активного центра белка с наложенными друг на друга ингибиторами, изображенными в виде сфер, с радиусом ван дер Ваальса. Сопоставление этих лигандов с полостью активного центра фермента (рис. 20в) показало, что совокупность объемов ингибиторов достаточно хорошо отражает структуру активного центра и, фактически, представляет собой слепок активного центра.
Анализ структур ингибиторов и расположение их в активном центре показал, что, помимо фармакофорных элементов, можно выделить некоторые другие функциональные группы, часто встречающиеся у разных ингибиторов и расположенные в пространстве близко друг к другу. Так, у многих ингибиторов протеиназы ВИЧ присутствует второе фенольное кольцо, положение которого не так жестко фиксировано в пространстве, как требуется для элемента фармакофора. К подобным лее группировкам относятся некоторые гетероатомы (кислород, азот). Таким образом, при анализе структуры ингибиторов можно выделить некоторые элементы, желательные для проявления соединением высокой ингибиторной активности, но не являющиеся необходимыми для узнавания. Эти элементы могут быть использованы для предсказания конформаций боковых радикалов лигандов при помощи конформационного анализа. Для этого же можно использовать дополнительные данные о стереоселективности субстратов и ингибиторов, результаты ЗО-О БАЯ-анализа и т.д.
Задача построения слепков с субстрат-связывающей области активных центров МАО А и Б облегчалась тем, что для этих ферментов известно несколько групп конкурентных обратимых ингибиторов, обладающих жесткой базовой структурой. Это обстоятельство значительно сократило количество возможных конформеров. Соединения такого типа были выбраны в качестве остова при построении слепков.
Предсказание положения боковых группировок было основано на двух подходах. Первый заключался в использовании данных о структуре активных центров ферментов, полученных по 3D-QSAR и CoMFA моделям для ингибиторов МАО из классов пиразинокарбазолов, индолов и изатинов, и карбобензоксиэтиламина, анилида Р-аланина и карбобензоксиэтилдиамина. Эти модели позволили предсказать благоприятные и неблагоприятные области для нахождения заместителей.
Второй подход включал конформационный анализ боковых радикалов ингибиторов и нахождение таких конформеров этих соединений, у которых группировки, потенциально участвующие в связывании с белком, пространственно сближены.
Построение слепка активного центра МАО А. Структуры использованных ингибиторов МАО А представлены в таблице 14. Выполненный сравнительный анализ показал, что общими структурными элементами для всех ингибиторов являются фенольное кольцо и расположенный рядом с ним атом кислорода или азота, имеющие, отрицательный парциальный заряд. Поэтому молекулы ингибиторов были выровнены по этим фармакофорным элементам. В основу построения слепка легли молекулы, имеющие в своей структуре жесткое ядро (молекулы 18-20, табл.14). Также были совмещены фенольные кольца радикалов у молекул 2, 13, 22 с одной стороны базовых молекул и у соединений 8, 19-е другой; атомы кислорода карбоксильной группы у молекул 6 и 8; азота цианогруппы у молекул 2 и 4; азота у 11, 12, 16 и другие группировки. Полученный таким методом слепок активного центра МАО А представлен на рисунке 21.
Совмещение стерических полей выбранных на первом этапе работы моделей МАО А и полученного слепка активного центра этого фермента показывает их хорошее соответствие (рис. 22). Так, области неблагоприятные для заместителей находятся за границами слепка, в то время как в области, которые предсказываются по моделям как благоприятные для наличия заместителей, располагаются внутри него.
Построение слепка активного центра МАО Б. Структуры использованных ингибиторов МАО Б представлены в таблице 15. Общие структурные элементы для МАО Б такие же, как и для МАО А, но в отличие от последней отрицательно заряженный атом (азот или кислород) может находиться на расстоянии двух связей от кольца. Молекулы были выровнены по вышеуказанным структурным элементам. В качестве остова при построении слепка использовали молекулы с жесткой структурой (1-4 и 8, табл. 15). Кроме того, были совмещены тетразоловые кольца молекул 11, 16, 24, 25 и диазогруппы, находящиеся как в составе различных циклов (молекулы 1-4, 8, 12-15, 22, 23, табл. 15), так и в составе гибких цепей (молекулы 5-7); цианогруппы молекул 5-9, 12-14, 17-20 и 24; атомы кислорода молекул 5-7, 10, 15-16, 23 и 25. Полученный слепок активного центра МАО Б представлен на рисунке 23. Совмещение стерических полей выбранных на первом этапе работы моделей МАО Б и полученного слепка активного центра этого фермента выявляет некоторое несоответствие областей, предсказывающихся как благоприятные, с границами слепка.
Часть молекул, образующих слепок, попадает в область, которая по модели индолов и изатинов с транс-конфигурацией экзоциклической двойной связи предсказывается как неблагоприятная для наличия заместителя (рис. 24). В то же время в другой области за границами слепка модель предсказывает благоприятную область. Это связано с тем, что согласно модели в этой области находятся молекулы с относительно высокой активностью для данной выборки (ins4, ins 19, ins20, ins23, ins24, табл. 5). Сопоставление этих молекул со слепком показало, что в том пространственном положении, в котором их использовали при построении 3D-QSAR модели, они не помещаются в слепок. Поскольку по фармакофорной модели для МАО Б отрицательный атом может находиться на расстоянии двух связей от фенольного кольца, было предположено, что эти молекулы могут связываться в активном центре таким образом, что атом углерода 3 положения индола или изатина совмещается с атомом азота индольного кольца всех остальных молекул. Поэтому была построена новая 3D-QSAR и CoMFA модель активного центра МАО Б для набора производных индола и изатина, в котором молекулы ins4, insl9, ins20, ins23, ins24 были выровнены, как показано на рисунке 25. Полученная модель является статистически достоверной (табл. 16), и хотя статистические показатели этой модели несколько хуже, чем предыдущей модели для МАО Б (табл. 9), при построении новой модели было удалено меньшее количество молекул, то есть она является более взаимосогласованной. Предсказания активности тестовых соединений показаны в таблице 17. Карты распределения стерических и электростатических полей для данной модели представлены на рисунках 26 и 27, соответственно.
Поиск потенциальных ингибиторов МАО А методом молекулярного докинга в базе данных низкомолекулярных веществ
Полученные слепки активных центров МАО А и Б дают представления о структурах и формах активных центров, однако, для корректного описания субстрат/ингибиторного участка необходимо построить поверхность, ограничивающую объем, занимаемый слепком. После удаления молекул, образующих слепок, получается полость, во многом комплементарная полости активного центра. Полученная таким образом модель активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой может быть использована для поиска новых лигандов в молекулярных базах данных при помощи программ локирования. Принципиальная возможность применения такого подхода была показана ранее (Скворцов, 1998).
В данной работе для поиска потенциальных ингибиторов МАО А была использована база данных ASINEX, состоящая из 7725 коммерчески доступных соединений. Предварительно был осуществлен препроцессинг этой базы. Из нее были удалены молекулы:
- содержащие более 25 углеродных атомов,
- содержащие металлы,
- не имеющие в своей структуре ни одного атома азота или кислорода,
- имеющие в своей структуре пять и более ароматических циклов,
- содержащие в своей структуре 3 и более атомов серы,
- заряженные молекулы. После удаления этих молекул в базе осталось 6130 соединений. Для них были рассчитаны возможные конформеры, что увеличило количество соединений для докирования примерно до 50000.
Для последующей оценки оптимальности положения потенциальных ингибиторов в полости активного центра МАО А была выбрана молекула пиразидола в качестве "ядра", положение которого соответствует определенному при построении слепка расположению пиразидола.
Докирование базы данных с конформерами низкомолекзшярных веществ в полость активного центра МАО А показало, что в полость может поместиться только 27600 конформеров, причем количество гипотез о возможном расположении этих молекул в полости равнялось 1057058. Было отобрано 15650 гипотез для 7048 молекул, у которых площадь пересечения конформера с "ядром" полости составляла не менее 90% от площади ядра. Для этих соединений были предсказаны величины ингибиторной активности для МАО А по трем 3D-QSAR и CoMFA моделям. По этим значениям было отобрано 383 конформера 137 молекул, для которых предсказанные величины ингибиторной активности были выше 10"6 М по модели с пиразинокарбазоловыми производными, не менее 10"4 М по модели по аналогам индола и изатина и по модели с производными КЭА, АА и КЭДА. Далее, эти молекулы были точно выровнены по ароматическому кольцу молекулы пиразидола, и для них ингибиторная активность была предсказана повторно. Лучшие 20 соединений с предсказанными активностями представлены в таблице 19.
Для экспериментальной проверки были выбраны 4 соединения, имеющие жесткую структуру и фармакофорные элементы, характерные для МАО А. Результаты проверки представлены в таблице 20. Как видно все соединения в той или иной степени, активны для МАО А, причем лучшее из них (BAS 0442467) имеет ингибиторную активность порядка 10 М. Сопоставление отобранных четырех соединений из таблицы 20 и слепка активного центра МАО Б показало, что ни одна из проверяемых молекул не помещается в полость активного центра МАО Б. Экспериментальная проверка показала, что ни одно из соединений не ингибирует МАО Б, хотя по 3D-QSAR моделям и предсказывается их активность для этого фермента.
Таким образом, проведенный поиск в молекулярной базе с применением моделей слепка активного центра и 3D-QSAR моделей позволил обнаружить новые ингибиторы МАО А.
