Введение к работе
А ктуалыюст ь работ ы
Пространственная организация хромосом в ядре является одной из ключевых проблем современной клеточной биологии. В настоящий момент для клеток большинства животных (Cremer, 2001), растений (Pecinka et al., 2004; Berr et al., 2006), а также одноклеточных эукариот, таких как почкующиеся и делящиеся дрожжи (Bystricky et al., 2005; Molnar, Kleckner, 2008) экспериментально доказано, что хромосомы занимают в интерфазном ядре определенные хромосомные территории. В основе трехмерной организации интерфазного ядра эукариот лежит дифференциальное позиционирование различных районов хромосом относительно друг друга и ядерной оболочки. Известно, что гены, хромосомные сегменты и геном как целое трехмерно упорядочены в пространстве ядра и их специфические ассоциации, очевидно, позволяют регулировать позиции определенных генных продуктов внутри ядра и их транспорт в цитоплазму. Организация хромосом в ядре строго детерминирована, однако механизм, управляющий этой детерминацией, остается невыясненным. Жёсткая пространственная организация и функциональность ядра обеспечиваются наличием двух типов связей - межхромосомных взаимодействий (Куличков, Жимулев, 1976) и хромосомно-мембранных (Стегний, 1979).
Муха Calliphora erythrocephala является интересным объектом с точки зрения изучения пространственной организации хромосом в ядре. У С. erythrocephala политенные хромосомы обнаружены в ядрах клеток слюнных желез (Handa et al., 1981), клетках эпидермиса (Pearson, 1974), трофоцитах (Ribbert, Bier, 1969), трихогенных клетках (Ribbert, 1967), клетках мальпигиевых сосудов (Thomson, Gunson, 1970). Описаны четкие тканеспецифичные особенности в степени политении и типе организации политенных ядер, что вероятно связано с разным функциональным значением этих тканей. В ядрах клеток слюнных желез С. erythrocephala на всех этапах политенизации выявляются политенные хромосомы. Синапсис хроматид у таких хромосом ослаблен, хромосомы рыхлые, а поперечный рисунок сохраняется только в области наиболее крупных дисков. Организация ядер трофоцитов существенно отличается от стандартных типов организации политенного ядра. В ядрах трофоцитов политенные хромосомы в ходе эндоредупликации претерпевают ряд морфологических изменений (Bier, 1957). На начальных этапах политенизации ядра трофоцитов организованы в первичную ретикулярную структуру, далее в ходе эндоредупликации происходит формирование политенных хромосом, затем, помпоновидных хромосом. Помпоновидные хромосомы декомпактизуются и происходит формирование ядра с ретикулярной структурой, но только с высоким уровнем политении.
Столь существенные различия в характере организации хромосом в ходе политенизации в органах одного организма, вероятно, связаны с
функциональной особенностью данных типов клеток и, следовательно, особенностью функционирования генома.
Ранее было показано, что в ядрах трофоцитов С. erythrocephala
взаиморасположение хромосом подчиняется определенным
закономерностям. Центромерные районы хромосом трофоцитов не объединены в хромоцентр и рассредоточены в пространстве ядра. Хромосома 6 всегда связана тонким тяжом с хромосомой 2. Хромосома 4 располагается рядом с хромосомой 3 и 5, а 5 — с хромосомой 1. Таким образом, зачастую можно обнаружить следующее ассоциированное распределение хромосом: 6 — 2, 4 — 3, 5-1 (Стегний и др., 1999). Было показано, что хромосомы 3 и 6 сохраняют локальные хромосомные территории в объеме ядра на протяжении всего процесса политенизации ядер трофоцитов (Ананьина, 2005). Эти результаты по пространственной организации ядер трофоцитов С. erythrocephala были получены на давленых препаратах ядер на стадии с политенными хромосомами. Как известно, ядро трехмерно и поэтому наиболее полное представление о расположении хромосом может быть получено только при изучении трехмерного пространства ядра.
В работах Бойса (Boyes at al., 1975) было показано, что хромосома 6 С. erythrocephala содержит гены рРНК, транскрипция которых сопровождается образованием ядрышка. Однако до сих пор не было получено данных относительно того, только ли хромосома 6 является ядрышкообразующей.
Ядрышко - эволюционно-консервативный и наиболее крупный структурный домен клеточного ядра, который принято называть «фабрикой рибосом» (Olson et al., 2002; Andersen et al., 2005). За последние годы получены убедительные доказательства того, что большое количество биологических процессов, таких как старение клеток, модификация РНК, контроль клеточного цикла и ответ на стрессирующие факторы регулируется ядрышком (Olson, 2002; Tschochner, 2003; Grummt, 2005; Boisvert, 2007; Mayer, 2005; Sirri, 2008; McKeown, Shaw, 2009). Эти наблюдения позволяют говорить о многофункциональности ядрышка и его основных белков. Кроме того, было показано, что в клетках человека ядрышко и ядерная оболочка являются своеобразным каркасом для организации ядра (Chubb et al. 2002). Не вызывает сомнения тот факт, что ядрышко играет важную роль в пространственной организации ядра. Однако, как происходит влияние ядрышка на архитектуру ядра все же остается не известно. Понимание законов организации хромосом в пространстве ядра и роли ядрышка в этом процессе существенно приблизит к разгадке принципов реализации генетического материала в ядре.
В настоящее время успехи молекулярной биологии в сочетании с развивающимися технологиями позволяют изучать организацию хромосом в трехмерном пространстве ядра. Это достигается путем получения серии оптических срезов ядра при помощи специальных микроскопических подходов. В результате дальнейшей реконструкции и моделирования
объемного изображения становится возможным детально анализировать пространственную организацию хромосом в ядре.
Изучение организации хромосомы 6 и ядрышка в пространстве ядер трофоцитов и клеток слюнных желез С. erythrocephala имеет большое значение для понимания особенностей организации и функционирования генома в ядрах соматических клеток и клеток генеративной системы, клеток с разной морфологической структурой политенных хромосом, выполняющих разные функции. Цель работы
Целью исследования является анализ организации
ядрышкообразующей хромосомы 6 и ядрышка в пространстве ядер трофоцитов и клеток слюнных желез С. erythrocephala с разным уровнем политенизации. Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. В пространстве ядер трофоцитов С. erythrocephala изучить
организацию ядрышкообразующей хромосомы 6 и генов рРНК в ходе
политенизации с помощью метода 3D флуоресцентной in situ гибридизации
(3D FISH).
2. В пространстве ядер клеток слюнных желез С. erythrocephala
изучить организацию ядрышкообразующей хромосомы 6 и генов рРНК в
ходе политенизации с помощью метода 3D флуоресцентной in situ
гибридизации (3D FISH).
-
Определить локализацию кластера генов рРНК в пространстве ядер трофоцитов и клеток слюнных желез С. erythrocephala.
-
Провести анализ пространственной организации ядрышка в ядрах трофоцитов и клеток слюнных желез С. erythrocephala с разным уровнем политенизации с помощью окрашивания недавленных препаратов ядер азотнокислым серебром.
Научная новизна
Установлено, что ядрышкоорганизующей хромосомой у С. erythrocephala является только хромосома 6, так как кластер генов рРНК локализован исключительно в пределах хромосомной территории хромосомы 6. Впервые показано, что в ходе политенизации ядер происходит изменение организации ядрышкоорганизующей хромосомы 6 как в ядрах соматических клеток, так и клеток генеративной системы С. erythrocephala (клетки слюнных желез и трофоциты). Показано, что распад ядрышка, занимающего центральное положение в ядре на начальных этапах политенизации, на микроядрышки, распределенные в пространстве ядра в высокополитенных ядрах, коррелирует с изменением организации ядрышкоорганизующей хромосомы 6. Научно-практическая значимость работы
Результаты проведенного исследования позволяют расширить представление о закономерностях пространственной организации хромосом в ядре эукариотических организмов. Результаты данной работы могут быть
использованы в курсах лекций по клеточной биологии для студентов биологических факультетов. Положения, выносимые на защиту
1. Ядрышкоорганизующей хромосомой у С. erythrocephala является
хромосома 6;
2. Процесс политенизации ядер трофоцитов и клеток слюнных желез
сопровождается перемещением хромосомы 6 и рибосомных генов на
периферию ядра и распадом ядрышка на микроядрышки.
Апробация работы
Полученные результаты исследования были представлены: на международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2009); на международной конференции «Хромосома-2009» (Новосибирск, 2009); на международной конференции молодых ученых "Биология: от молекулы до биосферы" (Харьков, Украина, 2009); на международной конференции по кариосистематике «KARYO V» (Новосибирск, 2010); на международной научной конференции «Молодежь и прогресс в биологии» (International scientific conference «Youth and progress of biology»), (Львов, Украина, 2011); По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 5 статей в журналах перечня ВАК.
Вклад автора
Основные результаты работы были получены автором самостоятельно. Анализ ультраструктуры ядер трофоцитов С. erythrocephala проводился совместно с А.А. Миллером (НПО «Вирион», г. Томск).
Структура и объем диссертации
Похожие диссертации на Изменение пространственной организации хромосомы 6 в ядрах трофоцитов и клеток слюнных желез Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) в процессе политенизации
