Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1. Пространственная организация генома человека 10
1.1. Упаковка генетического материала в клеточном ядре 10
1.1.1. Нуклеосомный уровень компактизации 12
1.1.2. Фибрилла диаметром 30 нм 12
1.1.3. Петельно-доменныи уровень компактизации хроматина 13
1.2. Структура хроматиновых петель 13
1. 3. Ядерный матрикс 15
1.4. Методы изучения доменной структуры генома 17
1.4.1. Экстракция при высокой ионной силе 17
1.4.2. LIS-экстракция 18
1.4.3. Электроэлюция 18
1.4.4. Связывание с ядерным матриксом (скэффолдом) in vitro 19
1.4.5. Расщепление топоизомеразой II ядерного матрикса 20
1.4.6. Флуоресцентная гибридизация in situ 20
1.5. Петлевые домены и функциональная активность генома 21
1.5.1. Петлевые домены и транскрипция 21
1.5.2. Петлевые домены и репликация 22
1.5.3. Различные типы прикрепления ДНК к ядерному матриксу 23
2. Картирование геномов 25
2.1. Физическое картирование генома 25
2.2. Виды физических карт генома 26
2.2.1. Цитогенетические карты 26
2.2.2. Рестрикционные карты 27
2.3. Вектора, используемые для создания библиотек геномов 28
2.3.1. Дрожжевые искусственные хромосомы - YAC вектора 30
2.3.2. Векторная система бактериофага Р1 32
2.3.3. ВАС и РАС вектора 32
2.4. CpG островки 34
3. Локус хромосомы человека 16q22.1 37
3.1. LCAT генный кластер 37
3.2. Гены-супрессоры рака молочной железы на хромосоме человека 16q22.1 38
Материалы и методы 42
1. Материалы 42
1.1. Реактивы 42
1.2. Ферменты 42
1.3. Питательные среды 42
1.4. Библиотеки генома человека 42
1.5. Пробы, применявшиеся при построении интеграционной карты региона хромосомы человека 16q22.1 43
1.6. Пробы, применявшиеся для флуоресцентной гибридизации in situ 48
2. Методы 49
2.1. Выделение РАС ДНК 49
2.2. Субклонирование фрагментов ДНК РАС клонов 49
2.3. Приготовление геномной ДНК лимфоцитов человека, заключенной в агарозные блоки 50
2.4. Расщепление заключенной в агарозные блоки ДНК рестриктазами 50
2.5. Пульс электрофорез 51
2.6. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр (блоттинг) 51
2.7. Радиоактивное мечение фрагментов ДНК 51
2.8. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом 52
2.9. Программное обеспечение 53
2.10. Выделение лимфоцитов человека для приготовления препаратов ядерного гало и метода ДНК-комет 53
2.11. Электрофорез единичных клеток (метод ДНК-комет) 54
2.12. Флуоресцентная гибридизация in situ с препаратами ДНК-комет 55
2.13. Приготовление препаратов ядерного гало 55
2.14. Флуоресцентная гибридизация in situ с препаратами метафазных хромосом и препаратами ядерного гало 56
Результаты и обсуждение 58
1. Построение интеграционной физической и функциональной карты локуса q22.1 хромосомы человека 16 58
1.1. Картирование представленных в виде геномных библиотек участков ДНК локуса хромосомы человека 16q22.1 58
1.2. Построение геномной карты локуса 63
1.3. Локализация принадлежащих локусу CpG островков 63
1.4. Выявление генов и других функционально значимых элементов 63
1.5. Использование интеграционной карты локуса хромосомы человека 16q22.1 для выявления генов-супрессоров развития рака молочной железы
и других функциональных последовательностей 65
1.6. Интеграционная карта локуса q22.1 хромосомы человека как основа для выявления его доменной организации 66
2. Исследование доменной организации локуса хромосомы человека 16q22.1, содержащего LCAT генный кластер 67
2.1 Комбинирование метода ДНК-комет с флуоресцентной гибридизацией in situ в целях изучения петлевой организации хроматина 672.2. Изучение пространственной организации локуса хромосомы человека 16q22.1 с использованием комбинации флуоресцентной гибридизации in situ и метода ДНК-комет 69
2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ с препаратами ядерного гало 75
2.4. Флуоресцентная гибридизация in situ проб из региона хромосомы человека 16q22.1 с препаратами человеческих хромосом 77
2.5. Флуоресцентная гибридизация in situ проб из региона хромосомы человека 16q22.1 с препаратами ядерного гало 79
2.6. Определение позиций индивидуальных последовательностей ДНК
внутри препаратов ядерного гало 79
Заключение 85
Выводы 87
Список литературы
- Петельно-доменныи уровень компактизации хроматина
- Расщепление топоизомеразой II ядерного матрикса
- Приготовление геномной ДНК лимфоцитов человека, заключенной в агарозные блоки
- Картирование представленных в виде геномных библиотек участков ДНК локуса хромосомы человека 16q22.1
Введение к работе
В последние годы все большую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение взаимосвязи пространственной организации генетического материала в клеточном ядре и функциональной активности генома. Подобный интерес вызван как стремительным развитием молекулярно-биологических методов, позволяющих осуществлять исследования на качественно новом уровне, так и накоплением колоссального количества данных о структуре и функции различных регионов генома. Выявление закономерностей пространственной организации этих регионов в соответствии с их функциональной значимостью может оказаться ключевым в понимании общей картины реализации генетической информации в клетках эукариот.
Компактная упаковка генетического материала эукариот в ограниченном объеме клеточного ядра осуществляется в несколько этапов. Основными уровнями конденсации хроматина являются нуклеосомы, 30 нм фибрилла и петельно-доменный уровень конденсации. С точки зрения функциональной активности генома, особый интерес представляет именно третий уровень компактизации ДНК, на котором 30-нм фибрилла хромосомной ДНК образует петли, закрепленные на скелетных структурах ядра.
Считается, что существует прямая корреляция структурной организации генома в виде петель и его разделения на ряд относительно независимых функциональных доменов (Gasser et al., 1989; Cook, et al., 1991; Razin and Vassetsky, 1992). Такими доменами, прежде всего, являются единицы транскрипции - транскриптоны, и единицы репликации -репликоны. Участкам прикрепления петель к скелетным структурам ядра соответствуют различные регуляторные элементы, имеющие критическое значение для функционирования генома. Такими элементами являются промоторы, терминаторы, энхансеры, последовательности связывания с регуляторными белками, участки начала репликации, места с повышенной частотой хромосомных перестроек и т. д. Обнаружить подобные элементы, основываясь только на данных о первичной структуре участков ДНК, содержащих эти элементы, практически невозможно. В каждом конкретном случае необходимо применение соответствующих экспериментальных подходов.
Настоящая диссертационная работа посвящена изучению функциональной и пространственной организации локуса q22.1 хромосомы человека 16, содержащего LCAT генный кластер. Этот кластер генов является одним из наиболее компактных описанных в литературе кластеров генов млекопитающих и включает в себя ген протеасомной субъединицы (MECL1), химотрипсин-подобной протеазы (CTRL1), протеинсериновой киназы (PSKH1), лецитин:холестерол ацил трансферазы (LCAT) и ген SLC12A4, кодирующий KCI котранспортер. Все пять генов расположены внутри фрагмента ДНК длинной 50 тысяч пар нуклеотидов (Larsen et а/., 1993, Frengen et al., 1995). Было показано, что гены, составляющие LCAT генный кластер, не имеют гомологии нуклеотидных последовательностей и не связаны между собой функционально. Тем не менее, структура кластера практически не менялась в процессе эволюции. Аналогичные кластеры генов были обнаружены в геноме у рыбы и свиньи {Frengen et al., 1997). По всей видимости, организация данного кластера генов не случайна и имеет биологическое значение. Эволюционная консервативность LCAT генного кластера поддерживает это предположение. Выявление взаимосвязей доменной структуры хроматина в районе LCAT генного кластера с функциональной активностью может способствовать объяснению биологического смысла столь компактной организации генов, составляющих LCAT генный кластер.
Регион человеческой хромосомы 16q22.1 интересен и с медицинской точки зрения, так как он вовлечен в развитие рака молочной железы и содержит гены-супрессоры, подавляющие развитие этого заболевания (Dorion-Bonnet et al., 1995, Dogget et al., 1996). Выявление новых генов в данном регионе генома может способствовать локализации гена- супрессора опухоли молочной железы, что, в свою очередь, позволит повысить эффективность лечения данного ракового заболевания. С человеческой хромосомой 16 связывают развитие и других опухолей, таких, как острая миеломоноцитная лейкемия, гепатоклеточная карцинома, овариальный рак и рак простаты, опухоль Вильмса (Sato et а/., 1991; Tsuda et al., 1990; Bergerheim et al., 1991; Maw et a/., 1993). Идентификация новых генов внутри этой хромосомы и исследование взаимосвязи ее пространственной организации с функциональной активностью может способствовать углублению существующих знаний о канцерогенезе, молекулярные механизмы которого по-прежнему до конца не ясны.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось построение подробной интеграционной физической и функциональной карты региона локуса хромосомы человека 16q22.1 и использование полученной карты для изучения взаимосвязей пространственной организации этого региона с функциональной активностью.
Задачи исследования:
Построение детальной физической карты фрагмента хромосомы человека 16q22.1, содержащего LCAT генный кластер и гены-супрессоры развития опухоли молочной железы.
Выявление на карте генов и других функционально значимых элементов
Использование построенной карты для изучения петлевой организации хроматина внутри локуса хромосомы человека 16q22.1
Петельно-доменныи уровень компактизации хроматина
Остаточная структура клеточного ядра, полученная в результате обработки интерфазных ядер неионным детергентом, 2М NaCI и нуклеазами, была названа ядерным матриксом (Berezney & Coffey, 1974). Методами, сходными с процедурой выделения ядерного матрикса, в лаборатории Laemmli были получены аналогичные остаточные структуры метафазных хромосом. Данные структуры, названные метафазный скэффолдом, сохраняются после дегистонизации и обработки нуклеазами (Mirkovitchefa/., 1988).
Для изолированного ядерного матрикса (скэффолда) характерно наличие таких структурных компонентов, как остаточная ядерная ламина с поровыми комплексами; остаточные компоненты ядрышка; и фибриллярно-гранулярной структуры, называемой внутренним матриксом (Berezney & Coffey, 1977; Berezney et a/., 1995). Кроме того, в состав ядерного матрикса входит ДНК и РНК.
Ядерная ламина представляет собой белковый каркас 25-100 нм толщиной, состоящей из фибрилл, которые выстилают внутреннюю поверхность ядерной оболочки и таким образом ограничивают нуклеоплазму. Считается, что ядерная ламина несет на себе функцию скелетной поддержки ядерной оболочки, обеспечивая тем самым целостность интерфазного ядра. Основным компонентом ядерной ламины, являются белки, называемые ламинами. Эти белки способны специфично связываются с хроматином. Остаточная ядерная ламина образована сетчато-волокнистой структурой, представленной морфологически сходными с промежуточными филаментами цитоскелета фибриллами. Кроме фибрилл, в составе остаточной ядерной оболочки выявляются остаточные поровые комплексы с центральными гранулами. Диаметр порового комплекса составляет около 100 нм, собственно поры имеют диаметр около 70 нм.
Остаточное ядрышко представлено электронно-плотной структурой, отличающейся по своей морфологии от других компонентов ядерного матрикса и связанной с компонентами скелетной структуры внутреннего ядерного матрикса. Основная масса белков в составе остаточного ядрышка относится к белкам, формирующим РНП-комплексы и ассоциированным с гяРНК (Dreyfuss et al., 1993). Это, как правило, белки, имеющие сродство к РНК и одноцепочечной ДНК.
Внутренний ядерный матрикс, представленный фибриллами и гранулами, наблюдается в препаратах ядерного матрикса в большинстве случаев. Диаметр фибрилл колеблется от 10 до 20 нм, среди них встречаются также тонкие волокна диаметром 3 нм. На толстых нитях фибрилл встречаются гранулы диаметром 20-30 нм (Berezney et al., 1995). В составе внутреннего ядерного матрикса найдено до тысячи различных белков, большинство из которых не охарактеризованы. Основную часть белкового состава внутреннего ядерного матрикса составляют белки-ламины А, В и С, ядерный белок В23, белки остаточных гяРНП-частиц (Nakayasu & Berezney, 1991), а так же ферменты, отвечающие за топологическую структуру хроматина и процессы реализации и воспроизводства генетической информации. К числу таких ферментов относятся ДНК топоизомеразы I и II, ДНК- и РНК-полимеразы, гистон деацетилаза, гистон-ацетилтрансфераза, гистон-метилтрансфераза, митоген-регулируемая гистон-НЗ-киназа и некоторые другие ферменты (Davie, 1995; Davie, 1997). Особое внимание следует уделить ДНК топоизомеразе II. Этот фермент находится в непосредственном контакте с прикрепленной к матриксу ДНК и принимает активное участие в топологических изменениях структуры хроматина. Около 60% ДНК-топоизомеразы II выявляется в ассоциации с фиброгранулярными компонентами внутриядерного матрикса (Berrios et al., 1985). Кроме того, этот фермент является одним из компонентов скэффолда метафазной хромосомы (Gasseref al., 1986; Meyer et al., 1997).
Первый метод выделения ядерного матрикса был предложен в работах (Berezney & Coffey, 1974; Berezney & Coffey, 1977). Этот метод основан на применении буфера с высокой ионной силой. Выделенные клеточные ядра инкубируют в растворе 2М NaCI для экстракции гистонов и других растворимых белков. Полученные в нуклеоиды подвергают обработке теми или иными нуклеазами с последующим осаждением быстро седиментирующихся структур. Таким образом удается разделить ядерную ДНК на две фракции - фракцию супернатанта, содержащую отрезанную от ядерного матрикса ДНК петель, и фракцию ДНК, прикрепленную к ядерному матриксу.
С использованием этого метода были получены первые результаты, показывающие, что транскрипционно активные и реплицирующиеся в данном типе клеток фрагменты ДНК находятся во фракции ДНК, ассоциированной с ядерным матриксом (Robinson et al., 1982; Razin et al., 1985; Berezney and Coffy, 1975/
Альтернативный метод получения ядерного матрикса (скэффолда) основан на действии 3,5-дийодосалицилата лития (LIS) (Mirkovitch et al., 1984). В этом случае удаление основной массы ядерных белков осуществляется более мягко, путем многократных промывок низкосолевым буфером, а для фрагментации ДНК в дегистонизированных ядрах применяют рестриктазы. Выделенные таким образом остаточными структурами клеточного ядра были названы ядерным скэффолдом.
Основным недостатком метода LIS-экстракции, как и метода экстракции при высокой ионной силе, является возможность перераспределения и захвата ядерным матриксом в процессе выделения тех фрагментов ДНК, которые не входили в состав ядерного матрикса in vivo. При дальнейшем анализе такие фрагменты невозможно отличить от ДНК, связанной с ядерным матриксом (скэффолдом) в живом организме.
Расщепление топоизомеразой II ядерного матрикса
В последние годы все большую популярность приобретают различные методы изучения организации хроматина, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ. Это связано с тем, что применение таких методик позволяет напрямую увидеть расположение используемых в виде проб последовательностей ДНК по отношению к петлям хроматина или клеточному ядру. В настоящей работе применяли метод гибридизации in situ с препаратами нуклеоидов, разработанный М. G. Gerdes с коллегами (Gerdes et al., 1994). Этот метод подробно описан в разделах «Материалы и Методы» и «Результаты и обсуждение».
Концепция соответствия петлевых доменов хроматина функциональным единицам генома основана в первую очередь на наблюдениях об ассоциации транскрипционно активных фрагментов ДНК с ядерным матриксом. Первые свидетельства в пользу этой концепции были получены в экспериментах по выделению прилежащей к ядерному матриксу фракции ДНК из предэкстрагированных 2 М NaCI интерфазных ядер (Robinson et al., 1982; Razin et a/., 1985). Позже эти наблюдения были подтверждены с использованием других методов (Jost and Seldran, 1984; Разин с соавт., 1985; Wei etal., 1999).
Практически во всех экспериментах активные гены наблюдались во фракции матричной ДНК, тогда как неактивные гены принадлежали не связанной с ядерным матриксом свободной фракции ДНК (Cook and Brazell, 1978; Small et al., 1985; Thorburn and Knowland, 1993 Разин с соавт., 1985; Wei et al., 1999; Nayler et al., 1998). Несмотря на это, при более детальном рассмотрении, результаты различных экспериментов не приводили к однозначным результатам. Так, для одних генов показана ассоциация с матриксом всей транскрибируемой области (Разин с соавт., 1985), для других - только нетранскрибируемых участков, как в случае генов рРНК (Bolla et al., 1985). Было высказано предположение, что причиной наблюдаемой ассоциации активных генов с ядерным матриксом является не наличие такой связи in vivo, а происходящая в процессе обработки преципитация транскрипционных комплексов на ядерный матрикс (Mirkovitch et al., 1984). Однако, множество эспериментальных данных, полученных с использованием разнообразных методик, опровергает это предположение.
Гипотеза о соответствии петельных доменов транскрипционным единицам косвенно подтверждается данными о нуклеазной чувствительности активных и неактивных локусов. Показано, что транскрипционно активный хроматин имеет повышенную чувствительность к ДНКзе I (Alevy et а/., 1984). Степень такой чувствительности определяется особенностями укладки хроматина на уровне нуклеосом и наднуклеосомных структур (Felsenfeld, 1992); Транскрипционно неактивные локусы, как правило, устойчивы к действию ДНКазы I по всей длине. В случае соседства нуклеазно-чувствительного и устойчивого доменов граница между ними всегда четко выражена, и положение этой границы фиксировано (Levy-Wilson and Fortier, 1989). Этот факт заставляет предполагать, что на границах единиц транскрипции располагаются последовательности, препятствующее распространению того или иного типа укладки хроматина дальше определенных пределов.
Было высказано предположение, что последовательностями, играющими роль структурно-функциональных разграничителей доменов хроматина, являются S/MARs. В этом случае транскрипционные регуляторные элементы одного домена не оказывают воздействия на экспрессию генов, находящихся в соседних доменах. Примерами, подтверждающими данную модель, служат кластер бета-глобиновых генов человека, ген куриного лизоцима, гены аполипопротеина и бета-интерферона человека (Boulikas, 1995; Bode, 1998) Другая концепция базируется на том, что функциональная активность хроматина регулируется только благодаря связыванию транскрипционных факторов в конкретной области, без необходимости их функционального разграничения (Dillon and Grosveld, 1994; Dillon and Sabbattini, 2000). Согласно этой гипотезе основную роль в поддержании анатомии и регуляции экспрессии генов играет только специфичность промоторов и энхансеров. По всей видимости, оба механизма сосуществуют.
Приготовление геномной ДНК лимфоцитов человека, заключенной в агарозные блоки
После депротеинизации агарозные блоки отмывали в буфере ТЕ при комнатной температуре 3 раза по 30 мин, 1 раз в буфере ТЕ, содержащем 0.2 М PMSF (Фенилметил Сульфонил Флуорид, ингибитор протеиназы К), и 3 раза в буфере ТЕ по 2 часа при температуре 50С.
После отмывки агарозные блоки помещали в буфер соответствующей рестриктазы на 30 минут. Рестрикцию проводили в свежем рестрикционном буфере в течение 4 часов при рекомендованной температуре и концентрации фермента 150 ед./мл, объем реакции составлял 0.5 мл на каждый агарозный блок.
По окончании расщепления, блоки отмывали 3 раза по 30 мин в растворе ТЕ, продукты расщепления анализировали пульс электрофорезом. В случае гидролиза геномной ДНК еще одной рестриктазой, блоки после отмывки инкубировали в соответствующем буфере и осуществляли гидролиз аналогично описанной процедуре.
Продукты гидролиза РАС ДНК и геномной ДНК после расщепления рестриктазами разделялась электрофорезом в пульсирующем поле с использованием аппарата Bio-Rad CHEF Mapper. Электрофорез вели в 1% агарозе, 0.5хТВЕ (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 1 мМ EDTA, рН 8,3) при 14С и напряженности поля 6 В/см. Время пульса и продолжительность электрофореза подбиралась в зависимости от рассматриваемого диапазона размеров фрагментов ДНК.
Перенос ДНК осуществляли в соответствии с описанной ранее методикой (Church and Gilbert, 1984; Sealey et a/., 1985). После электрофоретического разделения продуктов гидролиза экспонировали гель 40 сек под УФ-лампой, два раза по 15 мин выдерживали в денатурирующем растворе (0.4 М NaOH, 0.4 М NaCI), затем два раза по 15 мин в нейтрализующем растворе (0.5 М трис-НСІ рН 8, 1.5 М NaCI).
Перенос фрагментов ДНК из агарозного геля на нейлоновую мембрану (Hybond N) осуществляли капиллярным методом в 10xSSC в течение 12 часов при комнатной температуре. После этого промывали мембрану в растворе 2xSSC и фиксировали ДНК выдерживанием мембраны при 80С в течение 90 мин.
Применяли метод, предложенный A. Feinberg с соавторами (Feinberg et al., 1984). Общий объем реакции составлял 20 мкл. Для приготовления Р32 меченых ДНК проб в микропробирке смешивали воду и 30 - 50 нг ДНК, инкубировали 2 мин при 100С, добавляли 4 мкл буфера OLB (oligo-labeling
buffer: 0.25 M Трис-НСІ рН 8, 0.25 М МдСІ2, 20% 2-меркаптоэтанол, 0.02 М dGTP, 0.02 М dTTP, 1 М HEPES, рН 6.6), 1 мкл 10xBSA (10мг/мл), альфа-[32P]dATP и альфа-[32Р№СТР (по 20 тСі, 600 Сі/ттоІ), 10 ед. фрагмента Кленова ДНК полимеразы І Е. соїі, инкубировали при 37С 0.5 - 1 часа.
Полученные фрагменты ДНК очищали экстракцией смесью фенола и хлороформа (1:1), осаждали 2 объемами этанола с добавлением ацетата натрия до концентрации 0,3 М, промывали 75% этанолом и после высушивания осадка растворяли в 100 мкл буфера ТЕ, содержащего 0.6 М NaOH, 0.7 М NaCI.
Гибридизацию проводили в соответствии с описанным ранее методом (Church and Gilbert, 1984). Мембрану пропитывали раствором 2xSSC, инкубировали 2 ч при 68С в растворе, содержащем 0,5М NaH2P04 рН 7.0, 5% SDS, 1мМ EDTA, после чего добавляли пробу до концентрации 2x106 cpm/мл и проводили гибридизацию в течение 12-24 ч.
После гибридизации мембрану промывали 3 раза по 30 мин в растворе, содержащем 0.2xSSC, 0.1 % SDS при температуре 68С.
В случае гибридизации с олигонуклеотидами Т7 и Sp6 на всех стадиях использовали температуру 42С, мембрану после гибридизации промывали в растворе, содержащем 3xSSC, 0.1 % SDS.
Радиоактивные сигналы детектировали с использованием кассет «Phosphor-Image» и аппарата «Molecular Dynamics Storm», после чего пробы с мембраны удаляли кипящим раствором 0.5% SDS.
Для сравнения и анализа последовательностей нуклеотидов ДНК субклонов применяли программы пакета Genetic Computer Group (GCG) и, в частности, программу Fragment assembly system (FAS) этого пакета. CpG островки выявляли и анализировали при помощи программы CpG-plot.
Радиоавтографы блот-гибридизаций и сканированные после пульс электрофореза гели анализировали при помощи программного обеспечения Image Quant производства Molecular Dynamics (http://www.mdyn.com). Для выявления размеров и взаиморасположения отдельных фрагментов ДНК применяли программу Fragment Analysis.
Определение первичной структуры ДНК производили на автоматических секвенаторах ABI377 (Perkin-Elmer, ABI) и ALF (Apbiotech), полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с банком генов GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI, http//www.ncbi.nlm.nih.gov/) с использованием программ BlastN (Altschuch et al., 1990) и RepeatMasker (http://ftp.qenome.washington.edu/cqi-bin/).
Для выделения лимфоцитов, применяли образцы крови, взятые из пальца человека. 30 мкл свежей крови перемешивали с 1 мл буфера PBS (или среды RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки) в стандартной пробирке Eppendorf и инкубировали на льду 30 мин. После этого наносили на дно пробирки 100 мкл раствора Histopaque 1077 (Sigma) и центрифугировали с ускорением 200д в течение 3 мин при температуре 4С. Фазу, содержащую лимфоциты, аккуратно отбирали с использованием 100 мкл пипетки, и помещали в пробирку Eppendorf, содержащую 1 мл PBS. Затем осаждали лимфоциты центрифугированием с ускорением 200д в течение 3 мин при температуре 4С и удаляли супернатант. Лимфоциты использовали для приготовления препаратов ядерного гало.
Картирование представленных в виде геномных библиотек участков ДНК локуса хромосомы человека 16q22.1
Выявление в библиотеках генома человека бактериальных клонов, несущих плазмидные конструкции с фрагментами ДНК локуса хромосомы человека 16q22.1, являлось первоочередной задачей настоящей работы. Отбор таких клонов позволяет осуществлять картирование содержащихся в них фрагментов ДНК человека с целью использования этих клонов в экспериментах по идентификации и изучению новых генов. Для локализации клонов, в настоящей работе применяли библиотеки генома человека RPCI-1, RPCI-5 и RPCI-6 (http://www.chori.org.bacpac), сконструированные на основе РАС векторов (P1-Derived Artificial Chromosome). РАС библиотеки отличает высокий уровень стабильности клонированного генетического материала, удобство выделения необходимого количества ДНК и высокая представленность всех регионов соответствующих геномов.
Библиотеки скринировали с использованием радиоактивно меченых ДНК проб из LCAT генного кластера и ранее известных и принадлежащих региону генов и микросателлитных маркеров (Frengen et а/., 1995, 1997; Dogget et а/., 1996). ДНК выявленных в результате скрининга клонов гидролизовали с применением эндонуклеазы рестрикции Not\, разделяли при помощи пульс электрофореза, переносили на нейлоновые фильтры и гибридизовали с радиоактивно мечеными пробами, примененными ранее при скрининге. Эндонуклеаза рестрикции Not\ была выбрана для первоначального анализа клонов в связи с тем, что участки расщепления этого фермента в полилинкере РАС векторов фланкируют клонированный фрагмент с обеих сторон. Таким образом, при гидролизе ДНК отобранных клонов этой рестриктазой, вырезается полноразмерная вставка, фланкированная с одной стороны векторной последовательностью Т7, а с другой - последовательностью вектора Sp6. Использование олигонуклеотидов Т7 и Sp6 в качестве радиоактивно меченых ДНК зондов позволяет определять ориентацию клонированных фрагментов по отношению к полилинкеру РАС вектора.
Основываясь на результатах гибридизации, выявляли приблизительное взаиморасположение клонов и выбирали клоны для детального картирования с использованием большего числа ферментов рестрикции. Для этого ДНК выбранных клонов гидролизовали с использованием так называемых редкощепящих рестриктаз, способных расщеплять ДНК в CpG островках: Asc\, Bs/WI, BssHII, Eagl, Mlu\, Not\, Nru\. Кроме того, применяли все возможные двойные комбинации этих эндонуклеаз рестрикции. Продукты гидролиза разделяли при помощи пульс электрофореза, переносили на нейлоновые фильтры и гибридизовали с радиоактивно мечеными ДНК-пробами из локуса человеческой хромосомы 16q22.1 и олигонуклеотидами Т7 и Sp6.
В целях получения дополнительных проб, осуществляли субклонирование ДНК концевых фрагментов встроек некоторых клонов и фрагментов ДНК, фланкирующих внутренние участки расщепления эндонуклеазы рестрикции Not\. Для субклонирования использовали преимущественно рестриктазы Not\ и Sacll. Полученные субклоны так же использовали в гибридизационных экспериментах.
Основываясь на результатах гибридизации, строили рестрикционные карты клонов, которые в итоге объединили в единую карту перекрывающихся клонов - контиг. Полученный контиг, представляющий регион локуса хромосомы человека 16q22.1 размером 2.8 х 106 пар нуклеотидов, состоит из 152 бактериальных клонов (Рис. 6 Д).
Следует заметить, что построение контига осуществляли методом «прогулки по хромосоме». Для данного метода характерно расширение уже имеющегося контига за счет поэтапных «шагов» по хромосоме благодаря присоединению с обеих сторон новых клонов. Шаги осуществляли с помощью субклонирования концевых фрагментов клонов уже имеющегося контига и использования их как проб для скрининга библиотеки в целях поиска новых клонов. Выявленные клоны упорядочивали на карте и концевые фрагменты полученного контига снова применяли для скрининга библиотеки. Для того чтобы исключить возможность расширения контига за счет клонов, не принадлежащих исследуемому локусу, необходимо было сравнить структуру полученного контига со структурой соответствующего участка генома человека. Для этого осуществляли рестрикционное картирование на геномной ДНК с применением проб и субклонов, принадлежащих построенному контигу.
