Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1. Сателлитные ДЖ генома человека II
2. Альфоидные повторы генома человека и приматов 18
3. Повторявшеся последовательности ДЖ человека с дисперсным распределением в хромосомах 28
Цель и задачи исследования 35
Глава 2. Материалы и методы
1. Объекты исследования 37
2. Выделение и очистка ферментов 37
3. Выделение и очистка ДНК 38
4. Энзиматические реакции 40
5. Электрофорез ДНК и методы гибридизации ДНК/ДНК 41
6. Методы определения первичной структуры ДНК 42
7. Машинный анализ 45
Результаты и обсуждение
Глава 3. Анализ кластеризованных прицентромерных повторов генома человека
1. Конструирование и анализ кластеризованного, молекулярно-генетического маркера (МГМ) 3-й хромосомы (pRi-680-05) 49
2. Определение первичной структуры кластеризованного молекулярного маркера И-й хромо сомы fans 53)
50
3. Определение первичной структуры последователь ностей EcoRi -340-семейства альфоидной ДНК 53
4. Общая и физическая гетерогенность нуклеотидных последовательностей альфоидной ДНК человека 56
5. Анализ происхождениеальфоидной ДНК приматов и человека 62
Глава 4. Анализ повторов с дисперсным распределением в хромосомах человека
1. Определение первичной структуры клонированной последовательности pHS 35 65
2. Селективность клонирования некоторых типов последовательностей ДШ человека 66
3. Анализ хромосомного распределения специального типа Alu -последовательностей 68
Заключение 72
Выводы 75
Список литературы
- Альфоидные повторы генома человека и приматов
- Электрофорез ДНК и методы гибридизации ДНК/ДНК
- Конструирование и анализ кластеризованного, молекулярно-генетического маркера (МГМ) 3-й хромосомы (pRi-680-05)
- Определение первичной структуры клонированной последовательности pHS 35
Введение к работе
Настоящее исследование предпринято в рамках нового направления, развиваемого в лаборатории генетики ВНЦПЗ АМН СССР и направленного на разработку систематических методов картирования генома человека с помощью молекулярно-генетических маркеров хромосом в практических целях медико-генетического консультирования. Работа посвящена изучению некоторых классов сложно организованных повторяющихся элементов ДНК человека как возможного источника при конструировании молекулярных хромосомных маркеров.
Актуальность проблемы. ЭДцентификация генов человека, мутации которых являются причиной различных наследственных заболеваний, относится к наиболее актуальным задачам современной биологии и медицины. В последние годы в этой области достигнуты значительные успехи. Однако, это относится преимущественно к генам, контролирующим признаки с четким менделевским наследованием и, прежде всего, в тех случаях, когда первичные продукты генов известны и доступны для препаративного выделения. Между тем существует большое число как моногенных, так и мультифакториальных заболеваний, в случае которых идентификация генов обычными способами пока недоступна. Надежным, хотя и трудоемким способом поиска мутантных генов в таких случаях, может стать генетическое картирование на основе специальных коллекций молекулярно-генетических маркеров (МІМ) генома человека. Речь идет о "клонированных последовательностях геномной ДНК, с помощью которых можно установить межиндивидуальные различия по трем структурным характеристикам геномных фрагментов: размеру, копийности и локализации"/Гиндилис,1983/.
В настоящее время экспериментальная разработка указанного подхода ведется многими лабораториями в двух основных направлениях. Одно из них отдает предпочтение МІМ, принадлежащим к разряду уни-
кальных последовательностей ДНК, аллельные варианты которых в
гомологичных геноме идентифицируются по различиям в размере рестрикционных
фрагментов С ПОМОЩЬЮ бЛОТТИНГ-ГИбрИДИЗаЦИИ /Botstein et al,1980; Davies,1981;Martinville et al,1982; Nyman,White,1980/. В настоящее время
имеются прямые экспериментальные результаты, свидетельствующие об эффективности такого подхода для идентификации и выделения участков ДНК, содержащих менделевские гены, ответственные за определенные генетические нарушения (миопатия Дшшена - сцепленное С ПОЛОМ рецессивное заболевание / Murray et al,1982 / и
хорея Хентингтона - аутосомное доминантное заболевание
/ Gusella et al, 1983 /) .
Другое направление, развиваемое в лаборатории генетики ВНЦПЗ АМН СССР, основано на использовании в качестве МІМ повторяющихся последовательностей ДНК генома человека, межиндивидуальный полиморфизм которых выявляется по различиям в степени локальной копийности (кластеризованные МІМ) или их региональной локализации в хромосомах (диспергированные МІМ) /Ананьев,1982; Іиндилис,1982;Гиндилис,198 3/.
В отношении диспергированных повторов генома человека примеры полиморфизма на хромосомном уровне пока не опубликованы. При чувствительности и избирательности метода гибридизации ДНК на метафазных хромосомах in situ , достигнутых в настоящее время, пока только кластеризованные повторы можно серьезно рассматривать в качестве молекулярных маркеров хромосом. Однако, до настоящего момента данные о полиморфизме локальной копийности кластеризованных повторяющихся последовательностей получены лишь для тотальной фракции 11-го сателлита по 1-й хромосоме /Jones, Corneo,i97i /, для одного из клонированных фрагментов Ш-го сателлита ПО 1-Й, 9-Й И І6-Й хромосомам /Cooke,Hindlea,1981; Gosden et al,1981а / и для рибосошльной ДНК ПО 13-Й, 14-Й, 15-й, 21-й и
22-Й ХРОМОСОМЫ / Evans et al,1974; Varburton et al, 1976 /. Для остальных хромосом подобные кластеризованные МІМ не были обнаружены в работах зарубежных исследователей. В то же время, в геноме человека и приматов существует так называемая альфоидная ДОС /Maio,i97i / - класс сложных тандемно организованных повторяющихся последовательностей с длиной мономера в 169-172 п.н.
По данным гибридизации на метафазных хромосомах человека iw %tfu.
в основном эта ДНК локализуется в районах прицентромерного гетерохроматина
ХРОМОСОМ I, 3, 5, 6, 7, 10 И 19 /Manuelidis, 1978b /. Судя ПО
широкому хромосомному спектру, этот вид повторов должен быть перспективным источником клонирования кластеризованных прицентро-мерных МІМ хромосом. Однако, до недавнего времени общепринятым было мнение о высокой однородности нуклеотидных последовательностей ОСНОВНЫХ СемеЙСТВ аЛЬфОИДНОЙ ДОС человека /Manuelidis ,Wu, 1978; Wu.Manuelidis, 1980 /, ЧТО ДОЛЖНО 6ЫЛО бы СуЩЄСТВЄННО СНИЖЭТЬ
ее пригодность как источника МІМ.
К настоящему времени более обнадеживающие результаты, в отличие от ранее опубликованных, получены в нашей лаборатории. Так, показано, что некоторые клонированные последовательности, содержащие повторы альфоидной .ЩК, характеризуются разнообразной и специфической гибридизацией в районах прицентромерного гетерохроматина хромосом человека, а также полиморфизмом локальной повторенности. Последовательности другого типа характеризуются дисперсным распределением в хромосомах (см.Материалы и методы, 1). В то же время, отсутствие сведений о первичной структуре данных последовательностей затрудняло дальнейшую работу по поиску МШ.
В связи с этим цель настоящего исследования состояла в определении первичной структуры клонированных в нашей лаборатории
- 7 -молекулярных маркеров хромосом, что позволило бы однозначно установить их принадлежность к определенным семействам повторов ЩЕ. в геноме и наметить конкретные способы целенаправленного поиска и конструирования МІМ хромосом человека. Научная новизна результатов.
Обнаружен новый тип последовательностей Aiu -семейства, имеющий специфическую картину распределения в хромосомах человека.
Впервые определена первичная структура крупного фрагмента альфоидной ДіК человека (2,5 т.п.н.), специфического молекулярного маркера И-й хромосомы.
Впервые установлена нуклеотидная последовательность кластеризованного молекулярно-генетического маркера 3-й хромосомы и показано, что структурный полиморфизм в данном случае определяется особым типом альфоидной ,ВДК.
На основе машинного анализа нуклеотидных последовательностей альфоидной ДЦК человека и приматов показано, что:
а) альфоидные повторы имеют в качестве предшественника просто
организованную сателлитную ДНК, возможно состоящую из повторяю
щегося гептануклеотида tgaaaaa ,
б) внутривидовая вариабельность первичной структуры альфоидной
ДОС человека не ниже межвидовой вариабельности этой ДіК приматов
(разница между некоторыми последовательностями доходит до 4С$
нуклеотидных замен),
в) в эволюции основного мономера альфоидных повторов ДОС человека
(длиной І67-І7І п.н.) отсутствуют консервативные участки, вслед
ствие чего резко уменьшена возможность комплементарного спарива
ния в целом высоко гомологичных последовательностей.
Практическая ценность работы состоит в экспериментальном обосновании представления о том, что некоторые классы сложных
- 8 -повторов генома человека могут служить источником направленного конструирования специальных коллекций МІМ хромосом человека для дальнейшего их применения в цитогенетическом картировании генома и медико-генетическом консультировании.
Разработаны также новый экспресс-метод выделения выеокоочи-щенной лш^оцитарной ЩК /Шапиро,Зайцев и соавт.1982/ и модификация блоттинг-гибридизации /Зайцев ,Яковлев, 1983/, пригодные для массового популяционного исследования.
Альфоидные повторы генома человека и приматов
Высоко повторенная ДНК, впервые обнаруженная в геноме африканской зеленой мартышки Cercopitecus aethiops и названная ОС -компонентом / Maio, 1971 /, в настоящее время охарактеризована как класс приматоспецифических сложных тандемных повторов с при-центромерной хромосомной локализацией. По данным гибридизации in situ основная масса альфоидной ДНК человека локализуется в прицентромерных районах хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 19 и в коротких ПЛечаХ ПЯТИ ЭКрОЦеНТрИЧеСКИХ ХРОМОСОМ / Manuelidis, 1978b /.
Существуют косвенные данные о наличии и диспергированных альфо-идных последовательностей, но они основаны лишь на данных геномной блоттинг-гибридизации /Maio et аі, І98іь/ и гибридизации на КОЛОНИЯХ / Darling et al, 1981 /. ЭТИ СВЄДЄНИЯ ЄЩЄ НЄ ПОДТВврЖДвНЫ опытами по гибридизации альфоидной ДНК на метафазных хромосомах in situ .
Доля альфоидной ДЗК в геномах разных видов приматов оценивается В 1,5- 20% /Darling et al,1981; Manuelidis, 1978a; Maio et al, 1981a; Rosenberg et al, 1978 /. Наиболее СОДЄржаТЄЛЬННМ В ЭТОМ ОТНО шении является геном африканской зеленой мартышки (ASM). Этигл же определяется то, что первые работы по строению альфоидной ДНК выполнены именно на ее геноме.
Альфоидная ДШ приматов и человека в основном, если не полностью, состоит из тандемно повторенных сегментов длиной от 169 ДО 172 П.Н. / Darling et al,1981; Donehower, Gillespie, 1979; Donehower et al,1980; Fittler,1977; Manuelidis, Wu, 1978; Maresca, Singer, 1983; Rosenberg et al, 1978; Rubin et al, 1980a;Wu, Manuelidis, 1980 /. Присутствие сайтов для рестриктазы Hindin внутри большинства повторяющихся единиц альфоидной ДНК приматов определяет удобный способ выделения и очистки этих последовательностей. Обработка, например, ДНК АЗД этой рестриктазой выявляет в основном мономер альфоидной ДІК, а также, в небольшом количестве, мультимерные формы, возникающие в результате потери HindIII-саЙТОВ.
Первичная структура "усредненной" последовательности ("consensus" ) Hindin -семейства альфоидной ДНК А2М была первоначально определена без предварительного клонирования, непосредственно после препаративного электрофореза Hindin- перевара ДНК АШ /Rosenberg et al, 1978 / Таким же образом была определена первичная "consensus " -структура последовательностей Hindin -семейства альфоИДНОЙ ДНК бабуина (Papio papio )/Donehower et al, 1980 / и ма_ КаКИ (Масаса radiata )/ Rubin et al, 1980a /, представляющих собой димеры альфоидного повтора. Апьфоидная ДНК генома человека не выделяется в виде отдельного СатеЛЛИТа При ИЗОПИКНИЧеСКОМ центрифугировании /Manuelidis, 1978а /, однако имеет в целом те же характеристики, как и у описанных приматов, и выявляется, в основном, как набор семейств ECORI
И НаеШ -реСТрИКЦИОННЫХ ПОВТОРОВ / Darling et al, 1981; Manuelidis, 1978a /(см.также рис.12). По-видимому, подобная же макроструктура альфоидной ДНК присуща геномам гориллы ( Gorilla gorilla ) и шимпанзе ( Pan troglodytes )/ Maio, et al, 1981a/, Первичную Структуру нуклеотидных последовательностей ECORI -340- и ECORI -680-рестрикционных семейств альфоидной ДНК человека (как и нуклеотид-ные последовательности Hindin -рестрикционных семейств АЗУІ, ма - 20 каки и бабуина) удалось определить непосредственно после препаративного электрофореза ECORI -перевара геномной да человека
Однозначность нуклеотидных последовательностей, определяемых при сиквенировании основных рестрикционных семейств альфоид-ной ДНК приматов и человека без использования предварительного клонирования, привела исследователей к выводу о высокой внутривидовой консервативности повторов ДОС этого класса. Сиквенирова-ние индивидуальных клонированных последовательностей Hindin -СемеЙСТВа АЕМ, Проведенное ТэЙероМ И СОЭВТ./ Thayer et al, 1981/, выявило внутреннюю гетерогенность нуклеотидных последовательностей этого семейства всего лишь в 3% нуклеотидных замен. По различным оценкам гетерогенность ECORI -340/680-рестрикционных семейств альфоидной ДОС человека считается также очень низкой (I - 3%)/ Darling et al, 1981; Wu, Manuelidis, 1980 /. При СИКВвНИро вании клонированных альфоидных последовательностей, не принадлежащих к основным рестрикционным семействам, было показано их значительное отличие ( 20%) от мажорных компонентов альфоидной ДОС, Соответственно, АШ /Maresca, Singer, 1983 / и человека /Potter, Jones, 1983 /, однако пока не установлены, как общий вклад таких минорных альфоидных последовательностей, так и их хромосомная локализация.
Длина мономера альфоидных повторов приматов составляет I7I-I72 п.н. (АЕМ, бабуин, макака). Для альфоидной ДОС человека характерны мономеры двух вариантов - 171 и 169 п.н., чередующиеся ДРУГ за ДРУГОМ В составе ДЛИННЫХ Тандемов /Darling et а1,19&1; Manuelidis, 1978a; Wu, Manuelidis, 1980 /.
Электрофорез ДНК и методы гибридизации ДНК/ДНК
Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле осуществляли по Максаму и Гилберту /махат, Gilbert, 1980 /. В любом случае после окончания электрофореза полоски геля, содержащие необходимые фракции ДНК вырезали либо с использованием окрашивания в бромистом этидии под мягким ультрафиолетовым освещением (366 нм), либо, в случае использования меченных образцов, после короткой (5-20 мин) радиоавтографии и использованием автографа как шаблона. Экстракцию ДНК из 8%-го полиакриламидного геля вели по Максаму и Гилберту с использованием чисто технических модификаций.
Аналитический и препаративный электрофорез в 0,7 - 1,5%-м агарозном геле /sharp et ai, 1973/ вели одинаковым образом в Трис-боратном буфере /Maniatis et ai, 1982 /. Для внесения образцов использовали буфер следующего состава: 10% глицерина; 10 мМ Трис НСІ рН8,0; 5 мМ ЭДТА ; 0,5% лаурилсаркозината натрия и 0,01% бромфенолового синего. Добавление лаурилсаркозината значительно улучшало разрешение в образцах с большим количеством белка, по -скольку, при полной депротеинизации ДОС, лаурилсаркозинат, в отличие, например, от лаурилсульфата, не образует мицеллярного комплекса С белками /Creusot, Cristman, 1980 /.
Преренос ДОС из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр для гибридизации по Саузерну / Southern, 1975 / осуществляли с использованием экспресс-модификации /Зайцев,Яковлев,1983/,
Гибридизацию ДОС рекомбинантных клонов на колониях производили по стандартной методике /Grunstein, Hogness, 1975 / в модификации / Thayer, 1979 /, Обычно на каждом фильтре гибридизовали ДОС с полной активностью 10 - 10 имп/мин при удельной активности 10- 109имп/мкг/мин.
Гибридизацию 11-ДОС на метафазных хромосомах in situ вели по стандартной методике /Gall, Pardue, 1971 / с модификациями /Юров, 1984/. Хромосомные препараты для гибридизации готовили из лимфоцитов периферической крови, культивируемых по стандартной методи /Nfeorhead et al, 1970/ 0 ке. Гибридизацию осуществляли при 37 С в течение 5-18 часов в гибридизационной смеси, содержащей 2 х ssc , 50% формамида и IOfo сульфатдекстрана. Обычно на стекло давали Ъ-ДОС с общей активностью 5»105 имп/мин при удельной активности 1-2»10 имп/мин/ /мкг.
Химическую модификаций оснований осуществляли по методу Максама и Гилберта / Maxam, Gilbert, 1980 / в твердофазном варианте /Чувпило Кравченко,1983/.
Структурный электрофорез вели в 6%-м полиакриламидном геле размерами 58x20x0,03 см с использованием градиента Трис-боратного буфера / Biggin et ai, 1983 /, что позволяло прочитывать с каждого конца последовательности до 400 нуклеотидов за один электрофорез. После окончания электрофореза снимали верхнее стекло, мочевину из геля отмывали 5 - 7-ю сменами 6%-й ТХУ, затем гель непосредственно на стекле сушили в потоке горячего воздуха в течение I -- 2-х часов. Радиоавтографию осуществляли на рентгеновской пленке РМ-В (Тасма,СССР) без усиливающего экрана при комнатной температуре в течение 0,5 - 10 суток. ДЛЯ Определения ПерВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ pRI-680-05 этот фрагмент последовательности pHS 05 был переклонирован в вектор рис 19 / Messing, viera, 1982 / в двух ориентациях относительно полилинкера. После лигирования плазмиды трансформировали в штамм
E.coli ВМН7ІІ8 ( recA, lacZ) /см. Maniatis et al, 1982 /. КЛОНЫ
отбирали, как обычно принято для плазмид этой серии, на индикаторных чашках с x-gai . После введения метки по 3 -положению в Ватні -сайт, пробу переносили на 75С для 15-шшутной инактивации фрагмента Кленова. После охлаждения добавляли рестриктазу Psti для отщепления остатка полилинкера. В пробу добавляли формамид до 25% и бромфеноловый синий до 0,03%, прогревали при 95С в течение 3-х минут и вносили в ячейку 1%-го агарозного геля (под напряжением) для проведения препаративного электрофореза. Предварительная денатурация образца ДНК с концевой меткой была полезна для очистки нативного фрагмента от фрагментов со случайными однонитевыми разрывами. Иммобилизацию меченых фрагментов ДНК на носителе (DE-81, Whatman ) осуществляли электрофо-ретически, непосредственно в том же агарозном геле. Полоски ДЕАЕ-бумаги отмывали в 50%-м этаноле, сушили, резали на четыре части и вслед за этим вели химическую модификацию ДНК непосредственно на носителе по методу Чувпило и Кравченко /Чувпило,Кравченко, 1983/.
Конструирование и анализ кластеризованного, молекулярно-генетического маркера (МГМ) 3-й хромосомы (pRi-680-05)
Рестрикционный анализ Psti -вставки плазмиды pHS 05 (общая джша около 3 т.п.н.) выявляет в этой последовательности два внутренних EcoRi-фрагмента длиной 680 п.н., один фрагмент длиной 510 п.н. и несколько фрагментов по 340 п.н. Обработка Bspi ( НаеШ) дает один фрагмент длиной 510 п.н., несколько фрагментов по 340 п.н. и 170 п.н. (рис.2), что предполагает тандемно организованную альфоидную структуру на протяжении всей данной последовательности. Тем не менее, асимметрия хромосомного распределения, показанная для pHS 05 (см.Материалы и методы,1), до сих пор была неизвестна для альфоидных повторов, поэтому необходимо было установить первичную структуру того компонента последовательности pHS 05 , который опосредует эту асимметрию.
Последовательность PHSOS была расщеплена рестриктазой EcoRi , фрагменты длиной 680, 510 и 340 п.н. были выделены с помощью препаративного электрофореза и переклонированы в специальную плаз-миду рис 19 (см.Материалы и методы,6). В первую очередь анализировали плазмиды, содержащие EcoRi -фрагменты длиной 680 и 510 п.н. (ранее проведенные исследования по гибридизации клонированных EcoRi -фрагментов альфоидной ДНК длиной 340 п.н. ни в одном случае не давали асимметрии при гибридизации на метафазных хромосомах in situ /Зайцев и соавт.1982; Яковлев,1983/). Опыты по гибридизации ПОЛучеННЫХ СубКЛОНОВ pRI-680-05 И pRI-510-05 НЭ МетафЭЗ ных хромосомах in situ выявили асимметрию распределения для обоих фрагментов по третьей паре хромосом (рис.3). Поскольку субклоны в равной мере обладали искомым свойством, для сиквени рования был выбран больший из них - pRi-680-05 . Уже охарактеризованную плазмиду pRi-680-05 расщепляли эндонуклеазой EcoRI, СПШ— вали лигазой и повторно трасформировали в штамм Е. coli BMH7II8. Такая процедура была необходима для получения плазмид с EcoRI -вставкой в двух различных ориентациях относительно полилинкера. Предварительно мы не определяли ориентации вставок, поскольку это было проще сделать непосредственно при сиквенировании с одновременным установлением первичной структуры фрагмента.
Нуклеотидная последовательность pRi-680-os приведена на рис.4. Предварительный анализ этой последовательности показал, что в целом она относится EcoRI -680- семейству альфоидных рестрикционных повторов, состоит из четырех тандемно расположенных мономеров по 171, 169, 171 и 169 п.н., что характерно для повторов этого семейства /wu, Manueiidis, 1980 /. Однако, в отличие от "усредненной" последовательности EcoRi-680- consensus1 , , последовательность pRi-680-05 обладает рядом особенностей, которые будут проанализированы ниже, вместе с остальными данными по первичной структуре альфоидной ДНК.
Последовательность pHS 53 , так же как и pHS 05 представляет собой Psti -фрагмент геномной ДНК длиной около 2,5 т.п.н., клонированный в плазмиде PKNOOI . При гидбидизации на метафаз-ных хромосомах in situ эта повторяющаяся последовательность обладает уникальным свойством гибридизоваться.почти исключительно в районе прицентромерного гетерохроматина її-й хромосомы (см.Материалы и методы,1, рис.1). Эксперименты по геномной блоттинг-гиб-ридизации PHS 53 показали, что она содержит нуклеотидные последовательности альфоидной природы, поскольку дает гибридизацию с -некоторыми EcoRi -повторами /Зайцев,Яковлев, 1983; Яковлев, 1983/. Рестрикционныи анализ pHS 53 с помощью эндонуклеазы Bspi выявил кроме концевых фрагментов в 130 и 210 п.н., набор внутренних фрагментов длиной 340 и 170 п.н. (рис.5), что также говорит в пользу альфоидной природы данной последовательности. Тем не менее, столь необычное сочетание свойств pHS 53 (альфоидная ДНК, не ги-бридизукщаяся на хромосомах в обычных локусах) не может быть понято без определения её полной нуклеотидной последовательности.
Сиквенирование pHS 53 имело несколько проблем, которые удалось решить только с применением так называемой стратегии "кило-сиквенс" /Barnes, Bevan, 1983; Hong, 1982 /. Данную стратегию адап-тировали с использованием плазмиды рік: 18 специально для клонирования в гесА -штамме НВІ0І, поскольку наличие многократных тандемов опасно возможностью интенсивной рекомбинации и артефактов при установлении полной структуры.
Первое переклонирование последовательности из pKNOOl В рис 18 осуществляли по сайту эндонуклеазы Psti , по которому эта последовательность и была первоначально клонирована. Отбор клонов осуществляли с помощью метода гибридизации ДТЖ на колониях. Полученные плазмиды анализировали по трем параметрам: а) наличие неизменённой вставки по сравнению с исходной формой,б) отбор двух плазмид с разными ориентациями вставки,в) поиск эндонуклеаз из числа входящих в полилинкер вектора рис 18 и не имеющих внутренних сайтов для PHS 53. Рестриктный анализ двух таких отобранных плазмид показан на рис.6. Были также отобраны эндонуклеазы Ватні, EcoRi и Said , удобные для повторного переклонирования, не имеющие сайтов внутри последовательности pHS 53 .
Определение первичной структуры клонированной последовательности pHS 35
Для определения первичной структуры последовательности pHS35 вначале из плазмиды с помощью препаративного электрофореза выделяли ее Psti -вставку (общая длина 990 п.н.). Далее вставку расщепляли рестриктазой Bspi (Наеіп ) на три фрагмента: А (380 п.н.); В (350 п.н.) и С (260 п.н.). Структурный анализ фрагментов А и С осуществляли по Максаму и Гилберту после вве 32 дения З -концевой метки с помощью фрагмента Кленова и( ос Р) d SP BBspi -концы молекул. Psti -концы при этом оставались нвмененными. На рис.19 представлена общая структура pHS35 и нуклеотидные последовательности А и С - субфрагментов. Оба субфрагмента содержат последовательности, принадлежащие Alu-семей-ству повторов, однако имеют существенные отличия. На рис.19 обе Alu -последовательности представлены в сравнении с последовательностью Alu- "consensus" / Deininger et ai,i98i /. Нумерация нуклеотидов в обоих субфрагментах также дана по общеупотребительной нумерации для Alu _ последовательностей. Aiu_35-C имеет НИЗКУЮ Общую СТепеНЬ ГОМОЛОГИИ С Alu-Mconsensus" ( 60%) . Alu -35-А кроме того имеет два внутренних совершенных прямых повтора длиной 21 п.н., что до сих пор не было обнаружено ДЛЯ Alu -последо вательностей.
Для того чтобы определить вклад внутреннего района последовательности pHS35 в ее гибридизацию на метафазных хромосомах in situ , мы провели качественное определение относительной копийности в геноме Bspi - субфрагментов А, В и С с помощью обратной блоттинг-гибридизации. Результаты такого эксперимента, представленные на рис.20, показывают, что основной вклад в гибридизацию pHS35 дают субфрагменты А и С, содержащие Aiu -повторы.
Обсуждая вопрос о том, насколько редко могут встречаться в последовательностях Aiu -семейства внутренние совершенные повторы, следует обратить внимание на то, что большая часть просиквенированных к настоящему времени ALu -последовательностей была клонирована BPBR322 после ренатурации и обработки si-нуклеазой / Deininger et ai, 1981 /. При этом подходе, во-первых, должен клонироваться довольно узкий класс последовательностей, во-вторых, остается вероятность того, что всякий раз в результате репарации при клонировании, получаются некие "усредненные" последовательности, возможно не имеющие точных аналогов в геноме человека.
Дополнительным фактором уменьшения наблюдаемой вариабельности первичной структуры Aiu-семейства последовательностей является, по-видимому, и другое обстоятельство, связанное с тем, что определенные представители этого семейства могут быть нестабильными при их клонировании в обычных плазмидных векторах. Важным указанием на это служит тот факт, что последовательность PHS35 при переклонировании ее в векторные плазмиды рЮ8 , puci9 и pUR250 / Ruter, 1982 / ни в одном случае не дала устой чивых рекомбинантных плазмид. В отличие, например от альфоидных последовательностей, описанных в данной работе, колонии, содержащие pHS35 -вставку в плазмиды pucis , puci9 и pUR250 давали непрерывную сегрегацию по цвету и форме колоний на индикаторных чашках с x-gai . Аналогично, все колонии из EcoRi-340 -клонотеки фрагментов, клонированных в pBR325 и несущих последовательности, гомологичные pHS35 имели аномальные плазмидные варианты вплоть до потери сайтов для эндонуклеазы EcoRi (см.рис.II и табл.2). Во всех описанных случаях "запрещенная" рекомбинация происходила В гесА -ШТаММе E.coli НВ101 " ИЛИ BNH7118
Остается предположить, что устойчивое поведение последовательности рШ35 в векторной плазмиде рююоі ,в которой она и была первоначально клонирована, отражает свойства, присущие самой этой плазмиде. Как известно, встраивание в рюші экзогенной ДНК по сайту рестриктазы Psti нарушает действие гена kill бактериофага ш . В противном случае ген kill лизирует клетку. На этом основана положительная селекция при клонировании в ркмюі /Schumann, L8gi, 1980 /. По существу, плазмида pKNOOi в бактериальной клетке представляет собой мини Ми -фіаг в лизогенном состоянии, которое устанавливается сразу после трансформации. Инсерция экзогенного фрагмента ЩК между промотором Рг и геном kin приводит к тому, что зарепрессироваыие промотора РГ успевает произойти раньше, чем накопится достаточное количество продукта гена kill .
