Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение структурной организации субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом является одним из наиболее важных и активно развивающихся разделов современной биологии. Однако до настоящего времени остаются не решенными многие ключевые вопросы. Прежде всего, речь идет о проблеме компактизации ДНК в составе митотических хромосом (Q. Bian et al., 2012). За более чем столетнюю историю изучения сменилось несколько общепринятых и, как казалось, окончательных гипотез, однако уровень наших сегодняшних знаний в этом чрезвычайно важном вопросе явно недостаточен.
Наибольшее распространение получили две модели, принципиально по-разному трактующие морфологию хромосом (рис. 1). Первая из них, радиально-петельная модель, была сформулирована в 1977 году группой У. Лэммли (U.K. Laemmli et al., 1977), и в течение двух десятилетий эта модель была общепринятой (J.R. Swedlow, T. Hirano, 2003). Ключевая идея данной модели состоит в том, что в интерфазных и митотических хромосомах имеются скелетные структуры – ядерный матрикс (nuclear matrix) в интерфазе и хромосомный скэффолд (chromosome scaffold) в митозе, устойчивые к экстракции 2 M NaCl или полианионами. В составе митотических хромосом негистоновые белки, которые формируют скэффолд, локализуются в аксиальных областях. К скэффолду прикрепляется ДНК, формируя петлевые домены, компактизирующиеся при участии гистоновых белков (рис. 1А).
Вторая модель, получившая широкое распространение в последнее десятилетие, – хромонемная модель или модель иерархического фолдинга. Современная интерпретация хромонемной модели отталкивается от многократно повторенных наблюдений о существовании в составе митотических хромосом 100–130 нм фибрилл – элементарных хромонем (E. Sparvoli et al., 1965; Ю.С. Ченцов, В.Ю. Поляков, 1974; A.S. Belmont et al., 1989; A. Matsuda et al., 2010). Недавно было показано, что кроме хромонем в составе хромосом можно выявить еще один уровень компактизации ДНК – фибриллы толщиной около 250 нм (Y.G. Strukov et al., 2003) или профазные хроматиды (N. Kireeva et al., 2004). Таким образом, в хромонемной модели хромосома трактуется как система иерархически соподчиненных уровней последовательной
Рис. 1. Актуальные модели структурной организации митотических хромосом. (А) – радиально-петельная модель. Хромосомный скэффолд локализуется в осевой области хромосом и играет роль белкового скелета. Фибриллы ДНК периодически взаимодействуют со скэффолдом, образуя петлевые домены. (Б) – хромонемная модель (модель иерархического фолдинга). Данная модель рассматривает митотическую хромосому как результат последовательного сворачивания молекулы ДНК в ряд иерархически соподчиненных фибриллярных структур – нуклеосомная фибрилла, фибрилла диаметром 30 нм, элементарная хромонема, профазная хроматида.
компактизации хроматина (нуклеосомная фибрилла 30 нм фибрилла элементарная хромонема профазная хроматида метафазная хроматида).
По-видимому, различия между этими двумя моделями являются отражением экспериментальных подходов, использовавшихся для изучения структуры хромосом (A.S. Belmont et al., 2002). Так, хромонемная модель основана на изучении нативных хромосом при фиксации in situ, причем, основной массив информации получен при анализе структуры компактизирующихся профазных и деконденсирующихся телофазных хромосом (Ю.С. Ченцов, И.Ю. Поляков, 1974). Важные наблюдения сделаны при искусственной деконденсации метафазных хромосом (O.V. Zatsepina et al., 1983). Данные о радиально-петельной организации хромосом получены на модели обработанных экстрагирующим раствором метафазных хромосом (J.R. Paulson, U.K. Laemmli, 1977). В этом контексте чрезвычайно актуальным представляется получение экспериментальных данных о структуре ключевого компонента радиально-петельной модели, хромосомного скэффолда, на разных этапах митоза с использованием электронно-микроскопических и иммуноцитохимических методов анализа (т.е. методов, которые оптимальны для анализа нативных хромосом).
В последние десятилетия накоплен огромный объем экспериментальных данных о еще одном структурообразующем компоненте ядра – ядерной оболочке, которая во многом определяет трехмерную упорядоченность клеточного ядра и протекающих в нем процессов (V. Butin-Israeli, 2012). Механизмы формирования этого “внешнего скелета” ядра изучены слабо. Изучение этого вопроса представляется крайне актуальным, так как формирование ядерной оболочки является одной из предпосылок последующего формирования трехмерной упорядоченности внутреннего пространства интерфазного ядра.
Цель исследования
Целью настоящей работы является изучение морфологической организации и механизмов формирования и поддержания структурной целостности субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом.
Задачи исследования
1. Исследовать структурную организацию хромосомного скэффолда с использованием методов световой и электронной микроскопии.
2. Охарактеризовать морфологию промежуточных уровней компактизации хромосом с использованием методов полной и частичной экстракции белков хроматина.
3. Определить характер взаимодействия компонентов перихромосомного слоя с остаточными структурами на протяжении митоза.
4. Изучить эффекты гиперэкспрессии белков ламина В1, ламина А, pom121, ndc1 и Lap2 на формирование ядерной оболочки и связанных с ней структур.
5. Выявить влияние высокой концентрации антигена на доступность внутренних районов ядрышка для специфических антител.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые установлено, что хромосомный скэффолд состоит из двух структурных доменов – периферического и аксиального. С использованием иммуноэлектронной микроскопии показано, что аксиальный домен хромосомного скэффолда содержит топоизомеразу II, периферический домен содержит белки перихромосомного слоя (pKi-67, фибрилларин, В23/нуклеофозмин).
Разработан и апробирован оригинальный воспроизводимый метод изучения морфологии остаточных (устойчивых к экстракции) структур на всех этапах митоза. Впервые детально охарактеризована ультраструктурная организация компонентов ядерного матрикса и хромосомного скэффолда, образованных белками перихромосомного слоя. Показано, что на всех этапах митоза существуют остаточные структуры, содержащие белки В23/нуклеофозмин и pKi-67, напротив, диффузно-распределенный нуклеоплазматический белок, не связанный со своими функциональными сайтами, под действием солевого раствора экстрагируется. Это позволяет использовать процедуры экстракции для выявления фракций белков, связанных с функциональными сайтами.
Представлены экспериментальные данные в пользу упорядоченной упаковки петлевых доменов, и получены свидетельства участия в их компактизации негистоновых белков, не входящих в состав остаточных структур. На основании полученных результатов предложена оригинальная модель организации митотических хромосом, учитывающая как существование хромосомного скэффолда и петлевых доменов, так и высших уровней компактизации хроматина (хромонем и хромомеров).
Впервые установлено, что остаточные структуры конститутивного гетерохроматина, формирующего в интерфазных ядрах фибробластов мыши хромоцентры, обладают особой ультраструктурной организацией, позволяющей отличать их от остальной сети ядерного матрикса. Ядерный матрикс фибробластов мыши состоит из четырех морфологически различимых структурных компонентов – ламина, остаточные ядрышки, внутренняя сеть ядерного матрикса и матрикс хромоцентров.
Установлено, что гиперэкспрессия отдельных белков ядерной ламины (ламина В1 и ламина А), нуклеопоринов (pom121 и ndc1) и внутренней мембраны ядерной обололочки (Lap2) влияет на формирование клеточных структур. При этом могут изменяться морфологические признаки не только тех структур, в состав которых входят изучаемые белки в норме, но и связанные с ними структуры. Влияние отдельных белков на биогенез структур свидетельствует в пользу того, что формирование ядерной оболочки происходит по пути самоорганизации.
Предложен оригинальный метод выявления белков в клеточных структурах малодоступных для антител в силу высокого содержания в них антигенов. Показана его совместимость с одновременным анализом флуоресцентных белков и с иммуноэлектронной микроскопией.
Результаты работы используются в практическом курсе “Цитогенетика” и лекционных курсах “Клеточная биология” и “Гистология” Факультета биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Хромосомный скэффолд состоит из двух структурно-обособленных доменов – аксиального и периферического.
2. Петлевые домены в составе хроматина компактизируются в упорядоченные надмолекулярные комплексы.
3. Компоненты перихромосомного слоя входят в состав остаточных структур (ядерного матрикса и хромосомного скэффолда) на протяжении всего клеточного цикла.
4. Формирование ядерной оболочки как интегрированной надмолекулярной системы происходит по типу самоорганизации.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на семинарах отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, на Московском семинаре по клеточной биологии, семинаре в Институте общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН, семинаре в Институте молекулярной генетики РАН, Съездах общества клеточных биологов (2003, 2007, 2012), Всероссийских совещаниях “Структура и функции клеточного ядра” (2005, 2010), Всероссийской конференции “Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет” (2011), Российских конференциях по электронной микроскопии (2008, 2010), Всероссийском конгрессе “Симбиоз-2009”, международной конференции с элементами научной школы “Современные проблемы бионаноскопии” (2011), совещаниях по структуре клеточного ядра (The Wilhelm Bernhard Workshop, 2005, 2011, 2013), конференциях по молекулярной биологии пикорнавирусов (Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, 2006, 2008), международной летней школе “Взаимодействие патогена и хозяина” (International Summer School “Pathogen-Host Interplay”, 2008), симпозиумах Американского общества клеточных биологов (ASCB, 2010, 2012).
Публикации по теме диссертации
По результатам диссертационной работы опубликовано 24 статьи в журналах из списка ВАК РФ, 1 статья в сборнике, 22 материала конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 253 страницах и состоит из следующих основных разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы и Список литературы. Иллюстративный материал включает 75 рисунков. Библиографический список включает 215 публикаций.
Похожие диссертации на Структурная организация субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом
