Содержание к диссертации
Введение
1.1.. Структурно-функциональная характеристика хромосом и гетерохроматина 19
1 .1.2. Характеристика генома птиц 26
1.1.3. Нарушения структуры и функции хромосом 29
1.1.4. Использование методов трансгеноза для изучения структурно-функциональных характеристик хромосом 33
1.2. Линейная дифференцированность хромосом 36 1.2.1. Дифференциальная окраска хромосом 36 1.2.2,Организация генома и линейная дифференцированность хромосом 39
1.3. Репродукция хромосом 41 1.3.1 .Молекулярные аспекты репликации ДНК 41 1.3.2.Клеточный цикл 45 1.3.3 .Меж- и внутрихромосомная асинхронпость синтеза ДНК 49
1.4. Трансгсноз 54
1.4.1. Методы генетической модификации генома млекопитающих 54
1.4.2. Введение рекомбинантных плазмид в ядро оплодотворенной яйцеклетки 58
1.4.3. Эффективность трансгеноза у лабораторных и сельскохозяйственных животных 59
1.4.4. Молекулярные механизмы трансгеноза 63
1.4.5. Экспрессия генных конструкций 65
1.4.6. Выведение линий трансгенных животных 71
1.4.7. Особенности роста трансгенных животных 72
1.4.8. Активация эмбрионального генома 75
1.4.9. Перспективы использования трансгенных животных 78
1.5. Заключение к обзору литературы 81
ГЛАВА 2. Материал и методы 86
2.1. Материал исследования 86
2.2. Приготовление препаратов митотических хромосом 87
2,2.1 . Получение препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов кур 87
2.2.2. Приготовление препаратов хромосом из клеток костного мозга 88
2.2.3. Культивирование лейкоцитов периферической крови и приготовление препаратов хромосом 89
2.3 Метод авторадиографии 90
2.3.1. Применение авторадиографии для исследования репродукции хромосом. 90
2.3.2. Анализ радиоавтографов 91
2.3.3. Авторадиографический анализ зигот кроликов и получение ультратонких срезов 92
2.4. Методы, выявляющие линейную дифференцированность хромосом 93
2.4.1. G-окраска хромосом кур и свиней 94
2.4.2. RBA-окраска хромосом кролика 94
2.5. Денситометрия 95
2.6. Морфометричсскии анализ и статистическая обработка материала 96
2.7. Кариотипирование хромосом кроликов и свиней 97
2.8. Получение вазектомированных кроликов 97
2.9. Получение зародышей кролика на стадии двух пронуклеусов 98
2.10. Подготовка доноров и реципиентов свиней 100
2.11. Метод микроинъекции генов в пронуклеусы ЗИГОТ 101
2.12. Трансплантация зародышей 102
2.13. Получение эмбрионов коров in vitro 103
2.13.1. Созревание ооцитов in vitro 103
2.13.2. Оплодотворение ооцитов коров in vitro и получение зигот 104
2.13.3. Культивирование in vitro эмбрионов коров 104
2.14. Методы, используемые при анализе экспрессии
репортерных генов 105
2.14.1 .Экспрессия GFP-гена 105
2.14.2. Экспрессия LacZ гена 105
2.15. Скрининг трансгенных животных 106
2.16. Генетические конструкции, использованные для микроинъекций в ранние эмбрионы 107
ГЛАВА 3. Результаты исследований 115
3.1. Морфометрический анализ макрохромосом кур 115
3.1.1. Размеры и морфология макрохромосом кур 115
3.1.2. Аберрации хромосом у эмбрионов кур 118
3.1.3. Влияние криоконсервации и сроков хранения семени на частоту и спектр хромосомных аберраций у кур 120
3.2. Линейная дифференцированность хромосом кур 125
3.2.1. Характеристика G-полос в макрохромосомах кур 125
3.2.2. Картирование G-полос первой пары аутосом домашних кур 128
3.3. Репродукция хромосом кур 132
3.3.1. Определение параметров G2- и S- периодов 132
3.3.2. Включение 3Н-тимидина в макро- и микрохромосомы цыплят 136 3.3.2.1.Репродукция хромосом кур в культуре эмбриональных фибробластов 136
3.3.3. Межхромосомная асинхронность синтеза ДНК 138
3.3.3.1. Межхромосомная асинхронность репликации ДНК в эмбриональных фибробластах кур 139
3.3.3.2. Межхромосомная асинхронность репликации ДНК в клетках костного мозга цыплят 144
3.3.4. Внутрихромосомиая асинхронность синтеза ДНК 153
3.3.4.1. Внутрихромосомиая асинхронность репликации ДНК в начале S-периода 153
3.3.4.2. Внутрихромосомиая асинхронность синтеза ДНК в конце S-периода 158
3.3.5. Взаимосвязь линейной структуры хромосом с внутрихромосомной асинхронностью репликации ДНК на примере 1-й аутосомы кур 164
3.4. Характеристика репликационной активности генома кролика методом RBA-маркирования 165
3.4.1.Идентификация хромосом кролика и кариотипирование 165
3.4.2. Характеристика репликационной активности генома кролика во второй половине S-периода 170
3.4.3. Сравнительная характеристика хромосом разных уровней конденсации 173
3.5. Пер вый раунд репликации ДНК в пронуклеусах кроликов 176
3.6. Перенос генов соматотропнои оси в зиготы кроликов 183
3.6.1. Получение ранних эмбрионов на стадии зиготы с оценкой их качества 183
3.6.2. Влияние процесса микроинъекции и величины микроигл на выживаемость эмбрионов 187
3.6.3. Влияние различных манипуляций, включая трансплантацию, на жизнеспособность зародышей до момента рождения 191 3.6.4.Анализ интеграции генетических конструкцций
МТ-1/ bGH и MT-1/hGRF в геном кроликов 198
3.6.5. Фенотипические показатели трансгенных кроликов с перенесенными генами hGRF и bGH 207
3.6.6. Характер наследования трансгенов hGRF и bGH и фенотипический анализ 211
3.6.7. Изучение стабильности генома кроликов, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали генную конструкцию MT-1/hGRF. 220
3.7. Введение гена рилизинг фактора гормона роста человека в оплодотворенные яйцеклетки свиней с последующим генетическим анализом 224
3.7.1. Получение ранних эмбрионов свиней и оценка их качества 224
3.7.2 Визуализация пронуклеусов и микроинъекция генной конструкции hGRF в зиготы свиней 228
3.7.3. Гибридизационный анализ интеграции гена hGRF в геном свиней 231
3.7.4. Фенотипические показатели трансгенных свиней 238
3.7.5. Цитогенетический анализ и изучение уровня стабильности генома свиней, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали ген hGRF 240
3.7. Экспрессия репортсрных генов у доимплантационпых зародышей сельскохозяйственных животных 246
3.7.1. Экспрессия генов Lac Z у ранних эмбрионов кроликов 246
3.7.2. Экспрессия GFP гена у эмбрионов коров, полученных in vitro 253
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов
4.1. Организация хромосом птиц 259
4.2. Линейная дифференцированность и функциональная активность хромосом 261
4.3. Репликация ДНК в хромосомах эукариот 267
4.4. Трансгеноз сельскохозяйственных животных 274
Заключение 280
Выводы 283
Практическая значимость работы и реализация результатов 287
Список литературы
- Характеристика генома птиц
- Введение рекомбинантных плазмид в ядро оплодотворенной яйцеклетки
- Получение препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов кур
- Влияние криоконсервации и сроков хранения семени на частоту и спектр хромосомных аберраций у кур
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования по теме диссертации проводили в рамках федеральной целевой программы фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации. Государственный регистрационный номер НИР 01.200.118849.
Анализ кариотипов и идентификация хромосом позволили выявить наследственные аномалии животных и человека, создавать хозяйственно-ценные гибриды. Изучение типов хромосомных перестроек показали взаимосвязь структуры и функции хромосом, что послужило основой создания одного из тест систем мутагенной активности различных агентов, а также осуществлять цито генетический контроль пород домашних животных (Яковлев А.Ф., 1985). Одна из основных функций хромосом - репродукция осуществляется по длине хромосомы и находится в тесной связи с конденсацией и генетической активностью. В метафазной хромосоме эти зоны разновременной репликации разграничены во времени и пространстве. Стабильность репликационной структуры и ее специфичность для каждой хромосомы указывает на высокую упорядоченность укладки хромосомной нити в метафазной хромосоме, строго воспроизводящуюся в ряду клеточных поколений (Захаров и др., 1982).
Репродукция хромосом протекает в S- периоде по строго регламентированной программе, которая определяется как геномными, так и внегеномными факторами. Отклонение отдельных хромосом от стандартной программы синтеза ДНК, как правило, приводит к хромосомным аномалиям. Факт чередования рано и поздно реплицирующихся районов, различный характер их конденсации и ряд других сопутствующих свойств, представляются не случайными и требуют дальнейшего изучения.
Изучение репродукции хромосом кур представляется достаточно удобным по сравнению с другими видами сельскохозяйственных животных в виду того, что в кариотипе птиц наряду с хорошо идентифицирующимися макрохромосомами присутствуют микрохромосомы. Сведения о репродукции хромосом кур весьма скромные и не дают полного представления об интенсивности этого процесса в течение S-периода.
Последние два десятилетия характеризуются значительными успехами в области направленной генетической трансформации клеток животных. Трансформация генома стала возможной благодаря достижениям генной инженерии, а также использованию новых методов переноса генетической информации как в соматические клетки, так и в зародыши млекопитающих и птиц. Успехи экспериментальной эмбриологии в выделении яйцеклеток животных, культивировании, трансплантации и манипуляции с эмбриональными клетками, позволили разработать системы, используемые в опытах по генетической трансформации. Ценность таких опытов заключается в возможности получения трансгенных животных с измененным генотипом, фенотипом и передачи трансформированных признаков потомкам.
Существует несколько достаточно надежных методов генетической трансформации зародышей млекопитающих. В их число входит получение генетических химер, интродукция чужеродных генов в зародыши посредством соматических клеток и спермиев, трансфекция, а также микроинъекция клонированных генов непосредственно в пронуклеусы зигот. Многочисленными работами как отечественных, так и зарубежных авторов показано, что последний из методических подходов более эффективен ( Зиновьева, Эрнст, 2004).
Развитие методов генетической инженерии и исследование структуры нуклеиновых кислот позволило глубже понять механизмы действия генов как у прокариотов, так и у эукариотов, на клеточном уровне и на уровне целого организма. Между тем возникает ряд вопросов о закономерностях структурных перестроек в геноме, о механизмах работы специфических генов в процессе развития эукариотических организмов, о тканевой специфичности и дифференциальной активности групп генов.
В последние годы проблема переноса генетической трансформации перешла в стадию активных поисков возможности практического применения генетической инженерии в медицине и сельскохозяйственном производстве. Так, были получены трансгенные животные с повышенными темпами роста, измененным количеством и качеством молока, шерсти, увеличенной плодовитостью. Создаются животные, которые могут быть источниками органов для ксенотрансплантации, а также животные — биореакторы ценных биологически активных препаратов таких как гемоглобин, фактор свертываемости крови, альфа-антитрипсин, интерферон и др. (Андреева, Тарантул, 2003; Зиновьева, Эрнст, 2004; Cozzi et al., 2000).
Положительные результаты переноса генов в соматические клетки млекопитающих и достижения экспериментальной эмбриологии стимулировало развитие нового этапа - переноса генов на уровне целого организма. С усовершенствованием ряда методик появилась возможность вводить с помощью микроинъекций в одноклеточные эмбрионы гомо- и гетерологичные гены, искусственные конструкции генов, фрагменты хромосом или целые хромосомы и даже целые геномы. Современные методы анализа ДНК позволяют с помощью рестриктаз охарактеризовать структуру донорского гена, интегрированного в геном реципиента, число копий и уровень экспрессии. Усовершенствование методов клонирования и секвенирования предоставили возможность создать рекомбинантные генно-инженерные конструкции, сочетающие в себе целевые гены и регуляторные элементы, позволяющие воздействовать на разные уровни экспрессии генов, усиливая их траскрипционную активность в сотни раз.
Трансгенные организмы оказались ценной, перспективной моделью для изучения различных аспектов во многих областях теоретической и прикладной биологии, таких как исследование структурных особенностей хроматина и индивидуальных различий между генами одного организма и геномами разных организмов. Возможности использования трансгенных животных постоянно расширяются, и накопленная информация в ближайшем удущем найдет применение в биотехнологии и хозяйственной деятельности человека, что очень важно ввиду демографических и экологических кризисов перенаселенной планеты. Степень риска при использовании трансгенных организмов следует учитывать с учетом долговременных интересов жизнеобеспечения общества (Жученко, 2003).
В многочисленных публикациях по трансгенозу в основном констатируются факты получения трансгенных организмов с использованием разных генетических конструкций, но не уделяется достаточное внимание видовым особенностям раннего эмбриогенеза, последствиям микроинъекции зигот с изучением дестабилизации реципиентного генома. Актуальность проблемы генетической трансформации животных, а также недостаточная изученность функционально-структурной организации генома сельскохозяйственных животных и влияния различных факторов на эффективность трансформации определили цели и задачи данного исследования.
Цель работы и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение структурно-функциональной организации хромосом у интактных животных, а также у эмбрионов и животных после введения генов соматотропной оси в зиготы разных видов сельскохозяйственных животных.
В этой связи в настоящей работе были поставлены следующие задачи: провести морфометрический анализ и определить уровень спонтанных аберраций хромосом в эмбрионах кур в норме и при использовании криоконсервированного семени; охарактеризовать структурную дифференцированность хромосом кур; выявить характер включения 3Н-тимидина в макрохромосомы и микрохромосомы кур с учетом внутри- и межхромосомной асинхронности репликации ДНК; показать взаимосвязь линейной структуры хромосом с внутрихромосомной асинхронностью репликации ДНК на примере 1-й аутосомы кур; охарактеризовать репликационную активность генома кролика и ее взаимосвязь с процессом конденсации методом RBA-маркирования; изучить первый раунд репликации ДНК в пронуклеусах кролика; получить трансгенных кроликов и свиней с введенными генами соматотропной оси с учетом анализа интеграции генов, фенотипических показателей, характера наследования трансгенов; изучить уровень стабильности генома кроликов и свиней, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали ген рилизинг фактора гормона роста (hGRF); исследовать экспрессию репортерных генов у предимплантационных зародышей сельскохозяйственных животных.
Научная новизна. Впервые детально выявлены скорость и порядок репликации ДНК хромосом кур в течение всего S - периода с регистрацией характера включения Н-тимидина через каждый час, что позволило определить относительное содержание ДНК в макрохромосомах (73.7%) и микрохромосомах (26.3%). Репродукция макро- и микрохромосом идет на протяжении всего S-периода, но с преимущественным синтезом ДНК микрохромосом в первой его половине, за исключением W-хромосомы, которая репродуцируется в конце S-фазы. Синтез ДНК в ZZ-хромосомах проходит синхронно в течение всего S-периода. На основе нормализации денситометрических профилей впервые проведено картирование G-полос первой пары аутосом кур с количественной характеристикой длины, локализации и интенсивности окрашивания этих полос. При сопоставлении G-полос с локализацией зерен серебра по длине 1-й хромосомы в начале S-фазы метка преимущественно локализуется в светлоокрашенных зонах, в конце периода синтеза ДНК характер распределения зерен серебра по длине аутосомы полностью совпадает с локализацией темных G-полос. На примере сравнительного анализа RBA-окрашенных хромосом показана взаимосвязь процессов репликации и конденсации хромосом кролика, находящихся на разных уровнях конденсации.
Получены трансгенные кролики и свиньи с интеграцией векторных последовательностей и полноценных копий гена рилизинг фактора гормона роста человека и гормона роста быка, под контролем промотора металлотионеина мыши (МТ-1). Выявлено два ярко выраженных фенотипических эффекта: увеличение и уменьшение массы тела по сравнению со своими сверстниками. Трансгенные потомки первого поколения наследовали способность к замедленному или ускоренному росту. У тансгенных кроликов и свиней наблюдали снижение либидо у самцов, повышенную эмбриональную и постнатальную смертность.
Впервые количественно определена степень дестабилизации генома при воздействии чужеродных генов (частота микроядер и множественные ассоциации хромосом) у животных, полученных из зигот с введенными экзогенными генами.
Теоретическая и практическая ценность работы. Теоретическая значимость представленной работы заключается в получении достаточно полной картины репродукции хромосом кур в течение S-периода. Скорость синтеза ДНК макрохромосом и микрохромосом кур в S-фазе изменяется в узких пределах с перепадом около 12%. Интенсивность репликационных процессов значительно (на три четверти) снижается в конце S-фазы. Показана низкая индивидуальная изменчивость скорости синтеза ДНК в макрохромосомах. Подтверждена связь внутрихромосомной асинхронности репликации ДНК с линейной (блочной) дифференцированностью и процессом конденсации хромосом. На одноклеточной эмбриональной стадии вскрыта взаимозависимость асинхронного синтеза ДНК в пронуклеусах и морфологических изменений в процессе роста и развития, выявлены два типа хроматина, отличающихся по времени репликации ДНК.
При введении генов соматотропной оси в зиготы и ранние эмбрионы кроликов и свиней получена устойчивая интеграция экзогенного материала в геноме реципиентов с появлением новых фенотипических признаков, наследуемых в ряду поколений. Трансгенные кролики передавали ген рилизинг фактора гормона роста потомству первого поколения с частотой 50%.
Практическая значимость диссертационной работы состоит в совершенствовании приемов приготовления препаратов хромосом из тканей ранних эмбрионов кур и количественной оценки результатов дифференциального окрашивания, которые необходимы для проведения цитогенетического контроля племенных животных, линий и пород, ветеринарной цитогенетики и картировании хромосом.
Приемы использования репортерных генов для отбора трансгенных эмбрионов и введение MAR-последовательностей значительно повышают эффективность получения трансгенных животных.
Использование методов определения частоты микроядер и ассоциаций хромосом позволяет судить о степени дестабилизации генома животных с перенесенными генами.
Апробация работы. Материалы исследований были представлены и обсуждены на: научной конференции по птицеводству (Загорск, 1975); всесоюзном симпозиуме по структуре и функции ядра (Алма-Ата, 1977); Ш всесоюзном обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (Ленинград, 1977); VII всесоюзном симпозиуме по структуре и функции ядра (Харьков, 1980); IV всесоюзном обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (Кишинев, 1981); XXXIII Европейской ассоциации животноводства (Ленинград, 1982); III национальной конференции Болгарии по цитогенетике (Пловдив, 1984); I всесоюзной конференции по цитогенетике сельскохозяйственных животных (Москва, 1985); VI и VIII интернациональных симпозиумах по актуальным проблемам генетики птиц (Чехословакия, Смоленицы, 1985, 1989); на XXV заседании Польского биохимического общества (Торунь, 1989); IV национальной конференции Болгарии по цитогенетике (Враца, 1989); всесоюзном совещании по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных (Алма-Ата, 1989); международном семинаре по биотехнологии животных (Чехословакия, Нитра, 1990); IV франко-
16 чехословацком заседании по теме " от ооцита к эмбриону" (Прага, 1990); V международном симпозиуме по интенсификации получения качественной продукции (Чехословакия, Нитра, 1990); XV и XVI симпозиумах генетических дней Чехословакии (Чешские Будеевицы, 1991, 1992); XIII Чехословацком семинаре по репродукции сельскохозяйственных животных (Липтовский Ондрей, 1992); XVI симпозиуме генетики сельскохозяйственных животных Словакии (Нитра, 1993); международной конференции общества генетиков им. Г. Менделя, посвященной 40-ю двойной спирали ДНК (Чехословакия, Брно, 1993); X интернациональном симпозиуме по актуальным проблемам генетики птиц (Словакия, Нитра, 1993); международном симпозиуме по гликокортикоидным гормонам (США, Санта Барбара, 1993); 1 всероссийском обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (Саратов, 1994); международной конференции по фундаментальным проблемам и перспективам развития животноводства на европейском севере (Петрозаводск, 1996); международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных (Ленинград, 1994); I международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры животных" (Киев, 1994); международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке изменения геномов сельскохозяйственных животных (С.-Петербург, 1994); XIII симпозиуме Польского общества генетиков (Варшава); XXV заседании FEBS (Копенгаген, 1998); конференции, посвященной 80-летию МВА им. Скрябина "Совершенствование племенных и продуктивных качеств животных и птиц " (Москва, 1999); первом Польском конгрессе по биотехнологии (Вроцлав, 1999); II всероссийском обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Вавилова (С.-Петербург, 2000); конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве", ( Боровск, 2000); международном совещании "Молекулярные фермы" (Франция, Ля Гранд Мотте, 2000); I международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2002); международном симпозиуме "Дни польской науки в России " (С.-Петербург, 2002); XXXXXIII Европейской ассоциации животноводства (Египет, Каир,
2002); 2-й международной научно-практической конференции "Научно-технический прогресс в животноводстве России - ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства", (Московская обл., Дубровицы 2003); международной научной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология", (Минск, 2004); Ш всероссийском обществе генетиков и селекционеров (ВОГИС) им, Вавилова (Москва, 2000); международной конференции "Сохранение генетических ресурсов", (С.-Петербург, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 114 научных работ, в том числе 3 методических рекомендации. Работы опубликованы в материалах международных конференций, журналах: «Генетика», «Зоотехния.», «Цитология», «Цитология и генетика», «Сельскохозяйственная биология», «Folia Biologia», «J, of Reproduction and Fertility», «J. Animal Feed Sci.», «Animal Science Papers and Reports», Сб. научных трудов «Генноинженерные сельскохозяйственные животные » (Министерство науки и технической политики Российской Федерации РАСХН)».
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы из 378 источников, среди которых 298 на иностранных языках. Диссертация изложена на 321 страницах, содержит 36 таблиц, 57 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту:
Морфологический и морфометрический анализ хромосом сельскохозяйственных животных с получением и анализом денситометрических профилей G-полос метафазных пластинок с различной степенью конденсации;
Идентифицикация сходных по морфологии хромосом кроликов методом RBA-маркирования с представлением взаимоотношения процессов репликации и конденсации;
Взаимосвязь процесса репликации ДНК на протяжении S-периода со структурной организацией хромосомы;
Введение и интеграция генов соматотропной оси, фенотипические показатели трансгенных животных и характер их наследования; Особенности уровня стабильности генома кроликов и свиней, полученных из зигот с введенными генами рилизинг фактора гормона роста человека; Выявление паттерна экспрессии чужеродных генов и активации эмбрионального генома с использованием репортерных генов.
Характеристика генома птиц
Интерес к изучению структурно-функциональной организации хромосом птиц вызван с одной стороны консервативностью класса Aves, с другой-наличием микрохромосом и хорошо идентифицируемых макрохромосом, облегчающих цитогенетический анализ.
Одно из первых сообщений о хромосомах птиц появилось в 1906 году, когда М. Лайоз (Layoz, 1906) обнаружил у кур 6-ть пар макрохромосом. В нашей стране интенсивные исследования по сравнительной кариологии птиц проводились в 30-х годах (Трофимов и Тиняков, 1933, Живаго, 1934). Несмотря на примитивность цитологической техники, авторы смогли определить морфологию хромосом отряда куриных и различных гибридов птиц.
Хромосомы птиц условно делят на 2 группы: группу макрохромосом , в состав которой входят 6-8 пар наиболее крупных по размеру хромосом и группу микрохромосом, имеющих малые размеры и практически не идентифицируемые (Shoffner, 1974). У видов птиц диплоидный набор хромосом составляет 76-82 и типичная морфология хромосом выявлена у 65% видов среди 800 опубликованных кариотипов (Родионов, 2001). Различия по числу хромосом у птиц не всегда связаны с таксономическим положением. Как правило, морфология и число макрохромосом остается неизменными, варьирует число и структура микрохромосом (Burt et al.,2002).
Методом дифференциального окрашивания был показан высокий для позвоночных животных эволюционный консерватизм кариотипов класса Aves (De Boer and van Brink, 1982).
В отличие от млекопитающих у птиц гомогаметным полом являются самцы и имеют ZZ половые хромосомы, а самки имеют ZW половые хромосомы.
У домашней курицы Gallus domesticus - диплоидный набор состоит из 78 хромосом из которых 12-16 макро- и остальные — микрохромосомы.
Исследование митотических хромосом курицы при помощи дифференциального окрашивания выявило ряд интересных особенностей. Для получения картины репликационного R-окрашивания была проведена RBA-окраска, выявляемая при окрашивании акридиновым оранжевым после введения 5-бромдезоксиуридина и его включения на этапах раннего и позднего синтеза ДНК в S-фазе клеточного цикла. Было показано, что рисунок ранней R-исчерченности соответствовал рисунку, получаемому при G-окрашивании, а рисунок поздней R-исчерченности был обратным. Кроме макрохромосом R-блоки были обнаружены и в группе микрохромосом 8-12, W (Ponce de Leon et al., 1989).
Определенный интерес вызывает природа микрохромосом и детерминация пола. Микрохромосомы встречаются в геномах разных видов птиц, большинства видов рептилий и у некоторых позвоночных. У птиц они могу рассматриваться как продукт минимизации генетического аппарата, т.к. у класса Aves самый маленький геном из наземных позвоночных. На микрохромосомы приходится по разным оценкам 18-33% всего генома домашней курицы (Schmid et al.,2000), кроме этого микрохромосомы обладают несколькими признаками, характеризуемыми для районов с повышенной концентрацией генов. К таким признакам относятся: репликация в первой половине S-фазы клеточного цикла (Ponce de Leon et al., 1992), низкий уровень метилирования ГЦ-пар оснований (McQueen et al., 1996) и гиперацетилирование гистонов (McQueen et al., 1998). В настоящее время известно, что у млекопитающих высокая плотность генов сосредоточена в районах хромосом, обогащенных ГЦ-последовательностями, в тоже время у птиц именно гетерохроматин является ГЦ-богатым. Как показано в работах группы А.В. Родионова эухроматиновая часть микрохромосом представлена преимущественно ГЦ-богатой ДНК R-блоков (Родионов, 2001), при этом локализовано около двух третей генов на микрохромосомах (Smith et al., 2000).
До настоящего времени мало выяснены вопросы детерминации пола и компенсации дозы генов у птиц с ZZ и ZW- половыми хромосомами. По гипотезе Х.С. Чандры (Chandra, 1994) половые хромосомы птиц несут одинаковый набор генов, определяющих пол, в условиях отсутствия дозовой компенсации Z- и инактивации W-хромосомы при нормальном развитии. Следует отметить, что W- хромосома по структуре и по функциональным характеристикам проявляет сходство с Y-хромосомоЙ млекопитающих по обедненности кодирующими последовательностями и обилием гетерохроматина. Возможно, что использование самых современных методов цитогенетики, таких как применение специальных хромоспецифических проб для микрохромосом и пэйтинговых зондов для макрохромосом помогут успешно идентифицировать и изучить микро- и W-хромосомы (Guiller-gensik et al., 1999).
Недавно были выявлены гены в W- и 2-хромосомах цыплят, связанные с половой детерминацией и дифференциацией. ASW/Wpkci ген в W-хромосоме и DMRT1 ген на Z-хромосоме участвуют в половой детерминации. Содержание ДНК в W-хромосомы составляет 2.3% от диплоидного генома самок, и представляет собой высоко повторяющиеся последовательности ДНК, формируя конститутивный гетерохроматин, за исключением терминального конца короткого плеча.
На Z-хромосоме находится гиперметиллированный район (МНМ), состоящий из тандема повторов. Генный локус DmRTl в МНМ районе транскрибируется у самок, но не транскрибируется у самцов. Этот транскрипционный сайлесинг МНМ районов у самцов вызван гиперметиллированием (Mizuno et al., 2002).
Введение рекомбинантных плазмид в ядро оплодотворенной яйцеклетки
Перенос генов методом микроинъекции в зиготы в настоящее время является самым распространенным. От ранее разработанных этот метод отличается более высокой эффективностью получения трансгенных животных с последующей передачей чужеродного гена в ряду поколений.
В ранние эмбриональные клетки животных вводят рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие сигналы репликации и транскрипции. Вектора получают, встраивая чужеродную ДНК в плазмиду бактерии, которую предварительно расщепляют эндонуклеазои. Важно отметить, что плазмида сохраняет способность к репликации, а встраиваемый ген - к экпрессии. Как минимум, рекомбинантная ДНК представляет собой химерную плазмиду, содержащую чужеродный структурный ген и промоторный участок. Для трансформации генома применяют полные природные гены, а так же экзонные части (Hammer et al., 1985; Brem etal., 1986; Vizeet al., 1989).
В 1980 году были проведены первые успешные опыты по введению рекомбинантных плазмид а оплодотворенные яйцеклетки мыши, используя тимидинкиназный ген (ТК) вируса герпеса, и ген В-глобина человека (Gordon et al., 1980). Было показано, что чужеродный ТК-ген был интегрирован в клетки мышей, и продукт этого гена легко отличим от подобного клеточного фермента.
При увеличении количества вводимого ДНК в ранние эмбрионы погибает больше зародышей ввиду мутагенного эффекта, а среди выживших частота генетической трансформации не возрастает (Brinster et al., 1985; Дыбан, Городецкий, 1987; Bieru et al., 1988). У сельскохозяйственных животных эти вопросы изучены недостаточно полно. J. Murray с совт. (1989) показали, что при микроинъекции ДНК в зиготы овец раствора ДНК в концентрации от 0.5-1 нг/мкл до 5 нг/мкл без больших различий в эффективности трансформации генома овец, составляющей в среднем 7.5%. R. Hammer с соавт. (1985) и С. Rexroad с соавт. (1989) использовали ДНК в концентрации 3 нг/мкл и получили 1.3% и 5.5-7.1% интеграции соответственно.
Микроинъецированные зиготы трансплантируют в яйцевод самки реципиента, или культивируют с последующей трансплантацией соответственно стадии развития эмбриона: одноклеточные зародыши - в ампулу яйцевода, 2-х клеточные- в верхнюю треть, 4-х клеточные в среднюю треть и 8-16-ти клеточные - в нижнюю треть яйцевода; 16-32-х клеточные морулы и бластоцисти - в матку (Дыбан и др., 1975).
Наличие интегрированного трансгена определяют у родившихся животных, абортированных плодов или эмбрионов по присутствию в их геноме последовательностей ДНК донорского типа методами дот- блот-гибридизации по Саузерну.
Наилучшие результаты по трансформации генома млекопитающих были получены на мышах, благодаря изученности их генетики, эмбриогенеза и простоты методических подходов. В лучшем случае рождение происходит у 15%-60% трансформированных зародышей (Вайсман и др., 1983; Brmster et aL, 1985). Вероятно, жизнеспособность эмбрионов обусловлена многими факторами, такими как особенности генотипа, техникой исполнения микроинъекций, используемой генной конструкцией и ряда других факторов. Показано, что рождаемость гибридных мышей в 2-3 раза выше, чем линейных (Palmiter, Brinster, 1985). По данным ряда авторов количество трансгенных, из числа родившижся животных, варьирует от 0.5% (Gordon et al., 1980) до 50% (Wagner et al., 1983) и более (Вайсман и др., 1986).
В отличие от мышей трансформация генома у сельскохозяйственных животных значительно менее эффективна. Наибольшая эффективность трансгенных кроликов составляла от 12.8% (Hammer et al., 1985) до 18% (Brem et al., 1986). У свиней эти показатели составляли 6.7% (Brem et аІ., 1986) и 10.4% (Hammer et al., 1985). Максимально высокий выход трансгенных свиней удалось получить P.Vize с соавт. (1988) 35% (6/17) и A.Michalska с соавт. (1986) -30% (5/17).
По оценке V.Pursel с соавт. (1989) из 7000 яйцеклеток после микроинъекции различных генных конструкций до рождения развились только 8%, из которых только 7% свиней оказались трансгенными. У овец при переносе чужеродных генов рождалось 0.31% трансгенных особей (Rexroad, Pursel, 1988), 1.3% (Hammer et al, 1985), 5.5% (Simons etal., 1988), 7.5% (Murray et al., 1989). Наименее успешны эксперименты с крупным рогатым скотом. Интеграцию трансгенов отмечали в 0.22-1.67% (Biery et al., 1988), 2.3% Roschlau et al., 1988), 5.6% (Chuch, 1987) случаев. В среднем, эффективность генных пересадок овцам, козам, свиньям и крупному рогатому скоту составляет 0.58.
При микроинъекции в составе плазмидных векторов используют конструкции до 100 к.б. (Richa, Lo., 1989); при липофекции искусственных дрожжевых хромосом - до 150 к.б. (Strauss et al., 1993); при микроинъекции фрагментов хромосом млекопитающих - до 10 м.б. и более (Richa, Lo, 1989).
Показано, что прокол пронуклеуса и микроинъекция генно-инженерных конструкций или буфера достоверно снижают жизнеспособность эмбрионов по сравнению с контролем. Отмечено, что у потомства мышей, развившихся из таких зигот, значительно возрастает количество различных аномалий, таких как гипо- и гипер- дисплозия тканей, атрезия некоторых органов, повышается частота рождение не жизнеспособных потомков (Попова с соавт. 2002).
Получение препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов кур
По методу получения однослойных культур (Холпер, 1972) с учетом необходимых модификаций 9-дневные эмбрионы промывали раствором Хэнкса с пенициллином (100 тыс. ед. на мл.), затем их тщательно измельчали и помещали в сосуд с 0,25% раствором трипсина. Трипсинизацию проводили при 37 в течение 15-20 минут, после чего трипсин удаляли, а клеточную суспензию разводили питательной средой 199 с 20% раствором бычьей сыворотки и засевали в культуральные флаконы. Инкубацию проводили в стандартных условиях при температуре 37 в течение двух суток.
Через 48 часов вносили колхицин (0,5 мкг/мл.) на три часа. После удаления колхицина с помощью петли проводили механическое снятие клеток, которые подвергались гипотонической обработки 1%-ным раствором трехзам еще иного цитрата натрия на протяжении 30-ти минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, клетки фиксировали охлажденной смесью, состоящей из 3-х частей метилового спирта и 1-й части ледяной уксусной кислоты. Фиксацию проводили трижды с заменой фиксатора на свежую, охлажденную порцию. Клеточную взвесь разводили в небольшой порции фиксатора, наносили на обезжиренные стекла и высушивали. Окрашивание проводили либо 1%-ным раствором азур-эозина, либо раствором Гимза.
В нашей лаборатории используют метод получения хромосом из эмбриональных тканей без длительного культивирования клеток (Трофимова, 1976). В аллантоисную оболочку 3-5-дневных эмбрионов кур вводили 0.1 мл колцемида (0.05мг) и эмбрионы инкубировали 3-4 часа при 38 С. Зародыши измельчали, центрифугировали, проводили гипотоническую обработку, фиксировали и приготавливали препараты как указано выше.
Существуют многочисленные модификации метода получения хромосом клеток костного мозга. Методики, применяемая в нашей лаборатории, является одним из вариантов методов, разработанных в 60-х годах, которые до настоящего времени многократно видоизменялись (Трофимова, 1976).
За 1-3 часа до декапитации птице вводили внутрибрюшинно 0,1%-ный водный раствор колхицина из расчета 0,01 мг на 5 г веса цыплят. После забоя вычленяют бедренные и большие берцовые кости, надрезая головки костей и, слегка вращая, вводили иглу шприца. Костный мозг вымывали 1,12%-ным раствором трехзамещенного цитрата натрия. Суспензию клеток выдерживали в гипотоническом растворе 30 минут при температуре 37. Гипотонический раствор вызывает набухание ядра, и легкое надавливание приводит к разбрасыванию хромосом, что является важным для анализа числа и структуры хромосом. Далее суспензию клеток осаждали центрифугированием со скоростью 1000 об/мин в течение 5 минут. Фиксация проводилась трижды при 4 С в течение получаса. Взвесь клеток ресуспензировали в небольшом объеме фиксатора и с помощью пастеровской пипетки наносили на чистое предметное стекло.
Кровь для постановки культур брали стерильным шприцем с гепарином (Московский эндокринный завод, 5 тыс. ед./мл.) из расчета 100-200 ед. на 1 мл. крови из краевой ушной вены и вводили в стерильные флаконы со средой ( 0,5 мл. крови на 5 мл. среды). Культуральные среды состояли из следующих компонентов: -среда RPMI 1640 (Gibco) 80-85% -инактивированная эмбриональная телячья сыворотка 15-20% -антибиотик гентамицина сульфат 50 мкг/мл -митоген конканавалин A (Con A, Fluka, Switzerland) 50-100 мкг/мл
Культивирование проводили по методу Морхеда ( Moorhead et al., 1960) при 37 С 72 часа. Один два раза в день клеточная взвесь встряхивалась для предотвращения аглютинации эритроцитов. Модификация метода состояла в том, что за 1,5-2 часа до фиксации в культуры вместе с колхицином вводили 20-25 мкг/мл этидиум бромида (Serva), который повышает выход хромосом на стадии ранней метафазы и прометафазы.
За 30 минут до фиксации клетки подвергались гипотонической обработки в 0,75%-м растворе KCL при 37 С, добавляя 6-8 капель фиксатора на 10 мл. раствора, что существенно улучшает качество распластывания хромосом.
Фиксацию проводили в трех сменах охлажденной метанол-уксусной смеси (3:1), затем готовили препараты хромосом, раскапывая клеточный материал на смоченные водой стекла. Высушенные препараты использовали в дальнейшей работе.
Влияние криоконсервации и сроков хранения семени на частоту и спектр хромосомных аберраций у кур
Широкое внедрение техники искусственного осеменения кур с предварительной криоконсервацией семени налагает особую ответственность на контроль как самих производителей, так и используемых технологий в криоконсервации. В технологии замораживания семени используют много химических соединений для изготовления сред и криопротекторов, которые могут вызывать повреждения генетического материала. Сама процедура замораживания и режим размораживания также могут негативно сказаться на структуре хромосом. Цитогенетический контроль и определение частоты хромосомных нарушений позволяют не только определить степень повреждающего воздействия всей технологии замораживания и размораживания спермы, но и могут послужить одним из существенных моментов, позволяющим подобрать соответствующие условия и режимы криоконсервации. В таблице 4 представлены результаты исследования хромосом эмбрионов, полученных путем искусственного осеменения свежезамороженным семенем. Семя замораживали по определенной технологии, сразу размораживали и осеменяли им кур. От 74 эмбрионов было исследовано 1135 метафазных пластинок (таблица 4).
Частота геномных нарушений в этом опыте почти не изменилась по сравнению с частотой спонтанных хромосомных нарушений (табл.3), хотя появилось новое геномное нарушение - тетраплоидия. Увеличилась частота нарушений числа хромосом. Среди эмбрионов, полученных путем осеменения свежезамороженным семенем наблюдалось в два с лишним раза больше моносомий и трисомий.
Что же касается структурных аберраций хромосом, то общая их частота почти не изменилась, хотя число разрывов хромосом несколько увеличилось (табл. 4).
Общая частота хромосомных нарушений среди эмбрионов, полученных с использованием замороженного семени, увеличилась на два процента. Этот показатель не может существенно влиять на показатель оплодотворяемости и выводимости цыплят.
Следующая серия опытов была посвящена изучению хромосомных нарушений у 25 эмбрионов, полученных путем оплодотворения семенем, которое хранилось в замороженном состоянии в течение 4-х месяцев (таблица 5.)
Всего было исследовано 398 метафазных пластинок. Характерной особенностью хромосомных нарушений среди этих эмбрионов было увеличение более чем в два раза частоты эуплоидии в основном за счет триплоидии, а по сравнению с контролем количество триплоидных метафазных пластинок увеличилось в 5 раз.
В этой серии опытов был выявлен триплоидный эмбрион, все клетки которого содержали тройной набор хромосом и три половые Z-хромосомы.
Известно, что спонтанная триплоидия возникает у млекопитающих (1-5%) и у птиц (0.8-3.2%). Механизмы этого феномена одинаковы, а именно триплоидия возникает либо из-за дигинии, либо из-за диандрии или при полиспермии. Поскольку эмбрион мужского пола, то возможны два последних механизма.
Общая частота анеуплоидных клеток у эмбрионов в этой серии опытов почти не изменилась. Частота структурных аберраций также не изменилась, но имеет место небольшое увеличение числа транслокаций и других типов структурных нарушений, однако, они незначительны. Число эмбрионов с хромосомными нарушениями в серии опытов с использованием семени, хранившегося 4 месяца, составляет 12%, т.е. почти в 2 раза выше, чем в случае осеменения свежезамороженным семенем.
В настоящее время существуют карты высокого разрешения G-хромосом кур, но для G-окраски мы использовали наиболее часто используемые хромосомы средней степени конденсации. Хромосомы кур, окрашенные по G-технике, представлены на рис. 8. Для каждой пары хромосом характерен свой рисунок исчерченности. Для более точной характеристики G-полос и их локализации мы получили денситометрические профили. Денситограммы линейно дифференцированных хромосом макрохромосом кур представлены на рис. 9.
В первой паре макрохромосом сосредоточено 7 G-полос, более подробный анализ будет дан ниже. По длине второй пары макрохромосом было выявлено 5 темно окрашенных сегментов, среди которых 2 полосы локализованы в коротком плече, остальные 3 - в длинном. Такое же количество G- полос имеется в акроцентриках третьей пары. Для гомологов четвертой пары характерно наличие четырех темно окрашенных полос, причем одна из них расположена в коротком плече, другая в районе центромеры, а остальные два темных сегмента сосредоточены в длинном плече.
В половых хромосомах локализовано 3 конденсированных сегмента, одна из которых находится в одном плече, два - в другом. В небольших по размеру акроцентрических хромосомах шестой пары выявлено только две полосы. В некоторых микрохромосомах можно видеть распределение темно окрашенных сегментов, но анализ локализации G — полос в этих структурах не входил в задачу данной работы.
