Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Эндотелий и тельца Вейбеля-Палада.
1.1 .Тельца Вейбеля-Паллада, фактор Виллибранда.
1.2. Особенности организации цитоскелета эндотелиальных экзоцитоз тВП.
1.3. Воздействие тромбина на эндотелиальные клетки
2. Цитоскелет и внутриклеточный транспорт
2.1. Система микротрубочек.
2.2. Актиновый цитоскелет
2.3. Промежуточные филаменты.
3. Центросома.
3.1. Структура и состав центросомы.
3.2. Роль центросомы в клеточном цикле и митозе.
3.3. Редупликация центросомы
3.4. Центросома и внешние сигналы
4. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Клеточные культуры
1.1. Культура эндотелиальных клеток аорты человека
1.2. Культура эндотелиальных клеток пупочной вены человека 2.Иммунофлюоресцентные исследования
3. Электронная микроскопия
3.1. Стандартная электронная микроскопия
3.2.Иммуннопероксидазное окрашивание для электронной микроскопии 41
4. Реактивы, использованные в работе 42
5. Статистическая обработка данных 43
РЕЗУЛЬТАТЫ 45
1. Структура цитоскелета и локализация телец Вейбеля-Паллада в клетках культуры эндотелия аорты.
2. Перераспределение тВП в клетках, инкубированных с тромбином. 47
3. Перераспределение тВП в клетках, обработанных колцемидом. 49
4. Перераспределение тВП в клетках инкубированных в среде цитохалазином В.
Перераспределение телец ВП в клетках, обработанных каликулином А 54
6. Является ли движение тВП к центросоме специфической реакцией всех эндотелиальных клеток человека, или эта реакция характерна только для НАЕС?
6.1. Воздействие тромбина на клетки культуры HUVEC. 56
6.2. Воздействие цитохалазина Б на клетки культуры HUVEC 57
6.3. Воздействие каликулина А на клетки культуры HUVEC 57
7. Реорганизация центросомы в эндотелиальных клетках при воздействиях, вызывающих образование кластеров тВП у ЦОМТ.
7.1. Подсчет количества сателлитов в эндотелиальных клетках до и на ранних сроках после добавления тромбина
7.2. Иммуноэлектронное окрашивание центросомальной области эндотелиальных клеток антителами к посттрансляционно модифицированному тубулину.
7.2.1 Окрашивание клеток НАЕС антителами к тирозинированному тубулину
7.2.2. Окрашивание клеток HUVEC антителами к тирозинированному тубулину
7.1.3.Окрашивание клеток НАЕС антителами к ацетилированному тубулину
7.1.4. Окрашивание клеток HUVEC антителами к ацетилированному тубулину
ОБСУЖДЕНИЕ 67
1. Перемещение тВП к центросоме 67
2. Взаимодействие тВП с компонентами цитоскелета 72
3. Изменение организации центросомы в эндотелиальных клетках при действии тромбина
3.1. Изменение числа центриолярных сателлитов в НАЕС 77
3.2.Изменение интенсивности окрашивания центриолей ЭК антителами к пост трансляционно модифицированному тубулину при действии тромбина
4. Различия в транспорте и распределении тВП в эндотелиальных клетках, выделенных из аорты и пупочной вены человека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86
ВЫВОДЫ 88
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 90
РИСУНКИ 115
Введение к работе
Эндотелиальные клетки являются основным источником плазматического фактора вон Виллибранда (ФВ), большого мультимерного белка, играющего важную роль в гемостазе. Этот белок накапливается в специфических секреторно-запасающих гранулах эндотелиальных клеток, тельцах Вейбеля-Палада (тВП). При экзоцитозе тВП ФВ высвобождается в виде крупного мультимера, который более активно индуцирует агглютинацию тромбоцитов (Moake et al, 1986) и более эффективно связывается с внеклеточным матриксом (Sporn et al, 1987), чем более мелкие формы этого белка. Массированный экзоцитоз тВП из эндотелиальных клеток происходит в ответ на воздействие некоторыми стимулирующими секрецию агентами, в том числе тромбином (Levin et al, 1982), который обладает протеазной активностью и участвует в каскаде свертывания крови. В мембране тВП находится трансмембранный белок GMP-140, который при экзоцитозе тВП попадает на плазматическую мембрану (Hattori et al, 1989) и функционирует, там как молекула адгезии для нейтрофилов (Geng et al, 1990). Таким образом, запасание и высвобождение тВП является важным элементом участия эндотелиальных клеток как в процессе гемостаза, так и при развитии воспалительных процессов, протекающих в кровеносных сосудах.
Ряд доказательств свидетельствует в пользу того, что количество запасаемых тВП и полярность регулируемого экзоцитоза зависят от организации цитоскелета эндотелиальных клеток. Так целый ряд работ показывает, что в ответ на воздействия, приводящие к долговременным перестройкам цитоскелета, в эндотелиальных клетках происходят заметные изменения как в количестве тВП, так и в уровне высвобождения ФВ, хотя уровень ФВ-специфической мРНК при этом не изменяется (Reinders et al, 1987; Molony and Amstrong, 1991; Galbusera et al, 1997; Galbraith et al, 1998). А эндотелиальные клетки, растущие на коллагеновом геле и на поликарбонатных фильтрах, демонстрируют противоположную полярность экзоцитоза тВП в ответ на одно и тоже воздействие форболовым эфиром, стимулирующим секрецию (Sporn et al, 1987; van Buul-Wortelboer et al, 1989). Эта разница, вероятно, обусловлена различной организацией цитоскелета, заданной двумя разными субстратами, на которых выращивались клетки. Ряд данных показывает, что во время некоторых сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз (Yost and Herman, 1988) происходят изменения в организации цитоскелета, а при сравнительном анализе эндотелиальных клеток из эмбриональных аорт или из аорт взрослых с атеросклеротическими поражениями или липидными бляшками было показано, что в эндотелиальных клетках, выделенных из пораженных сосудов, наблюдаются изменения в длине и триплетном составе цилиндра материнской центриоли (Bystrevskaya et al., 1992). Учитывая эти данные и то, что при условиях, когда у людей развиваются сосудистые дисфункции (т.е. гиперхолистеринемии, диабете, гипертензии) в крови, пациентов обнаруживается повышенное содержание циркулирующего ФВ (Boneu et al, 1975; Blann et al, 1993,1997), кажется весьма актуальной задача изучения возможной роли цитоскелета в запасании и секреции тВП.
На настоящий момент известны две цитоскелетные системы для внутриклеточного транспорта — микротрубочко-зависимое передвижение органелл при помощи моторных белков и перемещение по актиновым филаментам (для обзора см. Rogers and Gelfand, 2000). Вовлечена ли какая-либо из этих систем в перемещение тВП от аппарата Гольджи к клеточной поверхности пока остается неизвестным, хотя показано, что разрушение МТ блокирует как образования тВП, так и их регулируемый экзоцитоз. Для того. чтобы, выявить возможную связь между распределением и направленным перемещением тВП и компонетами цитоскелета в эндотелиальных клетках мы использовали два подхода -изучали состояние цитоскелета во время индуцированного с помощью тромбина экзоцитоза тВП, а также проверяли, как цитоскелетные перестройки, вызванные с помощью повреждающих агентов, влияют на локализацию и перемещение тВП. Чтобы выяснить, вовлечена ли центросома эндотелиальных клеток в цитоскелет-опосредованный ответ на воздействие тромбина, мы также провели сравнение уровня посттрансляционных модификаций тубулина центриолярного цилиндра в эндотелиальных клетках до и после добавления тромбина.
