Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 . Цитологическая и физиологическая характеристика особенностей сперматозоидов человека в норме и при вариантах патологии 9
1.2.Использование компьютерных технологий в морфологическом анализе сперматозоидов 29
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Характеристика пациентов 36
2.2. Методы исследования 45
Глава 3. Качественные морфологические и функциональные характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность обычного экстракорпорального оплодотворения и с применением интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов 55
Глава 4. Анализ качественных морфологических параметров сперматозоидов с использованием индексов множественных аномалий 67
Глава 5. Морфометрический анализ сперматозоидов. Количественные показатели, имеющие клиническую значимость при проведении интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов 84
Глава 6. Общее заключение 103
Выводы 113
Внедрение результатов в практику 114
Список использованной литературы 115
- Цитологическая и физиологическая характеристика особенностей сперматозоидов человека в норме и при вариантах патологии
- Качественные морфологические и функциональные характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность обычного экстракорпорального оплодотворения и с применением интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов
- Анализ качественных морфологических параметров сперматозоидов с использованием индексов множественных аномалий
- Морфометрический анализ сперматозоидов. Количественные показатели, имеющие клиническую значимость при проведении интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов
Введение к работе
Актуальность темы. Количество бесплодных супружеских пар
в России достигает 12-15%, что, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), сопоставимо с распространенностью бесплодия в мире (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2000). При изучении структуры бесплодия ВОЗ определила мужской фактор более чем в половине случаев (World Health Organization, 1987).
Качество сперматозоидов является важным показателем мужской фертильности, и поэтому их объективная оценка играет одну из ключевых ролей в обеспечении успешности методов вспомогательных репродуктивных технологий. Наибольшее распространение получил анализ морфологии сперматозоидов по строгим критериям, разработанным Kruger и соавт. (Krager T.F. et al., 1986). Для повышения информативности разработаны индексы множественных дефектов сперматозоидов (Jouannet P. et al, 1988; Aziz N. et al, 1996). Однако, современная классификация аномалий сперматозоидов не позволяет выделить формы, имеющие отрицательную или положительную связь с частотой оплодотворения тем или иным методом и последующим развитием эмбрионов. Этим могут быть обусловлены и противоречия в данных литературы по вопросам преимущества экстракорпорального оплодотворения или интрацитоплазматическои инъекции сперматозоида в разных клинических ситуациях. Поэтому более дифференцированный подход к выбору метода вспомогательных репродуктивных технологий, основанный на точной морфологической оценке мужских гамет, возможно, позволит избежать слишком частого и неоправданного применения интрацитоплазматическои инъекции сперматозоида, которое имеет тенденцию к расширению показаний. К тому же, изучение связи морфологии сперматозоидов с успешностью интрацитоплазматическои инъекции может способствовать повышению эффективности самой микроманипуляции.
Большинство классификаций морфологических дефектов сперматозоидов, предложенных до сегодняшнего дня, основывается на качественной характеристике их формы. Использование более сложных и трудоемких способов оценки нецелесообразно в повседневной лабораторной практике, но необходимо для фундаментального изучения связи строения сперматозоида с его функциональной компетентностью. Поэтому для разработки критериев, позволяющих оптимизировать процедуру интрацитоплазматическои инъекции сперма-
тозоида, необходимо, на основе точных количественных методов анализа, выявить прогностически ценные морфологические параметры, которые могут быть оценены и без использования дополнительных средств. Компьютерная морфометрия является высокоточным, воспроизводимым и стандартизованным методом, позволяющим количественно выразить структурные характеристики объекта и доказательно обосновать или отвергнуть значимость качественных оценочных критериев.
Цель исследования. Изучить варианты строения сперматозоидов человека в норме и при патологии и определить наиболее информативные интегральные морфологические критерии для прогнозирования успешности лечения бесплодия при применении вспомогательных репродуктивных технологий.
Задачи исследования:
Выявить качественные морфологические характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции в яйцеклетку.
Оценить возможность использования этих характеристик для выбора метода вспомогательных репродуктивных технологий.
Оценить возможности компьютерной морфометрии для объективной характеристики сперматозоидов при использовании в области вспомогательных репродуктивных технологий.
С помощью компьютерной морфометрии выявить наиболее информативные интегральные параметры сперматозоидов, пригодные для планирования лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий.
На основании морфометрического анализа сперматозоидов выявить параллели между параметрами, полученными в результате интегрального качественного и количественного морфологического исследования.
Научная новизна исследования. Выявлены особенности морфологической оценки сперматозоидов при подготовке и проведении лечения бесплодия методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, учет которых способствует повышению его эффективности. Установлены критерии оценки структур, которые обеспечивают прогнозирование успешности интрацитоплазматической инъекции сперматозоида. Обнаружена связь между качественной характеристикой строения сперматозоидов и качеством зигот, полученных
при классическом экстракорпоральном оплодотворении. Выявлены параллели между параметрами качественного и количественного морфологического анализа сперматозоидов. Определены количественные параметры, характеризующие форму головки сперматозоида и, таким образом, адаптирующие методику качественного анализа для морфометрического компьютерного исследования спермы.
Практическая значимость работы. Знание структурных особенностей сперматозоидов, влияющих на развитие эмбрионов после интрацитоплазматической инъекции, позволит повысить эффективность лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий за счет улучшения результатов микроманипуляции и более глубокого и дифференцированного подхода к диагностике мужского бесплодия на уровне эмбриологической лаборатории. Выявленные морфометрические параметры сперматозоидов, имеющие прогностическое значение, будут способствовать увеличению надежности автоматизированного морфологического анализа спермы и скорейшему его распространению в лабораторной практике с целью стандартизации результатов исследования.
Положения, выносимые на защиту:
Критерии, разработанные на основе морфометрических параметров сперматозоидов, коррелирующих с успешностью лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий, объективизируют систему качественного анализа их структурных элементов.
Оценка некоторых структурных особенностей сперматозоидов, отражающих их функциональное состояние - фактора формы круга головки, индекса множественных аномалий шеечного отдела, доли сперматозоидов с искривленными шейками, округлости головки, большой оси головки, отношения «большая/малая ось головки», фактора формы круга акросомы, фактора формы эллипса акросомы, округлости акросомы, малой оси акросомы, отношения «малая/большая ось акросомы», относительной площади акросомы, отношения «периметр/площадь акросомы» - должна быть дифференцированной при прогнозировании успешности лечения бесплодия методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида и методом классического экстракорпорального оплодотворения.
Благодаря выявленным параллелям с морфометрическими параметрами сперматозоидов (фактором формы круга головки фактором формы круга акросомы, фактором формы эллипса акросомы), ка-
чественные признаки формы головки сперматозоида и акросомы являются значимыми при прогнозировании успешности интрацито-плазматической инъекции сперматозоида.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на XII международной конференции Российской ассоциации репродукции человека (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции «Twin-Meeting Alpha-Andrology: 4th Biennial Alpha Conference / 8th Meeting of Andrology in the 2000s» (Антверпен, Бельгия, 2003), XXIX ежегодной конференции Американского андрологического общества (Балтимор, США, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах на русском языке и содержит 34 таблицы, 10 графиков, 16 фотографий и рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», трех глав с материалами собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (71 отечественный и 170 иностранных источников). Весь представленный материал обработан и проанализирован лично автором.
Цитологическая и физиологическая характеристика особенностей сперматозоидов человека в норме и при вариантах патологии
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет репродуктивное здоровье как способность женщины и мужчины реализовать свои репродуктивные потребности, состоять в полноценных сексуальных отношениях и поддерживать здоровье последующих поколений (World Health Organization, 1991). Бесплодием считается отсутствие беременности после 12 месяцев половой жизни без контрацепции (World Health Organization, 1993). По данным Всемирной организации здравоохранения, бесплодием страдают около 15% супружеских пар; в России этот показатель составляет в среднем 12-15% (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2000), достигая в отдельных регионах 17,8% (Артифексов СБ., Рыжаков Д.И., 2003). Проблема бесплодия в нашей стране особенно остра в связи со сложившейся демографической ситуацией. По сравнению с данными переписи 1989 года, на 1 января 2002 года население Российской Федерации сократилось на 3068 тыс. человек, или на 2,1%. В последние годы темпы убыли населения возросли. Только за 1999 г. число россиян уменьшилось на 768 тыс. человек, за 2000 г. - еще на 740 тыс. человек, или на 0,5% в год. Убыль населения Южного федерального округа в 2001 году составила 0,8%, что является вторым по величине показателем отрицательного прироста в России (Институт народнохозяйственного прогнозирования РАН, 2002). Современные параметры рождаемости в два раза меньше, чем требуется для замещения поколений: в среднем на одну женщину приходится 1,2 рождения при 2,15, необходимых для простого воспроизводства населения (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000). Кроме того, нельзя недооценивать тяжесть психического состояния супругов, вызванного невозможностью иметь собственного ребенка, поскольку этот фактор может способствовать нарушению социальной адапта - 10-ции и расторжению брака (Юнда И.Ф. и соавт., 1990). В 2001 году количество разводов в России достигло рекордного уровня за 60 лет наблюдений - 763,5 тыс. (общий коэффициент разводимости 5,3 на 1000 населения). Важно отметить, что разводы во все большей мере охватыватот бездетные пары. Если в первой половине 1990-х годов доля бездетных пар во всех расторгнутых браках колебалась в пределах 35-38%, то в последние годы превышает 50%. Кроме того, уменьшилось среднее число детей на один расторгнутый брак среди тех пар, которые имели совместных детей до 18 лет. Отчасти это объясняется общим снижением рождаемости, однако, главная причина - возросшая стабильность браков с детьми относительно бездетных супружеских пар (Институт народнохозяйственного прогнозирования РАН, 2002).
Важное место в структуре бесплодия во всем мире занимает патология мужской репродуктивной системы. Исследование ВОЗ, включившее 6000 бесплодных пар, определило мужской фактор в 51,1% случаев бесплодия (World Health Organization, 1987). Имеются тревожные данные об увеличении количества бесплодных мужчин (Артифексов СБ., Рыжаков Д.И., 2003) и о прогрессирующем снижении качества спермы в мире (Carlsen Е. et al., 1992), хотя некоторые исследователи не обнаруживают такой тенденции и объясняют эти разногласия особенностями методов анализа спермы, обработки данных и выбора популяции (Lipshukz L.I. et al., 1996).
К мужскому бесплодию приводит целый ряд патогенетических факторов, по которым, согласно современной классификации, его можно свести к трем основным категориям: секреторное, экскреторное и иммунное (Тиктинский О.Л., Михайличенко В.В., 1999). Сперматогенез может нарушаться вследствие гипофизарных нарушений, генетических факторов, рака яичек, аплазии зародышевого эпителия, варикоцеле, травм половых органов, травм головного и спинного мозга, нарушения функции эндокринных желез и внутренних органов, инфекционно-токсического влияния, воздействия некоторых лекарств, токсинов, факторов внешней среды, недостаточного питания, нервно -11 -психических нагрузок (Кунин М.Л., 1968; Юнда И.Ф., 1989; Тиктинский О.Л., Михайличенко В.В., 1999). Выявление причины и лечение патоспермии в каждом конкретном случае представляет значительные трудности, а иногда и невозможно. Это нашло отражение и в классификации мужского бесплодия, разработанной ВОЗ, где 4 из 16 пунктов занимают идиопатические нарушения сперматогенеза, и еще один пункт обозначен как «Отсутствие видимой причины бесплодия» (World Health Organization, 1993). Однако, развитие вспомогательных репродуктивных технологий, и в особенности ИКСИ, позволяет решать проблему бесплодия, концентрируя внимание не на причине, а на имеющихся показателях эякулята. На практике мужской фактор бесплодия чаще всего выявляется при анализе спермы. M.G.Hull et al. (1985) в большой популяции (708 бесплодных пар) определили «дефекты и дисфункцию» сперматозоидов в 24% случаев бесплодия. Но и анализ эякулята не всегда позволяет выявить патологию при клинической картине мужского бесплодия. В том же исследовании Hull M.G. et al., 1985, не удалось выявить причину бесплодия в 28% случаев. Разумно предположить, что в какой-то степени в эту цифру вошел и скрытый мужской фактор.
Поэтому современные подходы к лечению мужского бесплодия, основывающиеся на данных анализа эякулята, во многом носят эмпирический характер. Чтобы придать им научную обоснованность, были и продолжают разрабатываться разнообразные биохимические, функциональные, иммунологические методики. Наиболее информативные из них описаны в руководстве ВОЗ по исследованию эякулята (World Health Organization, 1999). На сегодняшний день самым простым, надежным, быстрым и доступным методом определения мужского фактора бесплодия принято считать спермограмму. Однако, этот метод во многом субъективен, и результаты его в андрологических лабораториях трактуются по-разному. Даже составители упомянутого руководства ВОЗ (World Health Organization, 1999), внесшего большой вклад в дело стандартизации методов анализа спермы, считают «предпочтительным для каждой лаборатории определить собственные нормативные критерии для каждого показателя». Межлабораторные разногласия обусловлены не только особенностями методологии, но и значительными сложностями в определении нормы параметров эякулята. В самом же руководстве даны нормативы, основанные на результатах мультицентровых популяционных исследований здоровых мужчин, которые нельзя рассматривать как достоверные критерии полноценности репродуктивной функции. Для определения «порога фертильности» эякулята предпринимаются попытки найти взаимосвязь параметров спермограммы с результатами более сложных, специфических методик, поскольку применение самих этих методик в рутинной лабораторной практике слишком трудоемко (Katz D., Diel L., Overstreet J., 1982; Katz D. et al., 1996; Marsh S. et al., 1987; Oehninger S. et al., 1994; Воробьева О.А., Филатов M.B., Леонтьева О.A., 1997; Angelopoulos Т. et al., 1998). Самой достоверной проверкой функциональной полноценности сперматозоидов в условиях лаборатории является оплодотворение in vitro, поэтому исследования по выяснению зависимости его результатов от тех или иных характеристик спермы представляют наибольший интерес. Разные авторы находят связь успешности экстракорпорального оплодотворения с подвижностью (Alper М.М. et al., 1985; Ron-El R. et al., 1991; Robinson J.N. et al., 1994), концентрацией (Biljan M.M. et al., 1994; Calvo L. et al., 1994; Robinson J.N. et al., 1994) и морфологией сперматозоидов (Kruger T.F. et al., 1986; Enginsu M.E. et al., 1992; Grow D.R. et al., 1994), причем из всех ключевых параметров спермограммы наиболее приемлемым показателем мужской фертильности большинство работ признают именно морфологию сперматозоидов. По данным, приведенным Воробьевой О.А. с соавт. (1995), из различных методов оценки функционального состояния сперматозоидов наибольшее прогностическое значение имеют их морфология и связывание с блестящей оболочкой, опережая такие методики, как определение состояния акросом, мембран сперматозоидов, зрелости ядер.
Качественные морфологические и функциональные характеристики сперматозоидов, влияющие на успешность обычного экстракорпорального оплодотворения и с применением интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов
В результате проведенного исследования выявлено, что качественные морфологические характеристики сперматозоидов находятся в корреляционной связи друг с другом и с параметрами, измеряемыми в рамках стандартной спермограммы. Среднее количество повреждений (по критериям ВОЗ), приходящихся на один аномальный сперматозоид, нарастало с увеличением их относительного количества в эякуляте, что подтверждалось статистически достоверной обратной линейной зависимостью индекса тератозооспермии (ИТЗ) от индекса Крюгера (ИК) (г = -0,45, 95% доверительный интервал -0,55 —0,33, р 0,01) (рис.15).
Результаты оценки зависимости морфологических характеристик сперматозоидов от их концентрации, функциональных показателей, а также возраста пациента представлены в таблице 2. Относительное количество сперматозоидов, соответствовавших качественным морфологическим нормативам ВОЗ, закономерно повышалось с увеличением концентрации сперматозоидов, повышением относительного числа сперматозоидов с прогрессивной подвижностью в нативном эякуляте, а также с повышением их способности к активации по данным активационного теста. Средняя суточная выживаемость сперматозоидов находилась в прямой зависимости от содержания морфологически нормальных форм, хотя сила связи была невелика (коэффициент корреляции Спирмена г = 0,17, р 0,05). Зависимости морфологических признаков от возраста пациента не прослеживалось.
При оценке связи индексов Крюгера и тератозооспермии с частотой оплодотворения и качеством развития эмбрионов in vitro в программах ЭКО и ИКСИ получены данные, представленные в таблице 3. В программе ЭКО индекс Крюгера положительно коррелировал с общей частотой оплодотворения (40) и частотой нормального оплодотворения (рис.16), а также с относительным числом зигот (рис.17) и 3-дневных эмбрионов (рис.18), отнесенных по морфологическим признакам к категории 1. Сила зависимости была невелика (коэффициент корреляции Спирмена от 0,13 до 0,19), но уровень статистической достоверности этих данных (р 0,05) позволяет говорить о том, что от доли сперматозоидов без морфологических дефектов в эякуляте зависит не только оплодотворяющая способность спермы, но и развитие зигот и предимплантаци-онных эмбрионов in vitro по крайней мере до 3-го дня культивирования. Это подтверждается и отрицательной зависимостью от индекса Крюгера среднего балла зигот, то есть улучшением общего качества зигот у пациентки при более высоком содержании морфологически нормальных сперматозоидов в сперме партнера. Однако, не было обнаружено подобной зависимости для частоты имплантации (ЧИ), которая свидетельствует о функциональной полноценности бластоцист, полученных из перенесенных в полость матки эмбрионов.
Индекс тератозооспермии не был достоверно связан ни с одним из рассматриваемых критериев успешности ЭКО, что не позволяет нам сделать вывод об их зависимости от степени повреждения аномальных сперматозоидов. Таким образом, использование индекса тератозооспермии в качестве прогностического критерия в программе ЭКО, по нашим данным, нецелесообразно.
В то же время, в группе ИКСИ были получены обратные результаты. Частота оплодотворения не зависела от качественных морфологических параметров сперматозоидов, а частота имплантации оказалась в обратной зависимости от индекса Крюгера (рис.19) и в прямой - от индекса тератозооспермии (рис.20). Существенным является тот факт, что из 5 циклов ИКСИ, в которых индекс Крюгера составил 0, то есть в эякуляте не было обнаружено морфологически нормальных сперматозоидов, наступило 2 беременности (одна из них двойней), завершившиеся срочными родами. На основании этих данных можно констатировать, что введение аномального сперматозоида в яйцеклетку не всегда препятствует оплодотворению и нормальному развитию эмбриона.
Морфологические характеристики зигот были лучше при меньшей степени повреждения сперматозоидов (коэффициент корреляции Спирмена для индекса тератозооспермии и среднего балла зигот г = 0,33, р 0,05, рис.21).
Анализ зависимости результатов ЭКО от морфологии сперматозоидов не показал статистически достоверных различий между средними величинами индексов Крюгера и тератозооспермии в группах пациенток с безуспешным переносом эмбрионов и с зарегистрированной имплантацией, а также в группах пациенток с доношенными беременностями и спонтанными выкидышами (таблица 4). В то же время, в семейных парах, у которых была получена беременность после ИКСИ, средний индекс Крюгера оказался достоверно ниже на 3,13% (рис.22), чем в группе с неудачными попытками, а средний индекс тератозооспермии, наоборот, выше на 0,163 единицы (рис.23). Таким образом, эти данные также свидетельствуют в пользу того, что повышение доли сперматозоидов с множественными аномалиями строения является свидетельством необходимости применения ИКСИ.
Для определения прогностической ценности качественных морфологических показателей для ЭКО и ИКСИ мы оценивали успешность лечебных циклов в группах пациентов с пороговыми величинами этих показателей, выбранными по литературным данным (Kruger T.F. et al., 1988; Ombelet W. et al., 1997) и принятыми в лабораториях, участвовавших в исследовании. Результаты по индексу Крюгера представлены в таблице 5. В программе ИКСИ отмечена достоверно более высокая частота наступления беременности (ЧНБ) в объединенной группе с индексом Крюгера менее 10 (28,75% против 5,0%, р 0,05, вероятность успешного исхода 7,60, 95% ДИ 0,96-60,01). При таком значении индекса Крюгера можно предсказать наступление беременности после ИКСИ с чувствительностью 96%) (95%о доверительный интервал 80-99,9%) и специфичностью 24% (15-35%), отношение правдоподобия 1,26. Частота имплантации в группе с индексом Крюгера 10 тоже была достоверно выше (11,9% против 2,7% р 0,05, вероятность успешного исхода 4,35, 95% доверительный интервал 1,02-18,55), наступление имплантации можно прогнозировать с чувстви -65-тельностыо 94% (81-99%) и специфичностью 20% (16-25%), отношение правдоподобия 1,19. Частота спонтанных выкидышей в группах с низкими значениями индекса Крюгера имела тенденцию к повышению, но эти различия не достигли уровня статистической достоверности (р = 0,06). Для индекса терато-зооспермии к приемлемому уровню достоверности приблизилась лишь разница в частоте наступления биохимической беременности (р = 0,06), которая была выше в группе со значением этого показателя более 1,5 (таб.6).
Таким образом, качественные параметры морфологии сперматозоидов по строгим критериям Крюгера в настоящей работе находились в положительной корреляционной связи с другими показателями спермограммы, а также с частотой оплодотворения и качеством эмбрионов в ЭКО. Это согласуется с работами большинства других авторов (Coelzee К. et al., 1998; Воробьева О.А. с со-авт., 2001 и др.), что подтверждает правомерность использования индекса Крюгера для оценки фертильности эякулята. Индекс тератозооспермии не был связан ни с одним из оцениваемых параметров классического ЭКО.
Анализ качественных морфологических параметров сперматозоидов с использованием индексов множественных аномалий
Оценка распределения аномалий формы различных отделов сперматозоидов в группах супружеских пар, у которых перенос эмбрионов после ИКСИ не привел к наступлению беременности (группа I) и пациенток, у которых наступление имплантации было зарегистрировано по данным УЗИ (группа II), показала достоверные различия по относительному количеству сперматозоидов с аномальными головками (таблица 7), причем в группе забеременевших этот показатель был на 5,49% выше (р 0,01). Различий по количеству сперматозоидов с аномалиями шейки и хвоста не выявлено.
На следующем этапе оценивали распределение отдельных видов аномалий каждого из отделов сперматозоида. Результаты подсчета частоты различных дефектов головок сведены в таблице 8.
Результаты дополняют картину, полученную при качественной оценке с помощью ИК и ИТЗ. Показано, что в группе с успешным исходом переноса эмбрионов после ИКСИ наблюдалось более высокое содержание сперматозоидов с аномалиями формы головки в целом (на 9,93%), а также, в частности, сперматозоидов с наиболее деформированными головками - гантелевидными (на 2,25%) и аморфными (на 5,71%). Кроме того, в группе с произошедшей имплантацией достоверно выше относительное количество сперматозоидов с аномальными акросомами (на 6,73%), сперматозоидов с аномальными размерами головки (па 4,19%) за счет чрезмерно больших головок (5,19% против 3,09%), сперматозоидов с вакуолями (на 2,28%) и с двумя головками (на 1,13%).
Частота встречаемости различных видов патологии шеечного отдела сперматозоидов приведена в таблице 9.
Более высокое содержание сперматозоидов с аномально короткими (0,65% против 0,06%) и искривленными шейками (8,91% против 6,88%) обнаружено в группе I. Однако, в группе с успешными переносами достоверно чаще встречались сперматозоиды с аномалиями прикрепления шейки к головке (15,25% против 10,99%).
Из различных видов аномалии хвостового отдела статистически достоверное различие между группами наблюдали лишь по числу сперматозоидов с аномальным количеством жгутиков (таблица 10), которых в группе II было в 7,3 раза больше (р 0,01).
Для определения степени поражения разных отделов сперматозоидов были введены индексы множественных аномалий каждого из отделов, учитывающие характер их поражения. Для головки принимали в расчет аномалии размера, формы, количества, акросомальной области, наличие вакуолей (возможные значения индекса множественных аномалий головки - ИМАГ = 1-5); для шейки - аномалии размера, формы, количества, прикрепления к головке, наличие цитоплазматической капли (индекс множественных аномалий шейки ИМАШ = 1—5), для хвоста - аномалии размера, формы, количества, наличие патологических изгибов и скрученности (индекс множественных аномалий хвоста ИМАХ = 1-4). Индексы множественных аномалий рассчитывали как отношение количества патологий данного отдела сперматозоида к количеству сперматозоидов с аномалиями этого отдела.
Индекс множественных аномалий головки (ИМАГ) был выше в группе пациенток, у которых наступила беременность (1,883 против 1,713, р 0,01). Индекс множественных аномалий шейки (ИМАШ) как показатель тяжести поражения шеечного отдела оказался выше в группе I (таблица 1 1).
Для определения доминирующей аномалии сперматозоидов подсчитывали частоту встречаемости отдельных видов аномалии и их сочетаний у каждого пациента. Для этого был разработан алгоритм, согласно которому каждому виду аномалии по ВОЗ (грушевидные, гантелевидные, округлые и т.д.) присваивали свой математический порядок (единицы, десятки, сотни и т.д.), после чего величины суммировали, и по полученному числу можно было судить о наборе аномалий у каждого сперматозоида. Например, показатель 10100 означал сперматозоид с аномально маленькой головкой и дефектом акросомы (которым соответствовала единица) и нормальные значения остальных параметров (которым соответствовал «0»). Аномалии шейки и хвоста кодировали по аналогичному принципу, но с множителями 2 и 4, соответственно, чтобы показатели можно было складывать. Например, показатель 300 означал сперматозоид с малыми размерами головки и аномальным прикреплением шейки (100+200) при нормальных значениях остальных параметров. Соответствие различных дефектов числовым показателям приведено в таблицах 12-15.
Морфометрический анализ сперматозоидов. Количественные показатели, имеющие клиническую значимость при проведении интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов
По результатам морфометрической оценки сперматозоидов с использованием нормативных величин, рекомендованных ВОЗ, сперматозоиды были разделены на две группы: с головками, соответствующими нормативным параметрам ВОЗ, и не соответствующими им. На основании нормативных величин, рекомендованных ВОЗ, были рассчитаны нормативы по дополнительным параметрам, позволяющим количественно выразить степень отклонения формы головки от правильного эллипса с ровными контурами, по размерам соответствующего головке нормального сперматозоида:
— площадь головки S = я axb, где а — большая ось головки, Ъ — малая ось головки; соответствующий нормативный интервал 7,85—13,75 мкм";
— периметр головки Р = лгх (а+Ь), где а - большая ось головки, Ъ — малая ось головки; соответствующий нормативный интервал 10,21—13,35 мкм;
— отношение периметра к площади (P/S), соответствующий нормативный интервал 0,97—1,3.
Кроме того, в соответствии с определенными ВОЗ нормальными величинами большой и малой осей головки сперматозоида, диапазон допустимых величин отношения длины к ширине бьш расширен до 1,42—1,75, поскольку при минимально допустимой величине малой оси (3,5 мкм) максимально допустимая величина большой оси (5 мкм) может наблюдаться лишь при их соотношении, равном 1,42.
Определили величины фактора формы круга, фактора формы эллипса, округлости и отношения периметра к площади — введенных нами параметров, позволяющих дать количественную характеристику форме сперматозоидов, — и сравнили их величины между группами сперматозоидов, соответствовавших и не соответствовавших строгим критериям ВОЗ. Результаты представлены в таблице 22.
Выявленные статистически достоверные различия между группами позволили определить величины, соответствующие значениям между 5-м и 95-м процснтилями и характеризующие сперматозоиды, форма которых была признана соответствующей критериям Крюгера при качественной оценке. Были определены интервалы этих величин для фактора формы круга (0,884-0,979 отн. ед.), фактора формы эллипса (0,995-0,999) и округлости (0,588-0,713). Эти значения были получены с учетом нормативных величин отношения периметра головки сперматозоида к его площади, рассчитанных по нормативным критериям ВОЗ (0,97-1,3).
Кроме того, была проведена компьютерная оценка отделов головок сперматозоидов - акросомы (таблица 23) и ядра (таблица 24).
Для акросом были определены интервалы (границами которых служили 5-й и 95-й процентили для сперматозоидов, оцененных как нормальные) по следующим параметрам, характеризующим их размеры и форму: периметр (7,42-10,15), большая ось (2,59-3,30), малая ось (1,89-2,83), отношение малой оси к большой (0,66-0,93), отношение периметра к площади (1,43-1,99), фактор формы круга (0,746-0,953), фактор формы эллипса (0,946-0,983) и округлость (0,605-0,805). Для ядра: периметр (7,56-10,1), большая ось (2,53-3,28), малая ось (1,95-2,82), отношение малой оси к большой (0,70-0,95), отношение периметра к площади (1,46-2,02). Полученные показатели могут быть использованы при автоматическом компьютерном морфологическом анализе сперматозоидов.
При подсчете относительного количества сперматозоидов, соответствующих перечисленным новым критериям, в группах пациенток, у которых перенос эмбрионов не привел к наступлению беременности (группа I) и пациенток, у которых наступление имплантации было зарегистрировано по данным УЗИ (группа II), была обнаружена меньшая частота встречаемости сперматозоидов с нормальным отношением периметра акросомы к ее площади в группе I (46,42% против 52,84% в группе забеременевших). В то же время, сперматозоидов с нормальным фактором круга было меньше в группе II (39,92% против 46,17%). Более полные данные представлены в таблице 25.
При сравнении данных, полученных при компьютерной морфологической оценке головок сперматозоидов в группах пациенток с произошедшей имплантацией и без имплантации, получены достоверные различия в значениях фактора формы круга, округлости, длины головки и соотношения большой и малой осей (таблица 26).
Границы, установленные по 5-му и 95-му процентилям в группе забеременевших, оказались шире, чем установленные на основе качественной оценки сперматозоидов: фактор формы круга 0,691-0,986; округлость 0,397-0,775; большая ось 3,85-6,77; отношение большая/малая ось 1,29-2,63.
По различиям в величинах, полученных при морфометрической оценке акросом (таблица 27), также было возможно выделить границы, соответствующие 5-му и 95-му процентилям в группе забеременевших: фактор формы круга 0,683-0,964; фактор формы эллипса 0,926-0,990; округлость 0,425-0,830; малая ось 3,85-6,77; отношение малая/большая ось 0,48-0,94; процент площади от площади всей головки 15,53-60,64.
