Содержание к диссертации
Введение
1. Глава 1. Обзор литературы. 9
1.1 История изучения активного центра медьсодержащих оксидаз и их представителя - лакказы 9
1.2 Подходы к изучению структуры активного центра 14
1.3 Условия получения кристаллов лакказ из различных источников 18
1.4 Исследование структур лакказ методом рентгеноструктурного анализа 21
Ход полипептидной цепи лакказ 24
Структура активного центра лакказ на основе данных РСА. 27
Особенности пространственного строения центра ТІ 28
Особенности пространственного строения Т2/ТЗ-кластера 35
1.5 Механизм действия фермента 39
Внутримолекулярный перенос электрона 40
1.6 Заключение 47
2. Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1 Материалы и объекты исследования 48
2.2 Культивирование Coriolus hirsutus - продуцента лакказы 48
2.3 Выделение и очистка лакказы 49
2.3.1 Очистка фермента методом ВЭЖХ 50
2.3.2 Очистка фермента методом изоэлектрофокусирования 50
2.3.3 Очистка фермента методом препаративного электрофореза.. 51
2.4 Контроль гомогенности препаратов 52
2.5 Метод определения активности лакказы 52
2.5.1 Изучение влияния температурно-фазового перехода на каталитическую активность лакказы 52
2.6 Установление аминокислотной последовательности лакказы из Coriolus hirsutus 072 53
2.6.1 Установление аминокислотной последовательности участка N-конца лакказы С. hirsutus 53
2.6.2 Клонирование и секвенирование кДНК лакказы из С. hirsutus 54
2.6.2.1 Получение препарата РНК из С. hirsutus 54
2.6.2.2 Получение препарата кДНК лакказы из С. hirsutus 55
2.7 Определение степени сходства лакказы из С. hirsutus с известными последовательностями лакказ 58
2.8 Спектральные измерения 59
2.8.1 Регистрация оптических спектров лакказы 59
2.8.2 Регистрация ЭПР-спектров лакказы 59
2.9 Измерение малоуглового рентгеновского рассеяния 60
2.10 Получение кристаллов лакказы 60
2.11 Сбор диффракционных данных и их обработка 61
2.12 Аналитические методы 62
2.12.1 Определение концентрации белка 62
2.12.2 Определение количества ионов металлов в белке 62
2.12.2.1 Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой.62
2.12.2.2 Атомно-адсорбционная спектрометрия 62
2.12.2.3 Спектрофотометрическое определение ионов меди 63
3. Глава 3. Результаты и их обсуждение. 64
3.1 Очистка, характеристика фермента 64
3.2 Изучение влияния температурно-фазовых переходов на активность и структуру лакказы из Coriolus hirsutus 71
3.3 Определение аминокислотной последовательности лакказы из Coriolus hirsutus 072 82
3.4 Определение пространственной структуры лакказы методом рентгеноструктурного анализа 88
3.4.1 Подбор и оптимизация условий кристаллизации лакказы из Coriolus hirsutus 88
3.4.2 Рентгеновский эксперимент 93
3.4.3 Решение пространственной структуры лакказы методом молекулярного замещения 94
3.4.4 Кристаллическая структура. Уточнение и корректировка модели фермента 94
3.4.5 Описание вторичной структуры 99
3.4.6 Пространственная структура активного центра. Координация медных ионов 106
3.5 Предполагаемый механизм действия фермента 120
Выводы 125
Список цитируемой литературы 126
- История изучения активного центра медьсодержащих оксидаз и их представителя - лакказы
- Особенности пространственного строения Т2/ТЗ-кластера
- Изучение влияния температурно-фазовых переходов на активность и структуру лакказы из Coriolus hirsutus
- Подбор и оптимизация условий кристаллизации лакказы из Coriolus hirsutus
Введение к работе
Уникальные каталитические свойства ферментов уже сейчас обеспечили им применение в самых разных областях биотехнологии: от научных исследований (генная инженерия, изучение структуры биополимеров и т.д.) до промышленных процессов (биосенсорные технологии; органический синтез, создание новых фармацевтических препаратов; обесцвечивание бумажной пульпы и тканей; детоксификация ксенобиотиков, включая пестициды и нервно- паралитические агенты; стабилизация напитков). Практический интерес к изучению ферментов продиктован прежде всего их каталитическими характеристиками: активностью и специфичностью действия. Установление взаимосвязи между структурой ферментов и их функциями является одной из главных задач биохимии и основой для создания прикладных биотехнологий.
К настоящему времени охарактеризованы несколько тысяч ферментов, для многих из них достаточно подробно описаны структуры их комплексов с субстратами и предложены вероятные механизмы проявления биологической активности. Кроме того, на основе полученных данных, используя метод направленного мутагенеза, создаются ферменты с повышенной стабильностью, каталитической эффективностью и желаемой субстратной специфичностью. Таким образом, белковая и генная инженерия открывают серьезные возможности для получения биокатализаторов с заданными свойствами, что расширяет сферу практического использования ферментативного катализа.
Семейство лакказ — медьсодержащих оксидаз, впервые обнаруженных более столетия назад в Японском лаковом дереве Rhus vernicifera, по-прежнему остается предметом фундаментальных исследований. Ферменты этого семейства найдены не только в растениях, но также в грибах, бактериях и насекомых. Лакказа обладает способностью катализировать окисление различных соединений, включая о,п-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, структуры лигнина, некоторые неорганические ионы, арилдиамины с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды. Кроме того, она способна осуществлять прямой биоэлектрокатализ, то есть прямой перенос электрона с электрода на активный центр фермента. Физиологические функции лакказы поражают разнообразием и включают: участие в процессах формирования пигментов и образования плодовых тел грибов, биодеградацию лигнина и детоксификацию фенолов. Вышеперечисленные свойства данных ферментов обеспечивают возможность их широкого применения в различных отраслях биотехнологии.
Для более эффективного практического использования фермента в биотехнологии необходимым условием является детальное установление механизма катализа. Для получения фермента с более высокой стабильностью и активностью основным подходом является получение рекомбинантных ферментов и последующая модификация их точечными мутациями. Проведение таких исследований возможно только после расшифровки как первичной, так и пространственной структуры. Основные вопросы, до сих пор не решенные при исследовании данной группы ферментов, суммированы ниже:
- не выяснен механизм генерации окислительно-восстановительного потенциала ТІ-центра на структурном уровне, что имеет первостепенное значение для проявления каталитических свойств;
- не выяснен механизм восстановления кислорода и роль отдельных медных центров (Т2 и ТЗ) в этом процессе;
- не выяснен механизм биоэлектрокатализа и его связь с гомогенным катализом;
- не выяснена роль и структура отдельных интермедиатов в процессе катализа и условия их взаимных переходов.
Выяснение данных вопросов невозможно без определения пространственной структуры высокоредокспотенциальных лакказ, то есть ферментов, наиболее эффективно осуществляющих каталитическое превращение субстрата.
Установление трехмерной структуры ферментов на сегодняшний день проводится с использованием двух основных методов -рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Однако возможности ЯМР-спектроскопии при исследовании ряда белков ограничены. Особые трудности возникают при изучении парамагнитных металлобелков, так как взаимодействие их неспаренных электронов с ядерными спинами вызывает значительное изменение химических сдвигов ядер и увеличение скоростей ядерной релаксации (спин-решеточной и спин-спиновой), что приводит к уширению сигналов, препятствуя их детектированию в спектре ЯМР, и, таким образом, затрудняет получение данных о структуре изучаемой системы.
Очевидно, что основным методом изучения структуры лакказы -медьсодержащего парамагнитного белка - является рентгеноструктурный анализ. Несмотря на получение фермента в кристаллическом виде, имеющиеся данные недостаточны для объяснения свойств лакказы. Таким образом, необходимо изучение структуры ряда высокоредокспотенциальных лакказ для установления взаимосвязи "структура - функции". В настоящей работе были поставлены следующие задачи: определение аминокислотной последовательности данного фермента; исследование структуры фермента и его активного центра при температурно-фазовых переходах; определение по дифракционным данным кристаллической структуры белка.
История изучения активного центра медьсодержащих оксидаз и их представителя - лакказы
История изучения медьсодержащих оксидаз и, в частности, лакказ наиболее полно представлена в работе Б.Г. Мальмстрёма [1], где указано, что первая монография о биологическом окислении, автором которой был М. Траубе, появилась в 1874 г. Согласно гипотезе автора, в процессе биологического окисления основную роль играют ферменты, активирующие молекулярный кислород. Данная концепция была поддержана X. Ёшида в 1883 г. в Японии [1] и Г. Бертрандом в 1894 г. во Франции [2]. Эти исследователи наблюдали окисление фенольных соединений ферментами, выделенными из сока лакового дерева. Позже эти ферменты были названы лакказами. Г. Бертранд использовал не только ферменты растительного происхождения, но и впервые выделил лакказы из грибов. Именно он ввел термин "оксидаза" для ферментов, активирующих молекулярный кислород, и предположил, что ионы металлов "составляют неотъемлемую часть фермента". Однако только в 1939 г. Кейлин и Манн [3] показали, что лакказа является металлсодержащим ферментом. К группе медьсодержащих оксидаз, наряду с лакказой, относятся церулоплазмин плазмы крови млекопитающих и аскорбатоксидаза, которые были объектами интенсивных исследований в течение многих десятилетий 20-го века. Особое внимание уделялось изучению активных центров данных ферментов различными физико-химическими методами, центральное место в ряду которых занимал метод ЭПР-спектроскопии.
Первое ЭПР-исследование лакказ было проведено Б. Мальмстрёмом и Вангаардом в 1957 г. [1] На основании полученных данных был сделан вывод о том, что голубой цвет фермента обусловлен наличием ковалентно связанного иона двухвалентной меди (Си2+). Для установления структуры активного центра и состояния ионов меди в нем авторы провели сравнительную характеристику лакказы, других медьсодержащих белков и комплексов меди [4]. Полученные данные указывали на уникальные спектральные свойства и анизотропию сверхтонкой структуры лакказ и других медьсодержащих белков, связанную с сигналами ионов меди. Кроме того предполагалось, что координационная геометрия иона "голубой" меди в исследованных ферментах искажена в результате взаимодействия с аминокислотными лигандами.
Подтверждением данного предположения были работы Брандена и др. в 1977 - 1978 гг.[5], в которых была установлена пространственная структура медьсодержащего белка — пластоцианина, имеющего в активном центре только один ион меди первого типа типа с искаженной координационной геометрией. В работах Грея и Соломона [6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13] электронная структура медных центров изучалась с привлечением широкого набора методов, включая КД- и ЭПР-спектроскопию, что позволило детально описать их электронную структуру и геометрию. Теоретические расчеты энергии образования конформации активного центра белка, содержащего ион "голубой" меди, находящийся в лигандном поле стабильной плоско-квадратной координации (лиганды — два азота и две серы), показали необходимость такого сворачивания белковой молекулы, при котором окружение медного центра в ферменте принимает геометрическую структуру искаженного тетраэдра или плоского треугольника. Данные расчеты были проведены для аскорбатоксидазы и не учитывали ряда параметров (в частности, энергии переходов d-d-уровнеи), но тем не менее последующие работы подтвердили такую конформацию медного центра для некоторых медьсодержащих белков.
Дальнейшее изучение координации иона "голубой" меди в молекуле лакказы показало наличие трех лигандов: двух атомов азота от аминокислотных остатков гистидина и одного атома серы от цистеина. Данный ион меди характеризуется интенсивной полосой поглощения при 600 - 610 нм (є = 5300 М"1 см 1), что обусловлено переносом заряда а-электронов серы лигандной тиольной группы на орбиту J-электронов меди (nCys - Си11), который также характеризуется ЭПР-сигналом (Аи = 43 — 95 х 10"4 см"1). Согласно принятой классификации этот ион меди называют ионом меди первого типа (ТІ) [14].
Впервые гипотеза о наличии ионов меди с другими спектральными характеристиками, отличающимися от характеристик иона меди первого типа, в молекулах медьсодержащих оксидаз (церулоплазмин, растительные и грибные лакказы) была выдвинута в 1965 г. на конференции "Биохимия меди" после представления результатов исследований медьсодержащих оксидаз методом ЭПР. Согласно представленным данным спектры всех ферментных препаратов содержали практически идентичные сигналы в области низких значений напряженности магнитного поля, которые ранее приписывались примесям меди в образцах [15]. Исследования группы Мальмстрёма [15] показали, что препараты как растительной, так и грибной лакказы содержат по данным ЭПР два иона меди, причем их вклады в спектры ЭПР практически эквивалентены, т.е. молекулы ферментов содержат два иона меди, обладающих различными спектральными характеристиками, но детектируемых методом ЭПР-спектроскопии. Второй ион меди был назван медью второго типа (Т2). Было показано также, что ион меди Т2 подвижен и может быть избирательно удален после восстановления фермента в присутствии хелатирующего агента [16]. Удаление меди Т2 не влияет на спектральные свойства меди ТІ, однако приводит к полной потере ферментативной активности, что свидетельствует о том, что Т2 — неотъемлемый компонент лакказ, необходимый для их функционирования. ЭПР-сигнал меди Т2 имеет следующие параметры сверхтонкого расщепления А\\ = 158 — 201 х Ю см"1.
Попытка объяснить взаимодействие двух ионов меди ТІ и Т2 в медьсодержащих белках привела к предположению о наличии биядерного центра со смешанной валентностью [17; 18]. И хотя данная гипотеза не подтвердилась в дальнейшем, однако она была использована для установления наличия еще двух ионов меди, найденных в лакказе. Таким образом, к концу 60-х годов было установлено, что лакказа содержит 4 иона меди, два из которых образуют биядерный центр — ТЗ. Открытие ТЗ произошло двумя независимыми путями: при исследовании анаэробного окислительно-восстановительного титрования грибной лакказы [19] и кинетики анаэробного восстановления фермента субстратами методом остановленной струи [20].
Особенности пространственного строения Т2/ТЗ-кластера
Обычно в положении X (рис. 4а) в структурах лакказ находится гидрофобная аминокислота Leu [36] или Phe [37]. В этом случае ион меди ТІ и координирующие атомы азота N51 аминокислотных остатков гистидинов и серы SY цистеина располагаются в одной плоскости (тригональная плоская конфигурация) (рис. 46, табл. 3). Структура центра ТІ для лакказы из Coprinus cinereus, имеющая в положении X остаток Leu, показана на рис. 46.
У аскорбатоксидазы [42] и лакказы из Bacillus subtilis [40; 51] в аксиальном положении расположен остаток метионина (рис. 4в). В этом случае SY-aTOM метионина принимает непосредственное участие в координации иона меди ТІ, который смещается из плоскости, образованной атомами SY цистеинового и N51 гистидиновых остатков в сторону аксиального лиганда. Структура центра ТІ для лакказы из Bacillus subtilis, имеющая в положении X остаток Met, показана на рис. 4в. В этом случае ТІ-центр имеет координацию пирамиды.
Следует отметить, что лакказа из Bacillus subtilis была отнесена авторами к группе лакказ только на основании реакционной способности данного фермента окислять сирингалдазин (SGZ) и 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту) (ABTS), которые считаются специфичными субстратами лакказ, а также потому, что степень сходства аминокислотной последовательности данного фермента с лакказой Coprinus cinereus — 39.3%, а с аскорбатоксидазой - 36.6% [40; 51]. Следует отметить однако как показано в работе [52], основной характеристикой лакказ является их способность не окислять тирозин.
Ранее считалось [24; 53], что координирующий аминокислотный остаток в аксиальном положении является основным фактором, влияющим на величину окислительно-восстановительного потенциала в медьсодержащих белках. Исследования, проведенные с помощью точечного мутагенеза в азурине показали [54], что замена метионина лейцином дает повышение потенциала Е (Vs НВЭ) (ОВП) примерно на 100 мВ. В работе Хи [53] было показано, что замена аксиального фенилаланинового остатка на метиониновый в лакказе из Trametes villosa приводит к понижению потенциала на 100 мВ. В лакказе из Coprinus cinereus, у которой ОВП составляет 550 мВ [55], аксиальное положение при ТІ занято лейцином, в то время как в лакказе из Trametes versicolor с ОВП 800 мВ [56] в соответствующем положении находится фенилаланин. Было сделано предположение, что за высокий ОВП отвечает фенилаланин в аксиальном положении [24; 53; 57]. У лакказы из Neurospora crassa по анализу первичной аминокислотной последовательности в аксиальном положении находится лейцин, но она также имеет высокий потенциал EQ = 780 мВ [58; 37]. По-видимому, величина ОВП ТІ-центра определяется не только природой аксиального аминокислотного остатка [37]. В этой работе [37] на основании детального сравнения структур лакказ из Coprinus cinereus с низким ОВП (EQ=550 мВ) и из Trametes versicolor с высоким ОВП (EQ = 780 мВ) было выдвинуто предположение о том, что длина Си — N связи может оказывать влияние на ОВП ТІ-центра. При удлиннении этой связи ОВП увеличивается, так как вклад свободной электронной пары от азота уменьшается, делая ион меди более электроннодефицитным. Расстояние Oil - № (ТІ - His458) в лакказе Trametes versicolor длиннее на 0.17 А, чем в Coprinus cinereus (табл. 3). Суперпозиция структур этих двух ферментов выявила сдвиг на небольшое расстояние а-спирали (а.к. остатки 455 - 461), содержащей His458, который координирует Cul в Trametes versicolor от ТІ-центра по сравнению с соответствующим положением в Coprinus cinereus. Это смещение вызвано водородной связью между Glu460 и Serll3 в лакказе из Trametes versicolor. В структуре лакказы из Coprinus cinereus в соответствующих положениях расположены метионин и глицин, которые не могут образовывать подобную вородную связь.
Конечно, выводы, основанные на изменении длины связи Си — N, могут быть оспорены, так как здесь возможен вклад ошибки в определении координат атомов, которая в рассмотренной работе может достигать 0.15 А. Тем не менее можно согласиться с мнением Пионтека [37], что вклад второй координационной сферы ТІ-центра более важен, чем природа аксиального лиганда.
Единственная структура лакказы из Trametes versicolor, установленная с разрешением 2.4 А и содержащая 2,5-ксилидин в субстрат-связывающем кармане в районе ТІ, была исследована в работе Бертранда [39] и представлена на рис. 4г. Было показано, что между азотом ариламина и азотом Ne2 His458 образуется водородная связь. Вторая водородная связь формировалась между аминогруппой ксилидина и карбоксильным кислородом Asp206 боковой цепи. В структуре также наблюдались гидрофобные взаимодействия субстрата с остатками Phel62, Leu 164, Phe265, Phe332 и Phe337, формирующими карман. На основании представленных данных авторами предположено, что His458, координирующий ион меди ТІ-центра, является первичным акцептором электрона в ТІ-центре с последующим переносом его на ион меди ТІ, а затем к ТЗ -центру.
Изучение влияния температурно-фазовых переходов на активность и структуру лакказы из Coriolus hirsutus
В результате такого уточнения была получена структура, содержащая 4267 неводородных атомов со значениями кристаллографических факторов Rf = 18.15%, Rfree = 23.98%, при этом среднеквадратичное отклонение длин связей и валентных углов от стандартных значений составляло 0.020 А и 1.79, соответственно.
Было установлено, что пять боковых цепей аминокислотных остатков полипептидной цепи имеют двойные положения: ПебЗ, Val201, Cys205, Thr343.
В модель было включено тринадцать углеводных остатков. Восемь из них были остатками N-ацетилглюкозамина, четыре из которых связывались с молекулами аспарагина (Asn54, Asn217, Asn329, Asn432) посредством N-гликозидной связи, а оставшиеся остатки N-ацетилглюкозамина и пять молекул cc-D-маннозы соединялись между собой.
В ходе уточнения структуры были обнаружены большие расхождения в первичных последовательностях, определенных по данным рентгеноструктурного анализа и ДНК-сиквенса. На основании этих данных аминокислотная последовательность, определенная по ДНК-сиквенсу была существенно исправлена. Тем не менее в модели осталось три аминокислотных остатка, не совпадающих с данными по ДНК-сиквенсу: Glu 242, Asp 419, Thr 423, Gly 429, Asp 440 (остатки Pro, Gly, Pro, Arg, Gin по ДНК-сиквенсу, соответственно). В последовательности по ДНК остаток в положении 431 не был идентифицирован. По рентгеновским данным в этой позиции находится Asn 431 (к этому аминокислотному остатку ковалентно присоединена углеводная цепь). Остатки: Glu 242, Asp 419, Thr 423, Asp 440 надежно локализованы по картам электронной плотности. Для Gly 429 нет электронной плотности для боковой цепи. Для аминокислотного остатка Glu 242 показан участок на карте электронной плотности 2F0 - Fc на рис. 25.
В структуре лакказы из Coriolus hirsutus можно выделить три последовательно расположенных домена (рис. 27). Каждый из трех доменов имеет 3-складчатую структуру (рис. 27). Первый домен (аминокислотные остатки с Alal по Asp 128, рис. 2, табл. 8) содержит три Р-слоя и одну спираль (al). Два из них состоят из трех 101 антипараллельных р-цепей (pi, Р2, рЗ; Р6, Р7, Р8), а один - из двух параллельных Р-цепей (Р4, Р5). Атом N основной цепи Lys 59 имеет водородную связь с атомом О основной цепи остатка глутамина Gin 494 на С-конце. Второй домен (аминокислотные остатки с Pro 129 по Leu308, рис. 2, табл. 8) содержит два Р-слоя, формируемых антипараллельными р-цепями (Р9, РЮ; ріЗ, Р14, рі5) и отдельные сегменты цепей в р-конформации (Р11, Р12, Р16, Р17), а также две спирали (а2, аЗ). Третий домен (аминокислотные остатки с Val309 по Gln495, рис. 2, табл. 8) имеет четыре антипараллельных Р-слоя, формируемых р-цепями: р19, Р20; Р21, р22, р23; р24, р25; Р28, Р29. Третий домен имеет несколько спиралей. Одна из спиралей а4 находится между Р-цепями Р23 и Р25, а остальные ссб, а7, а8, а9 расположены последовательно на С-конце молекулы. В структуре обнаружено два дисульфидных мостика. Первый находится между аминокислотными остатками цистеинов доменов 1 и 3 (Cys 85 в цепи между осі - рЗ соединен с Cys 483 в а8), а второй расположен между доменами 1 и 2 (Cys 117 в цепи между р7 - р8 соединен с Cys 205 в цепи между piO - РІЗ). Атом Sy Cys205 имеет два положения. Активный центр фермента образован субстрат-связывающим центром ТІ, расположенным в домене 3 и кислород-восстанавливающим кластером Т2/ТЗ, расположенным между доменами 1 и 3 (рис. 27). Детальное описание строения активного центра фермента будет приведено ниже. Молекула лакказы из Coriolus hirsutus имеет четыре аминокислотных остатка полипептидной цепи (Asn54, Asn217, Asn329, Asn432), с которыми связываются углеводные цепи. Качество карт электронной плотности позволило идентифицировать углеводные остатки и добавить их в модель (рис. 28). 103 К остатку аспарагина 217 посредством N-гликозидноЙ связи присоединяется линейная цепь из трех остатков N-ацетилглюкозамина и одного остатка ct-D-маннозы (рис. 29а). К Asn329 присоединяется один углеводный остаток N-ацетилглюкозамина, а к Asn432 два углеводных остатка N-ацетилглюкозамина. Самая большая по количеству углеводных остатков цепь присоединяется к Asn54 (рис. 296). Эта цепь имеет шесть углеводных остатков. Остатки N-ацетилглюкозамина соединяются между собой в положении Р(1—»4), точка ветвления расположена через два остатка N-ацетилглюкозамина от Asn 54. a-D-маннозные остатки соединяются а(1-»2) и а(1- 6) связями с третьим остатком от Asn 54 (остаток a-D-маннозы), образуя ветви, одна из которых состоит из одного остатка a-D-маннозы, а другая - из двух остатков a-D-маннозы, связанных между собой в положении а(1—»3). Последний остаток a-D-маннозы 1514 (рис. 296), принадлежащий цепи от Asn 54, имеет водородные связи с аминокислотными остатками Ser 21, Gin 23, Ala 155 данной полипептидной цепи. Кроме того, было установлено, что этот остаток a-D-маннозы 1514 (рис. 296) имеет водородные связи с аминокислотными остатками, находящимися в симметричной молекуле: Asn 39, Asp 42. Второй и третий углеводный остатки, принадлежащие цепи от Asn 217 (1507 и 1508 соответственно), также имеют водородные связи с атомами основной полипептидной цепи аминокислотных остатков Lys 157, Leu 158 симметричной молекулы (табл. 9).
Подбор и оптимизация условий кристаллизации лакказы из Coriolus hirsutus
Таким образом, высокая эффективность катализа высокоредокспотенциальными лакказами обеспечивается более высоким значением электродвижущей силы, определяемой разницей окислительно-восстановительных потенциалов ионов меди ТІ и ТЗ, и более коротким путем переноса электронов. Перенос электрона на Т2/ТЗ -кластер завершает первую стадию катализа, за которой следует стадия восстановления кислорода с образованием двух молекул воды. Известно, что в каталитическом цикле лакказы участвуют несколько взаимопереходящих форм фермента, а именно пероксо-форма, полностью восстановленная форма, окисленная "покоящаяся" форма и нативный интермедиат. Взаимные переходы промежуточных форм лакказы и время их жизни в растворе в значительной степени зависят от рН и температуры. Согласно общепринятой классификации промежуточных форм фермента, нативным интермедиатом является такая форма, у которой все ионы меди трехъядерного медного кластера находятся в окисленном состоянии и каждый из них имеет кислородный лиганд - Ol, 02 и 03 ("трехмостиковая" модель). Окисленная "покоящаяся" форма отличается от нативного интермедиата отсутствием кислородного лиганда ОЗ. В структуре трехъядерного медного кластера лакказы С. hirsutus установлено наличие трех кислородных лигандов, два из которых являются "мостиками" между ТЗі и Т32 (01) и между ТЗі и Т2 (03), а третий - кислородным лигандом только Т2 (02). Таким образом, в отличие от других известных структур лакказ, имеющих два кислородных лиганда (окисленная "покоящаяся" форма), для лакказы С. hirsutus получена структура в форме нативного интермедиата. Обобщая результаты структурных исследований, предложена гипотетическая схема механизма восстановления кислорода в трехъядерном кластере (рис. 36). Восстановление кислорода может происходить двумя путями. Первый путь предполагает участие в катализе нативного интермедиата, который, получая электрон от ТІ-центра, переходит в окисленную "покоящуюся" форму с сопутствующим отщеплением одной молекулы воды. Следует отметить, что после отщепления воды кислородный лиганд 01 остается мостиковым между ионами меди антиферромагнитной пары, а кислородный лиганд 03 переходит в положение, занимаемое 02 лигандом. Второй путь восстановления молекулярного кислорода предполагает перестройку Т2/ТЗ-кластера окисленной "покоящейся формы после переноса электрона с ТІ-центра с образованием "мостика" между ТЗ] и Т2-ионами меди. Такая конформация ТЗ-центра способна связывать кислород с образованием "мостика" между ТЗ] и ТЗг. При этом остальные кислородные лиганды (01 и 02) находятся в тех же положениях. Таким образом, образуется нативный интермедиат, который после протонирования и отщепления молекулы воды может переходить в окисленную "покоящуюся" форму. Кислородным лигандом Т2 у данной формы становится 01, а кислородный мостиковый лиганд между ТЗі и Т2 отщепляется в составе молекулы воды. 1. Разработан протокол очистки лакказы из Coriolus hirsutus методом препаративного электрофореза, который позволил получить гомогенный препарат фермента с высокой удельной активностью. 2. Определена аминокислотная последовательность лакказы из Coriolus hirsutus 072 по нуклеотидной последовательности кДНК. Установлено, что высокоредокспотенциальные грибные лакказы имеют более 70% степени сходства аминокислотных последовательностей, при этом аминокислотные остатки, координирующие ионы меди, 100% идентичны у лакказ и аскорбат оксидазы. 3. Показано, что лакказа существует в растворе в виде мономеров и димеров (соотношение 85% - 15%). Методами ЭПР и оптической спектроскопии установлено, что при размораживании препарата фермента происходит процесс конформационная перестройка активного центра, сопровождающаяся изменением каталитической активности. 4. Найдены условия роста монокристаллов лакказы из Coriolus hirsutus 072: 0.05 М К-фосфатный буфер рН 7.0, 10% в/о ПЭГ 1000, 10% в/о ПЭГ 8000. На синхротронном источнике рентгеновского излучения собран набор дифракционных данных с разрешением 1.85 А. Структура решена методом молекулярного замещения. Проведено кристаллографическое уточнение структуры до R-фактора 18.15%. 5. Показано, что аксиальные Phe 458 и Не 450 находятся на равном расстоянии (3.6 А) от иона меди ТІ. Установлена коррреляция между длиной водородной связи между атомом Cys 448 О и атомом His 447 51N и величиной окислительно-восстановительным потенциалом иона меди ТІ. Впервые получена структура нативного интермедиата, содержащего в центре трехъядерного кластера дополнительный кислородный лиганд. 6. На основании полученных структурных и спектроскопических данных предложен механизм восстановления молекулярного кислорода в процессе ферментативного катализа.
