Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 6
2.1. Организация генома в соматических клетках 6
2.1.1. Упаковка ДНК с помощью гистонов 6
2.1.2. Петлевые домены 7
2.1.3. Организация митотических хромосом 8
2.1.4. Трехмерная организация генома в интерфазных ядрах 16
2.2. Организация генома в сперматозоидах 20
2.2.1. Упаковка ДНК с помощью протаминов 21
2.2.2. Гетерогенность хроматина сперматозоидов 23
2.2.3. Пространственная упорядоченность генома 24
2.2.4. Ремоделирование хроматина в ходе сперматогенеза у млекопитающих 31
3. Материалы и методы 37
4. Результаты и их обсуждение 38
4.1. Компактные хромосомные терр. внутриядерная локализация хромосом 41
4.2. В пределах хромосомной терр, хромосома имеет конформацию шпильки 44
4.3. Неслучайное расположение хромосомных изгибов 46
4.4 Устойчивость центромерного и теломерного доменов к деконденсации 49
4.5 Иерархическая структурная организация хромосом в сперматозоиде 52
4.6. Модель иерархической структурной организации хромосом в сперматозоиде человека 54
4.7 Заключение 56
5. Выводы 58
6. Список цитированной литературы 59
- Трехмерная организация генома в интерфазных ядрах
- Ремоделирование хроматина в ходе сперматогенеза у млекопитающих
- Компактные хромосомные терр. внутриядерная локализация хромосом
- Устойчивость центромерного и теломерного доменов к деконденсации
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Регуляция генной экспрессии в интерфазных ядрах эукариотических клеток осуществляется не только на уровне индивидуальных генов и хроматина, но и на ядерном уровне, включающем перемещение локусов в ядре посредством изменения крупномасштабной структуры хроматина (Van Driel et al., 2003). Поэтому изучение геномной архитектуры (трехмерной организации генома) интерфазных ядер - одно из важнейших направлений современой клеточной биологии.
В сперматозоидах человека - генетические активности подавлены. Репрессия репликации и транскрипции обеспечивается сверхкомпактной упаковкой ДНК специфическими для сперматозоидов белками -протаминами. Несмотря на это, и в ядрах сперматозоидов обнаружены элементы геномной архитектуры, а именно: 1) каждая хромосома занимает в ядре зрелого сперматозоида ограниченный объем - хромосомную территорию (XT) (Brandriff, Gordon, 1992; Haaf, Ward, 1995; Zalensky et al., 1995); 2) внутриядерная локализация этих территорий неслучайна (Luetjens et al., 1999; Hazzouri et al., 2000; Tilgen et al., 2001; Zalenskaya, Zalensky, 2004; Foster et al., 2005); 3) центромеры всех хромосом сосредоточены в центре ядра и образуют компактный хромоцентр (Zalensky et al., 1993, 1995; Haaf, Ward, 1995; Hoyer-Fender et al., 2000); 4) теломеры расположены на периферии ядра, где они взаимодействуют, образуя димеры (Zalensky et al., 1995, 1997; Meyer-Ficca et al., 1998; Hazzouri et al., 2000); 5) в большинстве случаев теломерные димеры образованы за счет взаимодействий концов одной и той же хромосомы, и, следовательно, хромосомы сложены наподобие шпильки (Solov'eva et al., 2004).
Какова роль геномной архитектуры в генетически неактивном ядре сперматозоида?
Локализация теломер на ядерной мембране может быть важна для процесса оплодотворения. После проникновения сперматозоида в ооцит, периферически расположенные теломеры сперматозоида - одни из первых
районов хромосом, экспонированных к ооплазме. Показано, что деконденсация отцовского хроматина зависит от управляемого микротрубочками движения мужского пронуклеуса к женскому (Sutovsky and Schatten, 2000). Взаимодействие теломер с микротрубочками было показано для дрожжей (Ding et al., 1998; Hiraoka, 1998). Таким образом, направляемое микротрубочками движение мужского пронуклеуса к женскому, осуществляется с участием теломер. Наконец, теломерные ассоциации (Zalensky et al., 1995, 1997) могут обеспечивать сохранение территориальной организации хромосом во время их деконденсации в яйцеклетке, наблюдаемое вплоть до стадии полностью развитого пронуклеуса (Brandriff, Gordon, 1992).
В хроматине спермиев человека 85 % ДНК связаны с протаминами, а 15 % ДНК - с гистонами (Gatewood, et al., 1990). Предположительно, распределение нуклеопротаминовых и нуклеогистоновых районов неслучайно. Показано, что гистоны ассоциированы с некоторыми кодирующими последовательностями (гены акрозина, бета-глобина, IGF-2 гены), а также с некодирующими повторами (Alu, центромеры и теломеры) (Wykes, Krawetz, 2003; Zalenskaya et al., 2000). Предполагают, что специфическое распределение гистонов и протаминов внутри ядра сперматозоида важно не только для трехмерной организации, но также может нести эпигенетическую информацию, например, маркировать набор генов, вовлеченных в ранний эмбриогенез (Gatewood et al., 1987). Так, эмбрион-специфический - и у-глбиновые гены обогащены гистонами в сперматозоиде, в то время как постнатально экспрессирующийся (3-глобиновый ген обогащен протаминами (Gardiner-Garden et al., 1998).
Таким образом, реорганизация мужского генома, активация и экспрессия отцовских генов после оплодотворения и на ранних стадиях эмбриогенеза зависит от их структурной организации и пространственной упаковки в сперматозоиде. Поэтому, изучение иерархической организации хромосом в ядре сперматозоида (хромосомной архитектуры) приобретает несомненную актуальность.
Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в выявлении новых элементов упорядоченной геномной архитектуры, характерных для зрелого сперматозоида человека методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
Проанализировать процесс декомпактизации хромосом 1, 2, 5 в искусственно деконденсированных ядрах сперматозоидов человека, моделирующий события, происходящие при оплодотворении.
Описать общую топологию и способ упаковки хромосом 1, 2, 5 и их плечевых доменов в искусственно деконденсированных ядрах сперматозоида человека.
Основные положения, выносимые на защиту
Хромосомы 1,2,5 имеют неслучайную локализацию в ядре сперматозоида человека.
В пределах XT хромосомы имеют конформацию шпильки: они изогнуты на 180 в области центромеры, а плечи сближены по всей длине.
Хромосомные изгибы локализованы неслучайно, что показано впервые в ядре сперматозоида.
Плечи хромосом шириной ~ 1000 нм сформированы из двух параллельных фибрилл хроматина. Каждая из фибрилл состоит из хроматиновых глобул диаметром 500 ± 70 нм, соединенных между собой более тонкими хроматиновыми нитями.
Предложена модель иерархической упаковки сперматозоидов, начиная от 500 нм хроматиновых глобул до компактной хромосомной территории.
Научная новизна работы
Впервые на сперматозоидах человека выполнена гибридизация in situ с хромосом-специфическими плечевыми пробами, что позволило визуализировать р- и q- плечевые домены внутри хромосомной территории.
Впервые описан процесс декомпактизации хромосом в искуственно деконденсированных ядрах сперматозоидов человека. Впервые изучена внутренняя организация хромосомного плеча в деконденсированном сперматозоиде и, на основании полученных результатов, предложена модель организации хромосом в ядре сперматозоида, заполняющая существующий пробел между представлениями об упаковке ДНК в нуклеопротаминовые тороиды и сведениями о крупномасштабной архитектуре ДНК и хромосом в ядре.
Теоретическое и практическое значение работы
Данные о структурной организации гаплоидного генома в сперматозоидах млекопитающих позволяют предположить, что вклад сперматозоида в процесс оплодотворения и раннего эмбриогенеза не ограничивается передачей генетической информации, закодированной в отцовской ДНК. Структура хроматина и способ упаковки хромосом в сперматозоиде - эпигенетические факторы, контролирующий вышеупомянутый процессы. Полученные в работе данные вносят существенный вклад в современные представления об организации генома в сперматозоидах человека, позволяют моделировать процессы деконденсации (реактивации) мужского генома, происходящие при оплодотворении и способствуют пониманию механизмов компактизации хромосом в пространстве ядра.
Материалы диссертации могут быть включены в курсы лекций по клеточной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано статей. Материалы работы доложены и представлены на следующих научных собраниях:
Конференция «Eastern Virginia Medical School Research Day Conference
Norfolk, VA (USA), October 1, 2004»
Конгресс «First International Cytogenetic and Genome Society Congress
Granada (Spain), June 14-18, 2005»
Конференция «Eastern Virginia Medical School Research Day Conference
Norfolk, VA (USA), October 1, 2005»
Конференция «British Andrology Society Annual Meeting on sperm function and
maturation Leeds, (UK), November 15-18, 2006»
Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на
научных семинарах Лаборатории стабильности хромосом и клеточной
инженерии и Лаборатории радиационной цитологии Института цитологии
РАН.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и
списка цитированной литературы, включающего ссылок. Материалы
Трехмерная организация генома в интерфазных ядрах
Co скэффолдом связаны фрагменты ДНК, названные SARs (scaffold-associated regions) (Mirkovich et al., 1984; Gasser, Laemmli, 1987; Garrard, 1990; Laemmli et al., 1992) или MARs (matrix attachment regions) (Razin, 1996; Cockerill, Garrard, 1986). Предположительно, они являются участками, находящимися в основании петель, за счет которых петли прикрепляются к скэффолду или ядерному матриксу, соответственно.
Было показано, что основу белкового скэффолда составляют негистоновые белки, в том числе топоизомераза II (Earnshaw, Heck, 1985; Gasser et al., 1986) и SMC2 белки (structural maintenance of chromosomes) (Saitoh etai.r 1994; Strunnikov et al., 1995), CAP - E субъединица кондексинового комплекса (Hirano, 2002). Иммунное окрашивание неэкстрагиров энных хромосом и in vivo наблюдения подтвердили наличие топоизомеразы II и конденсинов в аксиальном коре метафазных хромосом (Tavormina et al., 2002; Maeshima, Laemmli, 2003; Ono et al., 2003). Участие конденсинов в сборке хромосом было продемонстрировано в в бесклеточном экстракте из яиц Xenopus (Hirano et al., 1997). Генетический анализ продемонстрировал in vivo роль субъединиц конденсина в хромосомной организации и сегрегации (Swedlow, Hirano, 2003). Показано, что SMC2 играет функциональную роль в стабилизации структуры метафазной хромосомы (Hudson et al., 2003).
Однако, ряд экспериментов противоречит модели радиальных петель. Так, топоизомераза II может быть легко экстрагирована в физиологическом буфере из собранной in vitro хромосомы без заметных изменении в хромосомной структуре (Hirano, Mitchison, 1993). Изучение динамики in vivo топоизомеразы ІІ с использованием белка GFP показало, быстрое восстановление GFP-топоизомеразы II связанной с митотическими хромосомами после photobleaching, что ставит под сомнение существование in vivo топоизомеразы II, как иммобилизованного компонента статичного структурного скаффолда (Tavormina et al., 2002; Christensen et al., 2002). Почти полный нокдаун экспрессии SMC2 конденсиновой субъединицы путем РНК интерференции не выявил заметных дефектов в степени компактизации, если интактные митотические хромосомы не подвергались гипотонической обработке (Gassmann et al, 2004), дефекты структуры метафазной хромосомы, обнаруживались, лишь когда хромосомы были распластаны после гипотонической обработки (Hudson et al., 2003). Существует точка зрения, согласно которой ядерный матрикс и хромосомный скэффолд являются артефактами и формируются в результате тотальной деструкции хроматина и нехроматиновых субдоменов ядра, вызывающей перераспределение и неспецифическую агрегацию негистоновых белков (Pederson, 2000). Подтверждением этому являются опыты по фотостабилизации хроматина. Хромосомный скэффолд, как известно, отчетливо виден после экстракции гистонов (Paulson, Laemmli 1977). Примерно такие же условия необходимы для визуализации ядерного матрикса (Berezney, Coffey 1974). Показано, что облучение ядер и митотических хромосом видимым светом в присутствии бромистого этидия, при котором происходит избирательная стабилизация хроматина не приводит к выявлению матрикса в интерфазных ядрах, или осевого скэффолда в митотических хромосомах (Sheval et al., 2002).
Вариантом радиально-петлевой модели является модель, по которой 30 нм нить упаковывается в профазные хроматиды, согласно классической радиально-петлевой модели, а затем сама профазная хроматида (белковый скэффолд) спирализуется с образованием метафазной хромосомы (Boy de la Tour, Laemmli, 1988). Однако недавние эксперименты показали, что спирал изация присутствует только в гиперконденсированных метафазных хромосомах, изолированных из клеток, остановленных на стадии метафазы (Maeshima, Laemmli, 2003).
Во многих ранних микроскопических исследованиях, было показано, что структурную основу метафазных хромосом у ряда растений и животных составляют фибриллы, диаметром 100 - 120 нм, названные из-за способности адсорбировать некоторые основные красители - хромонемами. Термин хромонема ("chromonema") является обобщенным для различных типов фибриллярных хроматиновых структур безотносительно к их строению. Хромонемы были выявлены на разных стадиях клеточного цикла, что позволило предположить их стабильность как «элементарных» структурных комплексов в клеточном цикле (Zatsepina et al., 1983; Belmont et al.,1987, 1989). Хромонемы были выявлены прижизненно в интерфазной клетке (Robinett et al., 1996).
С помощью световой микроскопии и электронной .микроскопии срезов клеток Бельмонт с соавторами (Belmont, Bruce, 1994) обнаружил, что деконденсация хроматид ы во время прохождения клеткой G1 фазы связана с последовательным раскручиванием и выпрямлением 100 - 130- нм «хромонемных» фибрилл более высокого порядка. В ранней G1 фазе преобладал один класс фибрилл - 100-130 нм в диаметре, в поздней G1, ранней S фазе другой - 60-80 нм фибриллы. Локальные раскручивания 60-80 нм фибрилл, на участках ДНК от 10 до 100 т.п.о.обнаруживали более рыхло уложенные 20 - 30 нм фибриллы. Описанные выше наблюдения привели к созданию модели иерархического складывания хромонемной фибриллы. Согласно этой модели 30 нм фибриллы изгибаясь и скручиваясь образуют 60 - 80 - нм фибриллы, которые в свою очередь компактизируются в 100 130 нм хроматиновые нити. Последние укладываются в 200-300 нм {диаметр профазных хроматид) нити, которые затем сворачиваются в 500 нм структуру митотической хромосомы. Основной механизм конденсации/ деконденсации хромосомы заключается в скручивании/раскручивании хромонемы и не зависит от формирования протеинового скаффолда (Belmont et al., 1999). Модель была подтверждена демонстрацией того, что все стадии хромосомной конденсации во время профазы соответствуют последовательному утолщению нитей (Kireeva et al., 2004).
Усовершенствованным вариантом модели иерархического складывания является " hierarchical folding, axial giue model" (Kireeva et a!., 2004). Сопоставление стадий конденсации хромосомы в профазе с динамикой хромосомных белков, участвующих в конденсации, а именно, топоизомеразы Паи конденсиновой субъединицы SMC 2, показало, что в ранней и средней профазе топоизомераза Паи SMC 2 не занимают осевого положения, и, следовательно, вряд ли могут быть элементами хромосомного скэффолда. Роль динамического осевого скелета скорее выполняет сеть межхромати новых сшивок. В поздней профазе и метафазе топоизомераза II а и конденсиновая субъединица SMC 2 занимают центральное, осевое расположение. Таким образом, осевая локализация этих белков устанавливается только в поздней профазе, уже после формирования равномерно конденсированной среднепрофазной хромосомы и может служить для скрепления иерархически уложенных фибрилл в метафазной хромосоме. Изначальное сворачивание хроматиновых нитей с откреплением их от ядерных структур завершается конденсацией в униформную крепкую среднепрофазную хроматид у 200 300-н-м "диаметром. Второе скручивание- этой "среднепрофазнои хроматиды в "ходе поздней профазы и прометафазы дает конечную метафазную хромосому. При переходе от среднепрофазнои хроматиды к метафазнои хромосоме формируется аксиальное распространение топоизомеразы И и конденсинов. Образуется динамический хромосомный кор, обеспечивающий стабильность хромосомы (рис.1).
Ремоделирование хроматина в ходе сперматогенеза у млекопитающих
Интерфазные хромосомы сохраняют топологическую индивидуальность и занимают отдельные территории, названные хромосомными территориями (XT). Существование XT, с одной стороны - результат неполной деконденсации митотических хромосом, и отражает их существование в митозе как индивидуальных единиц, с другой стороны - результат иммобилизации («заякоривания») интерфазных хромосом такими структурными элементами ядра, как ядерная ламина (Baricheva et al., 1996; Paddy et al., 1990; Goldman et al., 2002), ядерные поры (Sukegawa, Blobel, 1993) или ядерный матрикс (Ma et al.,1999). Входя в интерфазу, хромосомы незначительно деконденсируются и не переплетаются с другими хромосомами (Cremer et al., 1993; Sadoni еГаЬ ЭЭЭ; Visseretal,, 2000).- Показано, что структура-штотических хромосом и XT очень близки. Так, плечевые домены и специфические бзнды митотических хромосом сохраняют свою индивидуальность внутри хромосомной территории, не переплетаясь с другими, расположенными поблизости соседними доменами (Dietzel et al., 1998; Sadoni et al., 1999;). Хорошо известные G- и R- бэнды, чередующиеся на митотических хромосомах и отражающие функциональную компартментализацию генома, также сохраняются в интерфазе как отдельные домены. R-бзнды различных хромосом представляют собой кластеры рано реплицирующейся ДНК, они транскрипционно активны и направлены внутрь ядра, G/C-бэндам соответствуют транскрипционно неактивные, поздно реплицирующиеся компартменты на периферии ядра, в перинуклеарном и перинуклеолярном пространстве (Sadoni et al.,1999). Это согласуется с фактом, что G - бэнды показывают низкую плотность генов, большинство из которых не экспрессируется, а С - бэнды содержат высокоповторяющиеся последовательности (Bickmore, Sumner, 1989; Craig, Bickmore, 1993). R - бэнды обогащены генами и, в особенности, активными во время интерфазы генами (Bickmore, Sumner 1989; Cross et al., 1997).
Ядерные компартменты высокого порядка, содержащие ДНК со специфическим временем репликации устанавливаются сразу после митоза, в поздней телофазе, ранней Єіфазе (Ferreira et al., 1997). Большую часть клеточного цикла хромосомы и хромосомные, локусы неподвижны (Walter et al., 2003, Gerlich et al., 2003; Vazquez et al., 2001; Zink et al., 1998; Manders et a!., 1999). Исключение составляет ранняя G1 фаза. (Walter et al., 2003). У Drosophila и млекопитающих отмечено возрастание мобильности хромосом и генных локусов в G1, во время которой устанавливается ядерная архитектура (Bridger et al., 2000; Csink, Henikoff. 1998 Tumbar, Belmont. 2001). Можно предположить, что в начале G1 происходит реставрация контактов хроматина с ядерной оболочкой, после их разрушения в митозе.
Пространственное расположение хромосомных территорий в ядре - неслучайно. Поляризованная ориентация интерфазных хромосом, когда все центромеры собраны на одном полюсе ядра, а теломеры - на противоположном (Rabl orientation) наблюдается в клетках дрозофилы (Marshall-et al., 1996), у некоторых растений и дрожжей (Abranches et al., 1998). У млекопитающих расположение хромосом, скорее, может быть описано их неслучайным радиальным позиционированием по отношению к центру ядра (Cremer et al., 2001; Parada, Mistelli, 2002; Kozubek, 2002; Cremer et al., 2003). В качестве детерминанты радиального позиционирования хромосом одни исследователи называют плотность генов на хромосоме { хромосомы с большей плотностью генов располагаются ближе к центру ядра, с меньшей ближе к периферии) (Boyle et а!., 2001; Cremer et al., 2003; Croft et at., 1999; Habermann et al., 2001; Tanabe et al., 2002), другие - размер хромосом (Sun et al., 2000; Cremer et al,, 2001; Bolzer et al., 2005). Помимо неслучайного радиального позиционирования, хромосомы локализованы неслучайно по отношению друг к другу (Parada et al., 2002; Parada, Mistelli, 2002; Roix et al,, 2003; Kozubek et al,, 1999). Например, в клетках лимфобластоиднои клеточной линии были обнаружены неслучайные сближения между отдельными хромосомными локусами и показано, что сближение двух локусов коррелирует с частотой реципрокных транслокаций между этими локусами (Roix et al., 2003). Согласно другим работам, взаимное расположение хромосом случайно (Cornbluth et al., 2003; Mayer et al„ 2005).
Сохраняется ли неслучайное расположение хромосом в клеточном цикле? Использование двумя разными группами исследователей (Gerlich et al., 2003; Walter et al., 2003) сходного экспериментального подхода показало умеренные, но значимые изменения позиций хромосом в дочерних клетках по сравнению с родительскими. Герлих с соавторами (Gerlich et al., 2003) интерпретировали это наблюдение как то, что информация о внутриядерной позиции хромосом и, следовательно, их взаимная локализация наследуются дочерними клетками. По мнению Вальтера и др. (Walter et al., 2003), информация о взаимном расположении хромосом при делении утрачивается, а радиальное (но не взаимное) позиционирование устанавливается в дочерних клетках заново в ранней G1 фазе. Локализация хромосом в интерфазном ядре- это статистически усредненный параметр. Он не дает точных координат данной хромосомы в данной клетке, а описывает преимущественную, вероятную локализацию хромосомы в ядре. Умеренные изменения в расположении хромосом во время митоза, выявленные обеими группами, легко объяснимы, если учесть вероятностный характер хромосомного позиционирования (Parada et al., 2003),
Факт неслучайного позиционирования хромосом и генов в ядре -фундаментальное, плохо изученное свойство организации генома. Позиция некоторых хромосом эволюционо консервативна и, значит, может иметь функциональное значение (Tanabe et al., 2002). Возможно, что неслучайное расположение хромосом отражает привлечение генных локусов к ядерным компартментам в которых факторы транскрипции и процессинга локально концентрированы (Chubb, Bickmore.2003).
Гомогенность окрашивания индивидуальных хромосомных территорий, наблюдаемая при флуоресцентном микроскопировании, и ограниченная разрешающая способность флуоресцентной микроскопии, привели к созданию модели «Хромосомная территория - интерхроматиновое пространство» (СТ - 1С, Chromosome territory -Interchromatine domain). Согласно этой модели, XT - очень плотное образование, пронизаное каналами разных размеров, что создает большую поверхностную площадь (пористость) XT и обеспечивает доступность ДНК для регуляторных факторов как на поверхности XT, так и внутри нее (Cremer, Cremer 2001, Parada, Misteli 2002). Пространство между хромосомными территориями представляет собой интерхроматиновое пространство или интерхроматиновый домен (1С - interchromatin space or domain). Транскрипция происходит на границе XT с интерхроматиновым пространством.
Компактные хромосомные терр. внутриядерная локализация хромосом
Работы нескольких лабораторий показали, что ДНК спермиев, подобно ДНК соматических клеток, организована в петлевые домены, прикрепленные своими основаниями к элементам ядерного матрикса (Getzenberg et al., 1991; Ward, Coffey 1991; NadeletaL, 1995; Choudhary et al., 1995; Kramer, Krawetz, 1996; Yaron et al„ 1998). Организация петлевых доменов в сперматозоидах отличается от таковой в соматических клетках. При обработке ядер сперматозоидов 2М NaCI, вокруг ядер формируется «гало» (halo), состоящее из петель ДНК. Размер «гало» вокруг ядер сперматозоидов человека и хомяка, был на 50% меньше, чем в соматических тканях того же вида, т.е. соответствовал петлевым доменам размером 26.8 ± 2.1 т.п.о.(Вагопе et al., 1994). Показано, что один и тот же ген в сперматозоиде и соматической клетке организован неодинаково. Так, у хомяка 5S рибосомалъньш кластер ДНК образует три петли в сперматозоидах и формирует только одну петлю в клетках печени (Nadel et al., 1995), Организация ДНК в петлевые домены является кпеткоспецифичной и изменяется во время развития (Kalandadze et а!., 1990; Nadel et al., 1995; Klaus et al., 2001). В соматических клетках петлевой домен может представлять собой отдельный репликон (Dingman, 1974; Cook, 1991; Hancock, 1982). Размер петель ДНК в различных видах положительно коррелирует с размером репликона (Buongiorno-Nardelii et al., 1982).Ткани эмбриона имеют меньшие репликоны, чем ткани взрослого организма {Flickinger et al., 1986)
Как и у соматических клеток, в основании петлевых доменов находятся особые последовательности ДНК, которые обеспечивают связь ДНК с ядерным матриксом, так называемые MARs (Kalandadze et al., 1989; Ward, Coffey 1991; Choudhary et al., 1995). Предполагают, что MARs являются нуклеогистонами (Ward, Ward, 2004).
На основании сходства размера петлевого домена с количеством ДНК, упакованной в тороид Вардом (Ward, 1993) была предложена модель (donut-loop модель), согласно которой во время спермиогенеза каждый петлевой домен превращается в один тороид (Ward, 1993; Ward, Zalensky, 1996). При этом MAR-регионы, сохраняют стабильность и избегают удаления гистонов в сперматогенезе (Klaus et al. 2001). В зрелом сперматозоиде MARs оказываются лежащими между тороидами и выполняют роль линкеров ("toroid-linker regions"), связывающих тороиды между собой. ДНК, упакованная в тороиды более устойчива к воздействию ДНК нуклеаз (Dean, 1983), ультразвуковому воздействию (Kuretake et .al., 1996) и другим повреждающим воздействиям, чем линкерные регионы. Это было подтверждено экспериментально: минимальный размер фрагментов полученных после обработки сперматозоидов ДНКазами был равен 40 - 50 т.п.н. (Sotolongo et al., 2003), что соответствует размеру ДНК - протаминового тороида (Hud et al., 1993, 1995).
Петлевая организация ДНК в соматических клетках важна для репликации ДНК и транскрипции РНК (Getzenberg et al., 1991). В зрелом сперматозоиде ни один из этих процессов не происходит. Тем не менее, петлевые домены сохраняются, и могут быть важны для функционирования отцовского генома при оплодотворении. Подтверждением может служить эксперимент, проведенный на мышах (Sotolongo, Ward, 2000). Сперматозоиды с сохраненной и нарушенной петлевой организацией (сама молекула ДНК при этом не повреждалась) были инъецированы в ооциты и,затем, пересажены в самок мышеи для вынашивания. Эмбрионы, полученные из сперматозоидов с сохраненной петлевой организацией дали 30% живых рождений, в то время, как эмбрионы, полученные от сперматозоидов с нарушенной петлевой организацией погибали в 100% случаев.
Лавитрано и соавторы (Lavitrano et al.,1989) в 1989 году опубликовали работу о способности зрелого сперматозоида взаимодействовать с чужеродной ДНК. Эта же группа авторов представила доказательства того, что живые сперматозоиды захватывают и «интернализируют» в ядре радиоактивно меченую чужеродную ДНК (Francoiini et al., 1993; Zani et al., 1995), где она способна встраиваться в хроматин (Zoragi, Spadafora, 1997; Spadafora, 1993). На мышиных сперматозоидах показано прочное связывание чужеродной (плазмидной) ДНК с определенными регионами ядерного матрикса (McCarthy, Ward, 2000).
Как согласуется способность сперматозоидов интернализировать чужеродную ДНК с основной функцией мужской гаметы: безопасно доставить неизмененную генетическую информацию к женской гамете? Предполагают, что захват чужеродной ДНК может служить косвенным доказательством существования какого-то иного, жизненно важного механизма у сперматозоида, например, механизма защиты от вторжения чужеродной ДНК, путем разрушения ее нуклеазами (Maione et al., 1997).В ДНК зрелого сперматозоида были обнаружены двунитевые разрывы (DSB - double strand breaks)(Gorczyca et al., 1993; Lopes et al.,1998), и было показано, что присутствие этих разрывов коррелирует с бесплодием у человека (Manicardi et al., 1995; Sakkas et al., 2002). Предполагают, что эти разрывы появляются во время спермиогенеза, когда гистоны замещаются протаминами, и их сохранение в сперматозоидах отражает нарушение механизмов репарации (Магсоп, Boissonneault, 2004). Альтернативная точка зрения состоит в том, что зрелые сперматозоиды содержат нуклеазы, которые в определенных условиях могут быть активированы (Maione et ai., 1997; Tateno et al., 2000; Sakkas et al., 2002). Существование эндогенных нуклеаз показано в спермиях хомяка, мыши и человека (Sotolongo et al., 2003). Некоторые исследователи предполагают существование в сперматозоиде апоптоза (Sakkas et al., 1999; Blanc-Layrac et al., 2000; D Cruz et al„ 2000; Cayli et al, 2004; Martin et al., 2004; McVicar et al., 2004). Предложена (Spadafora,1998) модель структуры хроматина сперматозоидов, объясняющая, как сверхкомпактная, биологически инертная ДНК сперматозоидов может взаимодействовать с чужеродной ДНК или подвергаться сперм специфическому апоптозу (рис. 5). Согласно этой модели, большие тороидальные структуры, содержащие от 20 до 100 т.п.н. ДНК, связанной с протаминами, разделены более короткими спейсерами из ДНК, связаной с гистонами. Нуклеогистоновые спейсеры имеют гораздо более открытую конфигурацию и являются «активными фокусами хроматина». При конденсации в спермиогенезе не происходит полной замены гистонов на протамины, а сохраняются небольшие островки нуклеогистонов, способные к активностям соматического хроматина. В этих активных фокусах происходит апоптотическая деградация ДНК, в эти регионы может встраиваться чужеродная ДНК. Эти линкерные регионы являются (MARs) регионами (Ward, Ward, 2004).
Устойчивость центромерного и теломерного доменов к деконденсации
Явление импринтинга заключается в том, что гены импринтинга эпигенетически маркируются в гаметогенезе так, чтобы в потомстве экспрессироваться или только с отцовской, или только с материнской аллели. Маркирование генов происходит путем метилирования ДНК на одной (отцовской или материнской) аллели. Метилируется остаток цитозина в динуклеотидных мотивах, содержащих 5" цитозин и гуанин (CpG) в DMRs (differently methylated regions) или ICRs (imprinting control regions). Метилирование требует активности ферментов - метилтрансфераз (Dnmts).
Во время раннего эмбрионального развития родительские импринты стираются в примордиальных зародышевых клетках и затем заново устанавливаются во время женского и мужского гаметогенеза. Установление de novo специфического метилирования различается в женских и мужских гаметах. Материнский импринт устанавливается во время роста ооцита в отсутствие ДНК репликации (Obata, Копо, 2002; Lucifero et a!., 2004). Установление мужского специфического метилирования длительный процесс, происходящий как в митотически делящихся сперматогониальных стволовых клетках, так и в ранних сперматоцитах (Davis et al., 1999, 2000; Kerjean et al., 2000; Ueda et al., 2000). Эта хронология образования метилированных импринтов кореллирует с потенциалом первичных сперматоциов давать потомство при пересадке их в зрелый ооцит (Kimura et al., 1998). В установлении мужского импринта участвуют метилтрансфераза Dnmt3a и ее кофактор Dnmt3L
Затрагивается ли структура хроматина в ходе установления отцовского импринта? Несмотря на то, что прямых наблюдений модификации хроматина в регионах отцовского имлринтинга в ходе сперматогенеза (кроме различного ДНК метилирования) нет, ряд косвенных данных позволяет предположить, что она имеет место. Так, например, Dnm3a и Dnmt3L - белки корепрессоры - могут взаимодействовать с гистоновыми диацетилазами (HDACs), которые участвуют в подавлении транскрипции путем формирования транскрипционно репрессивной структуры хроматина (Fuks et al., 2001; Aapola et al., 2002); нарушение взаимодействия Dnm3a с диацетилазами (HDAC1/2), нарушает способность диацетилаз подавлять транскрипцию (Ling et al., 2004). В соматических клетках, хроматин импринтинговых регионов имеет специфические свойства: на аллели с метилированной ДНК, ICRs показывает гипоацетилирование гистонов НЗ и Н4, в то время как на аллели без ДНК метилирования, хроматин шперацетилирован (Gregory et al., 2001; Delaval, Feil, 2004). Хотя ДНК метилирование - наиболее вероятный кандидат для передачи импринтов потомству, импринтинг, по-видимому, включает и другие эпигенетические модификации хроматина. Известно, что сразу после оплодотворения происходит глобальное деметилирование отцовского генома. Маркирование генов в сперматогенезе могло бы включать в себя специфическую модификацию гистонов, которая в свою очередь, защитила бы эти метилированные импринты от глобального деметилирования( by recruiting a "protective" factor), или сама по себе несла бы импринтинговую информацию, которая трансформировалась бы в метилированные импринты в ходе раннего эмбрионального развития.
Показано, что в ходе мейоза нуклеосомы подвергаются изменениям вследствие включения гистоновых вариант и лосттрансляционной модификации гистонов. Какова функция этих вариант и модификации гистонов? Показано, например, что Н2АХ -вариант корового гистона Н2А и его фосфорилированная форма могут быть прямо вовлечены в ДНК "cleavage" и рекомбинацию между гомологичными хромосомами (Mahadevaiah et al.,2001; Celeste et al.,2002). Rad 6-зависимая убиквитинация H2B важна для образования DSBs (Yamashita et al., 2004). Поскольку Rad 6-зависимая убиквитинация H2B необходима также для метилирования лизина 4 в гистоне НЗ (Fischle et al., 2003), эти два события могут быть связаны между собой.
Механизм, посредством которого посттрансляционные модификации способствуют формированию DSBs, пока не ясен. Гипотетически, эти модификации могут в разной мере затрагивать горячие и холодные точки мейотической рекомбинации, инициируя или предотвращая формирование DSBs в соответствующих регионах (Petes, 2001; Kleckner et al., 2004).
Плохо изученным специфическим свойством мужского мейоза является частичное спаривание X и У хромосом в псевдо-аутосомный регион и его инактивация. Этот процесс сопровождается локальной модификацией хроматина, включая «гетерохроматинизацию» в так называемый половой пузырек ("sex-vesicle" или "X - Y body"). Показана связь с половым пузырьком гистона Н2А1.2 (варианта Н2А) и гетерохроматинового белка 1 (НР1), что, возможно, важно для его гетерохроматинизации (Hoyer-Fender 2003). В отличие от женской соматической инактивированной X хромосомы, демонстрирующей гипоацетилирование гистона Н 4, для полового пузырька характерно отсутствие гипоацетилирования гистона Н 4 (Armstrong et al., 1997). Хотя функция sex vesicle в мейозе неясна, экспериментальные данные свидетельствуют о важности его для хода сперматогенеза.
Созревающий сперматозоид подвергается одному из уникальных процессов перерстройки хроматина - замене гистонов на протамины, которое изменяет форму ядра и компактизирует хроматин. Во время этого процесса, большинство соматических гистонов замещаются ДНК упаковочными белками - которые уникальны для мужских гамет - транзиционными белками, которые затем замещаются протаминами. Включение протаминов в сперматозоиды индуцирует компактизацию ДНК с последующим удалением цитоплазмы и формированием акросомы и жгутика. Соматические линкерные гистоны заменяются тестис-специфическими вариантами, а затем большинство гистонов - протаминами.
Предполагают, что переходные белки готовят хроматин для связывания с протаминами.В ходе развития постмейотического гаплоидного сперматида, транзиционные белки становятся важным компонентом хроматина. После удаления гистонов и до появления протаминов переходные белки составляют 90% всех белков хроматина. Наиболее изученные из этих белков - переходный белок 1 и переходный белок 2 представляют 55% и 40% всех белков сперматидов соответственно. Переходный белок 1 - маленький основной белок из 54 пар оснований, богатый аргинином, лизином и серином. Переходный белок 2, вдвое большего размера, чем белок 1 обогащен основными остатками на С конце и предположительно содержит два цинковых пальца на амино конце. Мутантные по транзиционным белкам 1 и 2 мыши имеют низкую способность к оплодотворению, но все же способны давать потомство, что свидетельствует о перекрывающейся функции этих белков (Yu et al., 2000; Zhao et al., 2001).
